Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Anna M. Chiarella; Tiffany A. Wang; Kyle V. Butler; Jian Jin; Nathaniel A. Hathaway

doi:10.3791/58222

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Article de méthode

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

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DOI :

10.3791/58222

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20 septembre 2018

Anna M. Chiarella¹ , Tiffany A. Wang² , Kyle V. Butler³ , Jian Jin³ , Nathaniel A. Hathaway⁴

¹Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina, ²College of Arts and Sciences, Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, University of North Carolina, ³Chemical Biology and Drug Discovery, Pharmacological Sciences and Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, ⁴Chemical Biology and Medicinal Chemistry, Center for Integrative Chemical Biology and Drug Discovery, Curriculum in Genetics and Molecular Biology, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina

Dans cet article

Résumé

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Résumé

Régulation de la compaction de la chromatine est un processus important qui régit l’expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. Bien que la compaction de la chromatine et la régulation de l’expression génique sont souvent perturbés dans de nombreuses maladies, une méthode spécifiques d’un locus, endogène et réversible pour étudier et contrôler ces mécanismes d’action a fait défaut. Pour résoudre ce problème, nous avons développé et caractérisé les nouvelles molécules bifonctionnelles régulation génique. Un composant de la molécule bifonctionnel se lie à un point d’ancrage de l’ADN-protéines afin qu’il sera recruté à un locus de l’allèle spécifique. L’autre composante engage les endogène machinerie modifiant la chromatine cellulaire, recrutement de ces protéines à un gène d’intérêt. Ces petites molécules, appelées modificateurs chimiques d’épigénétiques (CEMs), sont capables de contrôler l’expression des gènes et l’environnement de la chromatine de façon dose-dépendante et réversible. Nous détaillons ici, une approche CEM et sa demande visant à diminuer l’expression génique et l’acétylation des histones queue à un journaliste de la protéine fluorescente verte (GFP) situé sur le locus Oct4 dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). Nous caractérisons les devants CEM (CEM23) à l’aide de la microscopie de fluorescence, cytométrie en flux et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), suivie d’une PCR quantitative (qPCR). Bien que la puissance de ce système est démontrée au locus Oct4 , sur le plan conceptuel, la technologie CEM est modulaire et peut être appliquée dans d’autres types cellulaires et autres locus génomiques.

Introduction

La chromatine est composée d’ADN enroulé autour des octamère d’histones qui forment la particule nucleosome de noyau. Régulation de la compaction de la chromatine est un mécanisme essentiel pour bon ADN réparation, réplication et expression¹^,²^,³. Une façon dans lequel les cellules contrôlent le niveau de compactage est par le biais de l’ajout ou la suppression de diverses modifications de queue post-traductionnelles histone. Deux adaptations incluent l’acétylation lysine (1), qui est plus communément associée à l’activation de gènes, et la méthylation de la lysine (2), qui pe....