Article de méthode

Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines

DOI :

10.3791/58237

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14 juin 2018

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1Center for Childhood Cancer and Blood Disease, Nationwide Children's Hospital, 2Nuffield Division of Clinical Laboratory Sciences, Radcliffe Department of Medicine, University of Oxford, 3Center for Clinical and Translational Research, Nationwide Children's Hospital Research Institute

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Résumé

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CRISPR/Cas9 technologie s’accélère génie de génome dans plusieurs types de cellules, mais jusqu'à présent, livraison de gène et gène stable modification ont été difficiles dans les cellules NK primaires. Par exemple, livraison de transgene en utilisant des gènes ou retroviral transduction a entraîné un rendement limité de cellules NK par génie génétique en raison de l’apoptose des cellules NK associée à procédure substantiel. Nous décrivons ici une méthode sans ADN pour l’édition de génome de cellules NK primaires et élargis humaines utilisant des complexes ribonucléoprotéiques Cas9 (Cas9/RNP). Cette méthode a permis knockout efficace des TGFBR2 et HPRT1 de gènes dans les cellules NK. Les données de RT-PCR ont montré une diminution significative du niveau d’expression de gène, et un essai de cytotoxicité d’un produit de cellules représentant a suggéré que les cellules NK RNP modifiés sont devenus moins sensibles aux TGFβ. Des cellules génétiquement modifiées pourraient être élargi post-électroporation de stimulation avec irradiés mbIL21 exprimant des cellules nourricières.

Introduction

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Immunothérapie contre le cancer a progressé ces dernières années. Les cellules de T de récepteurs (voiture) antigène chimérique génétiquement modifiés sont un excellent exemple de cellules immunitaires machinés, déployé en immunothérapie contre le cancer. Ces cellules ont été récemment approuvés par la FDA pour le traitement contre CD19 + B des cellules malignes, mais succès a été jusqu'à présent limitée aux maladies portant quelques antigènes targetable et ciblant ces répertoires antigéniques limitées est sujette à l’échec par évasion immunitaire. En outre, les cellules T de voiture ont surtout portés sur l’utilisation de cellules autologues de T en raison du risque de greffe - versus - host disease causée par les cellules T allogéniques. En revanche, les cellules NK sont capables de tuer des cibles tumorales de manière indépendante de l’antigène et n’entraînent pas de greffon contre l’hôte, qui en fait un bon candidat pour le cancer immunotherapy6,7,8,9.

CRISPR/Cas9 technologie a été utilisée récemment en ingénierie des cellules immunitaires, mais génétiquement la reprogrammation des cellules NK avec des plasmides a toujours été difficile. Cela a été en raison de difficultés dans la livraison du transgène dans une manière dépendante de l’ADN telles que des gènes et retroviral transduction provoquant l’apoptose des cellules NK associée à procédure substantiel et la production limitée de génétiquement modifié NK cellules4 , 9.

Nombreuses cellules immunitaires innées expriment des niveaux élevés des récepteurs des profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés tels que gène inductible par l’acide rétinoïque j’ai (RIG-I), qui permettent une reconnaissance accrue de l’ADN étranger. Suppression de ces voies a permis une plus grande efficacité de transduction dans les cellules NK lors de l’utilisation de méthodes basées sur l’ADN pour la modification génétique10.

Nous décrivons ici la méthode d’utilisation d’un montage de génome sans ADN des cellules NK humains utilisant des complexes ribonucléoprotéiques de Cas9 (Cas9/RNP) primaires et élargis. Cas9/RNP est composé de trois éléments, recombinant Cas9 protéine complexé avec ARN simple-guide synthétique comprenant un complexé crRNA et tracerRNA. Ces Cas9/RNP sont capables de clivage des cibles génomiques à rendement élevé par rapport aux approches d’ADN-dépendante étrangers en raison de leur livraison sous forme de complexes fonctionnels. En outre, une clairance rapide de Cas9/RNP des cellules peut réduire les effets hors cible, tels que l’induction de l’apoptose. Ainsi, ils peuvent servir à générer des débouchures ou knock-ins lorsqu’il est combiné avec l’ADN de recombinaison homologue6,7. Nous avons montré qu’électroporation de Cas9/RNP est une méthode simple et relativement efficace qui permet de surmonter les contraintes précédentes de modification génétique dans les cellules NK.

TGFβ est une cytokine immunosuppressive importante, qui inhibe l’activation et les fonctions des cellules NK. Il a été suggéré que ciblant la voie de TGFβ peut augmenter les fonctions des cellules immunitaires. Nous avons ciblé la région codant ectodomaine TGBR2 qui lie le TGFβ11. Les résultats représentatifs montrent une diminution significative du niveau d’expression de l’ARNm du gène et ailleurs démontrent que les cellules NK modifiés deviennent résistantes aux TGFβ. En outre, les cellules modifiées maintenir la viabilité et le potentiel prolifératif, qu’ils sont capables d’être élargi post-électroporation utilisant des cellules irradiées chargeur. Par conséquent, la méthode suivante est une approche prometteuse pour manipuler génétiquement des cellules NK pour tout autres cliniques ou des fins de recherche.

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Protocole

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Manteaux de buffy donneur sain ont été obtenues comme matériel de base de la Central Ohio région Croix Rouge américaine. Cette recherche a été jugée recherche exonéré par l’institutionnel Review Board de dans tout le pays hôpital pour enfants.

1. expansion et Purification de cellules NK humaines

  1. Isoler les PBMC du12de la couche leuco-plaquettaire.
    1. 35 mL d’échantillon de la couche leuco-plaquettaire sur 15 mL de Ficoll-Paque de couche.
    2. Centrifuger à 400 x g pendant 20 minutes sans frein et recueillir le PBMC de l’interface.
    3. Laver les PBMC récupérés trois fois en ajoutant au moins un volume égal de PBS, centrifugation à 400 x g pendant 5 minutes et en aspirant le PBC se lavent. Les cellules NK peuvent être isolés à ce stade par RosettesSep13.
  2. Développez les cellules NK en stimulant avec irradiés 10 x 106 mbIL21 exprimant des cellules nourricières à 0, 7 et 14 jours. Remplacer le support avec frais RPMI contenant 10 % BF, 1 % Glutamine, 1 % pénicilline streptomycine et 100 UI/mL d’il-2 pour le volume entier médias tous les deux jours.

2. gRNA conception et sélection

  1. Choisissez les locus génomiques spécifiques pour cibler, à l’aide des outils en ligne, par exemple, NCBI, Ensemble.
    Par exemple.
    Description : Transformation de récepteur de facteur de croissance bêta 2 (TGFBRR2) ectodomaine
    Afficher enregistrement : PF08917
    Découvre InterPro : IPR015013
    Position : 49-157 aa
    Séquence ciblée : Exon 4 du gène TGFBR2 (ENSG00000163513)
  2. Pour concevoir le gRNAs, utilisez CRISPR conception web outils tels que http://crispr.mit.edu et « Benchling ».
    1. Entrez dans la séquence d’ADN choisie à l’étape 2.1. Choisissez un génome cible homme (hg 19). Guides CRISPR (20 nucléotides suivie d’une séquence de PAM : NGG) seront analysés de la séquence enregistrée plus tôt. Il montre également les correspondances possibles hors cible dans tout le génome sélectionné.
    2. Choisir les meilleurs trois gRNAs ayant le score le plus élevé, selon leur taux sur la cible et la cible. Par exemple, le tableau 1 montre le RNAs CRISPR conçu pour cibler l’exon 4 du gène TGFBR2 suggérée par les outils de web design CRISPR.
  3. Commander le RNAs CRISPR comme synthétique crRNAs de séquence-spécifique.
  4. Commander un conservée, transactivating RNA (tracrRNA) pour interagir par le biais de l’homologie partielle avec le crRNA.

3. conception suppression des amorces de dépistage

  1. Conception des amorces couvrant les sites de clivage gRNA pour test de mutation de T7E1.
  2. Utilisation des amorces au moins 100 bp loin du site de clivage prévus pour assurer la petite insertion / délétion (indels) sur le site de cible sgRNA apparaîtra sur gel d’agarose de 1,5 % après le test de mutation. Le tableau 2 montre les amorces qui sont utilisées pour amplifier l’ectodomaine TGFBR2.

4. transduction des cellules humaines NK primaire et élargi

Remarque : Transduction de Cas9/RNP éléments dans NK se faite par électroporation System.* 4D comme suit.

  1. Cellule Préparation
    1. Pour les cellules NK primaires, incuber les cellules NK fraîchement isolées dans un milieu RPMI en présence de 100 UI/mL d’il-2 pendant 4 jours et effectuer l’électroporation au jour 5. Remplacer les médias tous les jours tel que décrit plus tôt et la veille de la transduction.
    2. Pour les cellules NK élargis, stimuler les cellules au jour 0 avec cellules irradiées mangeoire à un ratio de 1:1 et effectuer l’électroporation au jour 5 ou 6 ou 7. Remplacer les médias tous les jours tel que décrit plus tôt et la veille de la transduction.
    3. Le jour de l’électroporation, préparer une fiole T25 contenant 8 mL de RPMI frais contenant 100 UI/mL d’il-2 pour cellules subissant l’électroporation et pré incubate flacons dans une étuve2 CO 37 ° C et 5 % humidifiée.
      Remarque : Cellules dégelées ou les cellules qui ont subi une 2ème ou 3rd stimulation peuvent être électroporés à tout moment après leur récupération comme décrit.
    4. Prendre 3-4 × 106 cellules / condition pour 26 µL du mélange de transduction.
      Remarque : Très forte concentration des cellules NK dans électroporation solution augmente la vitesse de transduction.
    5. Laver les cellules 3 fois avec du PBS pour enlever tous les BF, qui contient généralement l’activité RNase. Tourner à chaque fois à 300 x g pendant 8 minutes.
      Remarque : Examiner les 7 conditions d’électroporation pour Cas/RNP comme unique gRNA (gRNA1, gRNA2, gRNA3) et une combinaison de deux gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3) et un contrôle avec aucun Cas9/RNP.
  2. Former les crRNA:tracerRNA / complexe
    1. Resuspendre le crRNAs (gRNA1, gRNA2 et gRNA3) et tracerRNA dans 1 x solution TE à la concentration finale de 200 μM. 2.2 Mix μL de chaque gRNA 200 μM avec 200 μM tracerRNA comme indiqué dans le tableau 3.
    2. Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur le comptoir à la température ambiante (15-25 ° C). Magasin resuspendues RNAs et crRNA : tracerRNA/complexe à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
  3. Former le complexe RNP
    Remarque :     pour gagner du temps, forment le RNP complexe pendant le lavage étape 4.1.5.
    1. Pour crRNA:tracrRNA seule réaction recto verso, diluer Cas9 endonucléase à 36 μM, comme le montre l’exemple au tableau 4.
    2. Pour la transduction de la combinaison de crRNA:tracrRNA duplex, diluer Cas9 endonucléase à 36 μM comme le montre l’exemple en tableau 5.
    3. Ajouter Cas9 endonucléase à crRNA:tracrRNA duplex lentement tout en agitant l’embout de la pipette, plus de 30 s à 1 minute.
    4. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15-20 min. Si pas prêt à utiliser le mélange après l’incubation, gardez le mélange sur la glace jusqu'à l’utilisation.
  4. Électroporation
    1. Ajouter le supplément ensemble à la solution d’électroporation P3 et gardez-le à température ambiante.
    2. Resuspendre le culot cellulaire (3-4 × 106 cellules de l’étape 4.1.5) dans 20 μL de solution d’électroporation P3 primaire 4D. Éviter les bulles d’air lors de pipetage.
      Remarque: les cellules ne doivent pas être laissés pendant une longue période en solution P3.
    3. Ajoutez immédiatement 5 µL de RNP complexe (étape 4.3) à la suspension cellulaire.
    4. Ajouter le mélange 1 μL de rehausseur de l’électroporation Cas9 de 100 μM à la Cas9/RNP/cellule.
    5. Transfert mix Cas9/RNP/cellule en 20 μL électroporation lanières.
    6. Tapotez doucement les lanières pour s’assurer que l’échantillon couvre le fond des bandes.
    7. Démarrer le système d’électroporation de 4D et choisir le programme EN-138 .

5. poster Transduction

  1. Laisser les cellules reposer pendant 3 minutes dans les bandes.
  2. Ajouter 80 µL des milieux de culture pré équilibré dans la cuvette et transférer doucement l’échantillon dans les fioles.
  3. 48 heures après la transduction, extraire l’ADN génomique de 5 × 105 cellules pour les suppressions de gène de dépistage.
  4. Amplifier le gène d’intérêt en utilisant les amorces conçues à l’étape 3.2 avec les kits de Taq DNA polymérase.
  5. Former hétéroduplex amplicon PCR pour T7EI la digestion et incuber le produit pendant 30 à 60 minutes avec une enzyme T7EI à 37 ° C.
    Remarque : La T7EI test est préféré pour la présélection car il est rapide, simple et fournit nettoyer résultats de l’électrophorèse par rapport à l’utilisation de dosage de l’arpenteur. Toutefois, cette méthode ne peut pas détecter les insertions et les suppressions de < 2 bases qui sont générés par la fin non homologue se joindre à l’activité (NHEJ) en Cas9 RNP expériences14.
  6. Exécuter l’ADN digéré sur 1,5 % de gel d’agarose à 110 V pendant 30-45 minutes, toutes les 15 minutes visualiser le gel.
  7. Stimuler le reste des cellules avec le mbIL21 exprimant des cellules nourricières à un ratio de 1:1.
  8. Cinq jours après la stimulation extraire l’ARN pour niveau d’expression de gène à l’aide de qPCR.
  9. Tests de calcéine conduite comme indiqué précédemment12. En bref, charger les cellules cibles avec calcéine AM (dans l’exemple illustré, 3 µg/mL/1 000 000 cellules DAOY a été utilisé). Préparer les cellules NK pour analyses de cytotoxicité de se reposer pendant la nuit dans IL2 (100 UI/mL) plus ou moins 10 ng/mL soluble TGFβ. Mener des analyses de calcéine dans les cytokines mêmes comme les cellules NK ont reposé dans la nuit.

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Résultats

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Efficacité d’électroporation

Pour optimiser l’électroporation de Cas9/RNP, nous avons testé 16 programmes différents avec transduction de GFP ne pointeraient siRNA et plasmides d’ADN dans les cellules NK. Dosage de cytométrie en flux ont montré que le fr-138 le plus fort pourcentage de viabilité et transduction efficacité des cellules (35 % GFP positive des cellules vivantes) pour les deux particules (

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Discussion

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Modification de l’ADN-dépendante des cellules NK a été difficile de4,9. Nous, donc, introduit directement un complexe synthétique préformé ribonucléoprotéines (RNP) et Cas9 protéine comme la protéine purifiée dans primaire et élargi de cellules NK8. Cette méthode nous a permis d’éliminer le plafonnement, équeutage, et autres processus de transcriptionnelles et translationnelles a commencé par l’ARN polymérase II, ce qui peut provoquer l’ap...

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Déclarations de divulgation

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DAL sert/a servi comme consultant pour Courier Therapeutics, Obsidian Therapeutics, Intellia Therapeutics, Merck Research Laboratories et Miltenyi Biotec et a équité/Leadership en CytoSen thérapeutique.

Remerciements

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Nous reconnaissons Brian Tullius pour son aide dans l’édition du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
RosetteSep&commerce ; Cocktail d’enrichissement des cellules NK humainesSTEMCELL Technologies15065La RosetteSep&trade ; Le cocktail d’enrichissement en cellules NK humaines est conçu pour isoler les cellules NK du sang total par sélection négative.
Ficoll-Paque® ; PLUSGE Healthcare - Sciences de la vie17-1440-02
Alt-R® ; Lestechnologies intégrées d’ADN1072532TracrRNA qui contient des modifications chimiques exclusives conférant une résistance accrue aux nucléases. S’hybride en ARNcr pour activer l’enzyme Cas9
Alt-R® ; CRISPR-Cas9 crRNA IntegratedDNA TechnologiesProduit synthétiquement sous forme de Alt-R® ; L’ARNcr CRISPR-Cas9, basé sur la séquence de l’ARNg conçu ciblant le gène de l’intérêt
Alt-R® ; Technologiesd’ADN intégrées1075931Chaque kit contient des commandes d’endonucléase T7EI, de tampon de réaction T7EI et de contrôle de test T7EI.
Platine® ; Taq ADN polymérase haute fidélitéInvitrogen11304-011
4D-Nucleofector&commerce ; SystèmeLonzaAAF-1002B
Protéine IL-2 recombinante humaineNovartis65483-0116-07
P3 Cellule primaire 4D-Nucleofector&trade ; X KitLonzaV4XP-3032Contient pmaxGFP&trade ; Vecteur, Nucleofector&Trade ; Solution, Supplément, Nucléocuvette 16 puits&Trade ; Bandelettes
non ciblées : siRNA personnalisé, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplusDharmaconCTM-360019
Alt-R® ; S.p. Cas9 Nucléase 3NLSIntegrated DNA Technologies1074181Cas9 Nucléase
DNeasy® ; Sang & Manuel des tissusQiagen69504
RNeasy Mini KitQiagen74104
Calcein AMThermoFisherC3099
TGF&beta ;Biolegend580706
Alt-R® ; Kit de contrôle CRISPR-Cas9,technologies d’ADN humain intégrées1072554Comprend l’ARNtracr, l’ARNcr à contrôle positif HPRT, l’ARNcr#1 à contrôle négatif, le mélange d’amorces HPRT et le tampon duplex sans nucléase.
IDTE pH 7.5 (solution 1X TE)Technologies d’ADN intégrées11-01-02-02
Alt-R® ; Amplificateur d’électroporationCas9 Technologies d’ADN intégrées1075915Amplificateur d’électroporation Cas9
CRISPR-Cas9 tracrRNA

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

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