Article de méthode

Évaluation globale de l’efficacité et l’innocuité de la délivrance de médicaments ciblés Placenta en utilisant trois méthodes complémentaires

DOI :

10.3791/58219

⸱

10 septembre 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Reproductive Health, Institute of Biomedicine and Biotechnology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, 3Key Laboratory of Chemical Engineering Process and Technology for High-efficiency Conversion, College of Chemistry and Material Sciences, Heilongjiang University, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Wayne State University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs décrivent un système qui utilise trois méthodes pour évaluer l’innocuité et l’efficacité de l’administration de médicaments ciblés placenta : in vivo de l’imagerie pour surveiller l’accumulation de nanoparticules, échographie de haute fréquence pour surveiller le développement placentaire et foetal et de la CLHP pour quantifier les medicaments au tissu.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun des traitements efficaces n’existent actuellement pour les complications associées à placenta pendant la grossesse, et élaborer des stratégies visant l’administration ciblée des médicaments pour le placenta tout en minimisant les effets secondaires foetus et maternels reste difficile. NANOPARTICULES ciblées transporteurs offrent de nouvelles possibilités pour traiter les troubles placentaires. Nous avons récemment démontré qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) pourrait servir à orienter les nanoparticules pour libérer des médicaments le placenta. Dans ce protocole, nous décrivons en détail un système pour évaluer l’efficacité de la délivrance de médicaments pour le placenta par plCSA-BP qui emploie trois méthodes distinctes utilisées en combinaison : in vivo de l’imagerie, échographie de haute fréquence (HFUS) et haute performance chromatographie en phase liquide (HPLC). L’utilisation in vivo nanoparticules d’imagerie, plCSA-BP-guidé ont été visualisées dans les placentas d’animaux vivants, tandis que HFUS et HPLC ont démontré que le plCSA-BP-conjugué nanoparticules efficacement et précisément livré méthotrexate pour le placenta. Ainsi, une combinaison de ces méthodes peut servir comme un outil efficace pour l’administration ciblée des médicaments pour le placenta et le développement de nouvelles stratégies de traitement pour plusieurs complications de la grossesse.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Complications de la grossesse induite par le placenta, y compris la prééclampsie, perte fœtale, placentaire et petit âge gestationnel (SGA), sont communs et conduisent à l’importante morbidité maternelle et foetale et mortalité1,2, 3et très peu de médicaments ont fait leurs preuves pour être efficace pour traiter la grossesse troubles4,5. L’élaboration de stratégies pour la livraison de médicaments ciblés placenta plus sélectif et plus sécuritaire pendant la grossesse reste difficile en pharmacothérapie modernes.

Ces dernières années, plusieurs rapports ont mis l’accent sur l’administration ciblée des médicaments aux tissus utéro de nanoparticules de revêtement avec des peptides ou des anticorps comme outils axés sur le placenta. Ceux-ci incluent un facteur de croissance épidermique anti receptor (EGFR)6 anticorps, tumeur-homing peptides (CGKRK et iRGD)7, axés sur le placenta peptides8, peptides d’axés sur la vascularisation placentaire9 et anticorps contre le récepteurs de l’ocytocine10.

Ici, nous démontrons qu’un peptide synthétique placentaire chondroïtine sulfate A liaison (plCSA-BP) peut être utilisé pour l’administration ciblée de nanoparticules et leurs charges utiles de drogue avec le placenta11. Les nanoparticules plCSA-BP-guidées complètent l’utéro déclarée méthodes de ciblage parce qu’ils ciblent les trophoblastes placentaires.

Comme une méthode non invasive, l’imagerie in vivo a été utilisé pour contrôler l’expression des gènes spécifiques placenta en souris12et vert d’indocyanine (ICG) a été largement utilisé pour suivre les nanoparticules à l’aide de systèmes13, l’imagerie de fluorescence 14,15. Ainsi, nous avons injecté par voie intraveineuse des nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés avec ICG (plCSA-INPs) pour visualiser la distribution de plCSA-INP chez les souris enceintes avec un imageur de fluorescence. Nous avons ensuite injectée par voie intraveineuse méthotrexate (MTX)-chargé de plCSA-NPs dans souris gravides. Échographie de haute fréquence (HFUS), non invasive, l’autre en temps réel d’imagerie outil16,17 a été utilisé pour surveiller le développement foetal et placentaire chez les souris. Enfin, nous avons utilisé chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) pour quantifier la distribution MTX dans le placenta et le fœtus.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail le système de trois-méthode utilisé pour évaluer l’efficacité de la délivrance des médicaments ciblés placenta par nanocarriers plCSA-BP-guidé.

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Protocole

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Toutes les expériences de souris scrupuleusement les protocoles (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) approuvés par la protection des animaux et utilisation Comité de Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Académie chinoise des Sciences.

1. synthèse de nanoparticules de polymère lipidique A ciblé placentaire Sulfate de chondroïtine

  1. Synthétiser des nanoparticules de lipide-polymère MTX - et ICG-chargés (MNPs et INPs respectivement) et plCSA-BP-conjugué des nanoparticules (plCSA-MNPs et plCSA-INPs) comme décrit en détaillent ailleurs18.

2. in vivo d’imagerie par Fluorescence

  1. Préparation des souris enceintes
    1. Placer les femelles souris CD-1 (8-12 semaines) avec un mâle fertile de la même souche dans une cage (mâle : femelle = 1:2) dans l’après-midi et la vérification vaginale branche suit matin. Si on observe un plug vaginal, qualifier la souris embryonnaire jour 0.5 (E0.5).
    2. Souris enceintes maison seuls dans une chambre exempts de micro-organismes pathogènes animale avec un h de lumière/10 14 h obscurité cycle et donnent librement accès à la nourriture et l’eau jusqu'à E14.5.
  2. Injection intraveineuse de nanoparticules
    1. Avant l’intervention, stériliser les nanoparticules par filtration à travers un filtre de seringue 0,22 μm. Peser la souris enceinte à E11.5 pour déterminer la quantité et le volume d’injection de nanoparticules.
      Remarque : Le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieure à 1 % (poids/volume) du poids du corps de la souris enceinte. Par exemple, le volume d’injection de nanoparticules doit être inférieur à 0,25 mL chez une souris de 25 g.
    2. Pour dilater la veine caudale, chauffer la queue pendant 5-10 min avec un coussin chauffant.
    3. Avant l’injection, aspirer l’INPs ou plCSA-INPs dans une seringue à insuline 28 g.
    4. Transférer la souris enceinte à un dispositif de maintien qui retient la souris tout en permettant l’accès à la veine caudale. Nettoyer la queue avec un tampon imbibé d’alcool. Puis insérer la seringue dans la veine caudale. Injecter lentement l’INPs ou plCSA-INPs (équivalent ICG 5 mg/kg) avec une pression uniforme sur 5-10 s.
      Remarque : S’arrêter si une cloque apparaît sur la queue, car ce résultat indique que l’aiguille n’est pas dans la veine de l’injection. Seringues ne doivent pas être partagées entre les souris pour réduire au minimum la transmission de la maladie et la contamination croisée.
    5. Enregistrer le temps d’injection. Pendant ce temps, appliquez une légère pression sur le site d’injection jusqu'à l’arrêt du saignement, qui prend normalement de 30 à 60 s.
  3. Imagerie in vivo
    1. 30 min après l’injection, les souris enceintes utilisant la fluorescence in vivo , système d’imagerie d’image.
    2. Anesthésier les souris enceintes avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min et isoflurane à 2-4 % dans une enceinte associée de l’unité d’anesthésie et vérifier l’anesthésie complète de lents et une respiration régulière. Puis, les déplacer dans la chambre d’imagerie. Placez les souris enceintes anesthésiés dans la chambre d’imagerie, de garder les animaux en position couchée.
    3. Placez un cône de nez sur la bouche et le nez pour permettre à l’inhalation de 1 à 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min pour maintenir l’anesthésie.
    4. Sélectionnez Paramètres 2D-fluorescence et photographiques afin d’imager les signaux de fluorescence ICG. Régler l’exposition auto et les longueurs d’onde d’excitation/émission de 710/820 nm.
    5. À la fin de la procédure d’imagerie, éteignez l’afflux d’isoflurane pour arrêter l’anesthésie et les souris enceintes soigneusement regagner leur cage.
    6. 48 h après l’injection de nanoparticules, anesthésier les souris enceintes avec isofluorane et puis sacrifier le barrage par dislocation cervicale. Ramassez les foetus et les placentas avec une pincette de Graefe, Graefe forceps de tissue et ciseaux de dissection.
    7. Placer le placenta et le fœtus dans la chambre d’imagerie et l’image à l’aide de la méthode décrite à l’étape 2.3.4.

3. HFUS évaluation du développement embryonnaire

  1. Modèles animaux
    1. Obtenir et préparer les souris enceintes comme indiqué au point 2.1.
    2. Utilisez HFUS à des souris enceintes image à 6,5 E (protocoles 3.2 et 3.3.3). Tout d’abord, confirmer la grossesse en visualisant les embryons jour E6.5 et puis au hasard d’allouer les souris enceintes en trois groupes : le groupe MNP, MNP-plCSA groupe et groupe de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    3. Injecter le PBS, MNPs ou plCSA-MNPs (1 mg/kg équivalent MTX) dans les veines de la queue des souris enceintes tous les deux jours à partir de E6.5 comme indiqué au point 2.2.
  2. Préparation pour l’imagerie
    1. 24 h après l’injection de nanoparticules, image les souris enceintes à l’aide de la HFUS système d’imagerie.
    2. Anesthésier les souris enceintes comme indiqué au point 2.3.2. Activer les contrôles de température intégré de la plate-forme d’imagerie et de préchauffer la plate-forme à 37 et 42 ° C. Fixez les souris enceintes dans une position en décubitus dorsal sur la plate-forme à l’aide de ruban adhésif.
    3. Place du cône de nez connecté à l’appareil d’anesthésie sur le museau. Appliquer 2 % isoflurane avec un débit d’oxygène de 1,0 L/min à maintenir stable anesthésie.
    4. Enlever les poils de l’abdomen à l’aide d’une crème dépilatoire chimiquement. Effacer la crème résiduelle soigneusement avec de la gaze imbibée d’eau et ensuite enduire acoustique gel de couplage de l’abdomen.
  3. Procédure d’imagerie
    1. Placer le transducteur de 40 MHz dans le bras mécanique.
    2. Ajustez la position du transducteur pour obtenir des images longitudinales du fœtus et du placenta avec la région d’intérêt situé dans la zone focale.
    3. Analyse et imagerie en Mode B
      Remarque : Voir film 1.
      1. Cliquez sur le bouton Mode B et baisser le transducteur sur l’abdomen jusqu'à ce que le fœtus et le placenta entreront en vue. Appuyez sur Scan/gel pour lancer/arrêter d’imagerie, appuyez sur Cine stocker pour stocker la boucle ciné et appuyez sur trame de stocker pour stocker des images de trame.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour analyser la longueur sac gestationnel (GS), longueur de croupe Couronne foetale (CRL), diamètre biparietal (BPD), circonférence abdominale (AC), diamètre placentaire (DP) et l’épaisseur placentaire (PT).
    4. Analyse et imagerie Doppler-PW
      Remarque : Voir film 1.
      1. En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton PW , placez la zone de volume d’échantillonnage dans le centre de l’artère ombilicale et appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie. Cliquez sur Cine stocker afin de recueillir des images de l’artère ombilicale.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer la vitesse de pointe de l’artère ombilicale (UA).
    5. Analyse et imagerie en mode Doppler couleur
      1. En utilisant le même scan projection, cliquez sur le bouton de couleur et ajuster la position du transducteur pour obtenir des images du coeur foetal. Appuyez sur Scan/gel pour initier l’imagerie et Cine stocker pour recueillir des images.
      2. Cliquez sur le bouton de mesure pour calculer le rythme cardiaque fœtal (HR).

4. analyse par CLHP

  1. Préparation du tissu
    1. Injecter les souris enceintes avec une dose unique de MNPs ou plCSA-MNPs (équivalent MTX 1 mg/kg) à la fin de grossesse (par exemple., E14.5) comme indiqué au point 3.1.3.
    2. Après 24h, anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale d’avertin à 240 μg/poids (g). S’assurer que pas de réponse à une pincée de pied pour vérifier que les souris sont complètement anesthésiés.
    3. Vaporiser la région de la poitrine avec 75 % d’éthanol. Effectuer la perfusion cardiaque (couper les oreillettes droites et perfuse par le ventricule gauche) comme décrit dans le détail19,20 avec 50 mL de sérum physiologique 0,9 % glacée pendant 10 min enlever des nanoparticules non liés.
    4. Euthanasier le barrage. Faire une césarienne pour collecter le foetus et le placenta avec une pincette de Graefe, disséquant les ciseaux et pinces à tissus Graefe et stocker les tissus à-80 ° C avant l’analyse.
    5. Préparer la solution d’homogénéisation (10 % d’acide perchlorique) et continuer sur la glace. Recueillir environ 200 mg de tissu et ajouter 500 μl de solution d’homogénéisation à chaque échantillon. Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un homogénéisateur à pleine vitesse pour 30 s et répéter cette procédure deux fois.
    6. Centrifuger les échantillons à 14 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Filtrer le surnageant (environ 300 μL) à travers un filtre de 0,45 μm de seringue et transférer le liquide obtenu dans un flacon HPLC. Placer les flacons d’échantillon dans un bac d’échantillonneur automatique pour injection.
  2. Élaboration de normes
    1. Préparer la solution suivante pour la phase mobile : acétonitrile (88:12, v/v) et 40 mM potassium phosphate dibasique (pH 4,5). Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de taille de pore 0,45 μm et transférer le liquide obtenu dans une bouteille propre de réservoir HPLC.
      Remarque : Ajuster le pH à 0,1 M d’acide phosphorique. Utiliser la vibration ultrasonique pendant 15 min pour dégazer la phase mobile chaque fois avant d’utiliser.
    2. Peser 10 mg du MTX dans un tube à centrifuger 1,5 mL. Ajouter 1 mL d’hydroxyde de sodium 1 M.
    3. Vortex à grande vitesse jusqu'à ce que le MTX se dissout complètement.
      Note : Ceci est l’étalon primaire et peut être conservé à-20 ° C pendant plusieurs mois.
    4. Pour créer l’étalon secondaire de MTX (500 μg/mL), diluer 50 μL de l’étalon primaire de 950 μL de la phase mobile.
      Remarque : Conserver sur la glace jusqu'à l’utilisation et de préparer les frais du jour. Il est important d’utiliser la phase mobile pour l’élaboration de normes afin d’éviter les pics résultant du mélange des solutions dissemblables après injection de l’échantillon.
    5. Apporter de nouvelles dilutions pour créer les normes (tableau 1). Stocker les normes sur la glace et préparer les frais du jour. Exécuter les normes en série avec les échantillons expérimentaux.
NombreConcentration finale (μg/mL)500 μg/mL norme μLPhase(μL) mobile
10,51999
212998
32.55995
41020980
52550950
650100900
7100200800

Tableau 1. Préparation de la courbe d’étalonnage pour MTX. La concentration finale de solution étalon de MTX est de 0,5 à 100 μg/mL.

  1. Instrumentation HPLC et paramètres d’opération
    Remarque : Les échantillons ont été analysés sur un système HPLC équipé d’une pompe solvant, un détecteur par spectrophotométrie UV (313 nm) et une colonne C18 (250 × 4.6 mm, taille des particules 5 μm).
    1. Allumez le dégazeur HPLC pour chasser l’air du système. Tournez le flux, l’équilibration de la colonne avec la phase mobile pendant 30 min réduire le bruit de la ligne de base.
    2. Régler la température de la colonne à 25 ° C, injecter 20 volumes d’échantillon μL à un débit de 1 mL/min, puis cliquez sur la Méthode Run pour démarrer l’analyse.
    3. Lorsque les essais sont terminés, modifier manuellement la phase mobile d’acétonitrile qualité HPLC. Fonctionner pendant environ 15 min protéger le système.
      Remarque : Pour effectuer cette étape suivant la durée recommandée peut entraîner des dommages à la colonne.
    4. Pour une analyse quantitative, calculer les aires sous les pics MTX standards d’intérêt en utilisant le logiciel de système de CLHP.

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Résultats

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Dans ce manuscrit, les nanoparticules plCSA-BP-conjugué chargés de MTX (plCSA-MNPs) ou GIC (plCSA-INPs) ont été par voie intraveineuse injectées à des souris enceintes. In vivo de l’imagerie a révélé des signaux forts de ICG dans la région de l’utérus 30 min après l’injection de plCSA-INP. L’INPs ont été essentiellement localisés dans la région du foie et la rate (Figure 1 a). 48 h après l’injection de plCSA-INP, souris gravides ont été sacrifiés, ré...

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Discussion

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Dans ce manuscrit, nous décrivent un système de trois-méthode pour déterminer si les nanoparticules plCSA-BP-guidées sont un outil efficace pour cibler l’administration de médicaments pour le placenta. L’utilisationdes in vivo de l’imagerie pour surveiller le signal infrarouge de ICG fluorescent a confirmé la spécificité ciblage placentaire de plCSA-BP. Using HFUS et HPLC, nous avons démontré que plCSA-BP-conjugué des nanoparticules peuvent délivrer efficacement MTX uniquement à la cellules du placenta, pas pour...

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Déclarations de divulgation

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X.F. et B.Z. sont inventeurs sur la demande de brevet PCT/CN2017/108646 soumis par SIAT qui couvre une méthode de livraison de médicaments spécifiques placenta et son application. Tous les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des Sciences naturelles (81771617) et les sciences naturelles Fondation la Province du Guangdong (2016A030313178) attribué à X.F. ; une subvention provenant du Fonds de recherche fondamentale Shenzhen (JCYJ20170413165233512) attribué à X.F ; Développement humain de la National Institutes of Health, sous attribution numéro R01HD088549 et Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health (le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement l’officiel vues de la National Institutes of Health) à N.N.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CD-1 sourisBeijing Vital River201Femelle (8-12 semaines)
Seringue à insulineBD328421pour injection IV
Absolud’éthanol Sinopharm 10009218 chimiquepour la synthèse de nanoparticules
Lécithine de sojaAvanti Polar Lipids441601pour la synthèse de nanoparticules
DSPE-PEG-COOHAvanti Polar Lipids880125pour la synthèse de nanoparticules
PLGASigma-Aldrich719897pour la synthèse de nanoparticules
Processeur à ultrasonsSonicsVCX130pour la synthèse de nanoparticules
Méthotrexate (MTX)Sigma-AldrichV900324pour la synthèse de nanoparticules
Vert d’indocyanine (ICG)Sigma-Aldrich1340009pour in vivo imagerie
saline tamponnée au phosphate (PBS)HycloneSH30028.01
IVIS instrument de spectrePerkin Elmerpour l’imagerie in vivo
Gel de transmission d’ultrasonsGuanggongZC4252418pour l’imagerie par ultrasons
IsofluraneLunan PharmaceuticalI0040pour maintenir l’anesthésie
Crème dépilatoireNairTMG001pour l’enlèvement de la fourrure
Transducteur 40 MHzVisualSonicsMS550Spour l’imagerie par
ultrasons Système d’imagerie par ultrasons à haute fréquenceVisualSonicsVevo2100pour l’imagerie par ultrasons
AvertinSigma-AldrichT48402pour l’anesthésie Pompe
seringueMindraySK-500IIIpour perfusion cardiaque
solution saline à 0,9 %MeilunbioMA0083pour perfusion cardiaque
Tubes en polypropylène 1,5 mLAXYGENMCT-150-C-80
° ; C congélateurThermo Fisher Scientific88600V
CentrigugeCenceH1650R
Acide perchloriqueSigma-Aldrich311421pour précipiter les protéines
HomogénéisateurSCIENTZSCIENTZ-48pour l’homogénéisation des tissus
Filtre à seringue (0,45 &mu ; m)MilliporeSLHV033RS01
Hydroxyde de sodiumSinopharm 10019763 chimiquepour résoudre
les flacons MTX HPLCEaux670650620pour HPLC
Phosphate de potassium dibasiqueSinopharm Chemical20032117pour HPLC
AcétonitrileJK 932537 chimiquepour HPLC
C18 colonneEaux186003966pour HPLC
Système HPLCShimadzupour HPLC
à

Références

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