Article de méthode

Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

DOI :

10.3791/58239

⸱

25 août 2018

 , 
1Department of Biology, San Francisco State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces dernières décennies, maladies à transmission vectorielle ont réapparu et a progressé à inquiétante, entraînant une morbidité et mortalité dans le monde entier. Des vaccins efficaces et accessibles font défaut pour la majorité de ces maladies, ce qui a nécessité l’élaboration de stratégies d’atténuation nouvelle maladie. À cette fin, une avenue prometteuse de lutte contre les maladies consiste à cibler le microbiome du vecteur, la communauté de microbes vivant dans le vecteur. Le microbiome vecteur joue un rôle central dans la dynamique de l’agent pathogène, et manipulations de la microbiome ont conduit pour vecteur réduit la transmission pathogène ou d’abondance à une poignée de maladies à transmission vectorielle. Cependant, traduisant ces constatations dans les applications de contrôle de la maladie nécessite une compréhension approfondie de l’écologie microbienne de vecteur, historiquement limité par la technologie insuffisante dans ce domaine. L’avènement des approches de séquençage de nouvelle génération a permis un séquençage rapid et hautement parallèle des diverses communautés microbiennes. Ciblant le gène de l’ARNr 16 s hautement conservée a facilité les caractérisations des microbes présents dans les vecteurs sous diverses conditions expérimentales et écologiques. Cette technique implique l’amplification du gène de l’ARNr 16 s, échantillon barcoding par PCR, échantillons de chargement sur une cellule d’écoulement pour le séquençage, et bioinformatique s’approche pour faire correspondre les données de séquences avec information phylogénétique. Espèces ou identification de genre-niveau pour un grand nombre de répétitions en général peut être atteint que grâce à cette approche, contournant ainsi les défis de détection faible résolution et de la sortie de la culture traditionnelle, microscopie ou coloration histologique techniques. Par conséquent, cette méthode est bien adaptée pour caractériser le vecteur de microbes dans des conditions diverses, mais ne peut actuellement fournir des informations sur la fonction microbienne, l’emplacement au sein du vecteur, ou la réponse au traitement antibiotique. Dans l’ensemble, le séquençage de prochaine génération 16 s est une technique puissante pour mieux comprendre l’identité et le rôle des microbes vecteurs dans la dynamique de la maladie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La résurgence et la propagation de maladies à transmission vectorielle dans les dernières décennies posent une menace sérieuse pour la santé humaine et de la faune mondiale. Des vaccins efficaces font défaut pour la majorité de ces maladies, et contrôle efforts sont entravés par la complexité biologique des vecteurs et des interactions hôte-vecteur. Comprendre le rôle des interactions microbiennes dans un vecteur de transmission d’agents pathogènes peut prévoir l’élaboration de stratégies novatrices qui contourner ces difficultés. En particulier, les interactions entre associés à vecteur microbienne commensaux, symbiotes et les agents pathogènes, dénommés le microbiome, peuvent avoir des conséquences importantes pour la transmission d’agents pathogènes. Des preuves accablantes maintenant prend en charge cette affirmation, avec des exemples démontrant un lien entre le vecteur microbiome et la compétence pour des maladies comme le paludisme, le virus Zika et maladie de Lyme1,2,3. Cependant, traduisant ces constatations dans les stratégies de contrôle des maladies exige une compréhension beaucoup plus détaillée de la structure, fonction et l’origine du vecteur microbiomes. Identification et caractérisation de la communauté microbienne de vecteur sous diverses conditions expérimentales et écologiques constituent une voie importante vers l’avant dans ce domaine.

Une procédure d’identification des résidents microbiennes d’un vecteur pathogène est fournie ici en utilisant la Western Mouette tique, Ixodes pacificus, une espèce de vecteur de l’agent pathogène de la maladie de Lyme Borrelia burgdorferi. Alors que les tiques hébergent plus de types de pathogènes humains que n’importe quel autre arthropode, relativement on connaît l’écologie Biologie et de la communauté des tiques microbiomes4. Il est évident que les tiques abritent une grande diversité des virus, bactéries, champignons et protozoaires incluent des commensaux, endosymbiontes et résidents microbienne transitoire5,4. Travail préalable a démontré de fortes variations dans les microbiomes Ixodes associées à la géographie, espèce, sexe, stade de vie et la farine de sang source6,7,8. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent ces variations restent inconnues et garantissent plus d’enquêtes sur l’origine et l’assemblage de ces communautés microbiennes. Les tiques peuvent acquérir des microbes grâce à une transmission verticale, contact avec les hôtes et l’absorption de l’environnement par les stigmates et bouche pore anal9. Compréhension des facteurs façonner la formation initiale et le développement de la tique microbiome, plus précisément la contribution relative de la transmission verticale et environnementale, est importante pour comprendre les modèles naturels et les variations en tique microbiome diversité et comment ces communautés interagissent au cours de la transmission d’agents pathogènes, avec des applications possibles pour contrôler la maladie ou un vecteur.

Puissantes techniques moléculaires, comme le séquençage de nouvelle génération, maintenant existent pour identifier les communautés microbiennes et peuvent être utilisés pour caractériser le vecteur microbiomes sous diverses conditions environnementales ou expérimentales. Avant l’avènement de ces approches de séquençage haut débit, l’identification des microbes s’est appuyé principalement sur la microscopie et la culture. Alors que la microscopie est une technique rapide et facile, les méthodes morphologiques pour identifier les microbes sont intrinsèquement subjectif et grossier et limitée par la faible sensibilité et détection10. Méthodes axées sur la culture sont largement utilisés pour l’identification microbienne et peuvent être utilisés pour déterminer la susceptibilité des microbes aux traitements de drogue11. Toutefois, cette méthode souffre également d’une sensibilité faible, car on estime que moins de 2 % des microbes environnementales peuvent être cultivées en laboratoire réglé à12. Méthodes de coloration histologiques ont été également employés pour détecter et localiser des microbes spécifiques au sein de vecteurs, activer les enquêtes sur les différentes distributions de taxons au sein de la tique et étudier les hypothèses sur les interactions microbiennes. Cependant, il faut une connaissance préalable de l’identité microbienne pour sélectionner les taches appropriées, rendant cette approche inadaptée pour l’identification et la caractérisation microbienne. En outre, la coloration histologique est un processus laborieux très gourmandes en temps et ne s’adapte pas bien pour les grands échantillons. Approches moléculaires traditionnels tels que Sanger séquençage sont limités de la même façon dans la détection de diverses communautés microbiennes et leur sensibilité.

Séquençage de nouvelle génération permet l’identification rapide des microbes d’un grand nombre d’échantillons. La présence de gènes marqueurs standard et permet davantage de bases de données référence meilleure résolution taxonomique, souvent au niveau du genre ou espèce. Petite sous-unité ribosomal RNA sont fréquemment utilisés pour atteindre cet objectif, avec 16 s rRNA étant le plus commun en raison de la présence de régions conservées et variables à l’intérieur du gène, permettant la création d’amorces universelles avec des amplicons uniques pour chaque bactérien espèces de13,14. Ce rapport décrit en détail une procédure d’identification des taxons dans le microbiome tique par séquençage de nouvelle génération l’ARNr 16 s. En particulier, ce protocole met l’accent sur les étapes de préparation d’échantillons pour le séquençage. Plus généralisée des détails sur le séquençage et bioinformatique étapes vous sont présentés, qu’il y a une variété de plateformes de séquençage et de programmes d’analyse actuellement disponibles, chacun avec une abondante documentation existante. La faisabilité globale de cette approche nouvelle génération séquençage est démontrée en l’appliquant à une enquête de l’Assemblée de la communauté microbienne dans un vecteur clé de la maladie.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cochez Collection et stérilisation en Surface

  1. Frais virés tiques en faisant glisser un chiffon2 blanc de 1 m sur un habitat associées aux tiques, enlever les tiques attaché à l’espèce hôte, ou l’élevage des tiques dans le lab15,16. Utilisez des pinces fines pour manipuler les tiques et les stocker à-80 ° C.
  2. Placer les tiques dans les tubes PCR individuels et d’éliminer les contaminants de surface au Vortex pendant 15 s successivement avec 500 μL de peroxyde d’hydrogène (H2O2), éthanol à 70 % et FD2O.
  3. Placer les tiques dans un nouveau tube PCR et laissez-les sécher à l’air.
  4. Dans ce tube, mécaniquement perturber les tissus tique en écrasant les tiques avec un mortier et un pilon (utilisé dans cette étude), à l’aide de petites perles dans un batteur de perle, ou couper la tique avec un scalpel.

2. Purification d’ADN

  1. Purifier l’ADN contre les tiques individuels, en suivant les instructions fournies dans un kit d’extraction d’ADN disponible dans le commerce. Éluer pour un volume final de 100 μL.
    Remarque : Reportez-vous à la Figure 1 pour un aperçu des étapes 2.2-2.8. Méthodes d’extraction alternatif incluent phénol-chloroforme extraction17,18, éthanol précipitation19ou extraction avec un chélateur de matière20,21.
  2. Confirmer le succès purification d’ADN à l’aide d’un fluorimètre ou un spectrophotomètre. Pour fluorométrie, utiliser 10 μL de la matrice d’ADN dans un test d’ADN double-brin μL 190. Le rendement attendu est de 0,1 à 1,0 ng/μL22. Pour spectrophotométrie, utiliser 1 μL de la matrice d’ADN dans une quantification d’acides nucléiques. Le ratio A260/280 prévues est environ 1,823.
  3. Dans le cas contraire, procéder immédiatement à une amplification, stocker les échantillons à-20 ° C.

3. Amplification des gènes ARNr 16 s

  1. Mettre en place l’amplicon PCR dans une réaction de 27,5 μL contenant : 5 μL de chaque amorce à 1 μM ; 12,5 μl du mélange PCR disponible dans le commerce ; et 5 μL d’ADN extrait de tiques individuels à une concentration de 5 ng/μL.
    Remarque : Utilisez les amorces suivantes pour l’amplification de la région hypervariable V3-V4 le 16 s rRNA gene13:
    5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
    --GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' 5'
  2. Déplacer les tubes à un thermocycleur programmé pour : une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min ; 25 cycles de 1) 95 ° C pendant 30 s, 2) 57 ° C pendant 30 s, 3) 72 ° C pendant 30 s ; une extension finale à 72 ° C pendant 5 min ; et une dernière prise à 10 ° C.
  3. Une fois que la PCR est fait, visualiser le produit PCR en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel d’agarose de 1,5 %. Recherchez une bande à 460 bp pour confirmer l’amplification.
    Remarque : Produit Amplicon PCR peut ne pas apparaître sur le gel si la concentration de l’échantillon est trop faible (< 10 ng). Présence de dimère de l’apprêt est commun dans des échantillons de faible concentration. Si les autres bandes non ciblés sont présentes, ajuster la température de recuit ou diminuer le nombre de cycles.
  4. Dans le cas contraire, procéder immédiatement à la purification, stocker les échantillons à 4 ° C.

4. Purification d’Amplicon 16 s

  1. À l’aide d’un nouveau tube PCR pour chaque échantillon, allient le produit PCR ddH2O pour obtenir le total 60 μL. Pour les échantillons avec de faibles concentrations d’ADN, effectuer amplicon PCR en trois exemplaires pour réduire le biais de l’amplification et de mettre en commun les échantillons à se concentrer.
  2. Apporter perles paramagnétiques à température ambiante et vortex qu'eux bien avant l’utilisation.
  3. Ajouter 48 μL de perles paramagnétiques à 60 μl de l’échantillon et incuber pendant 5 min. Place les tubes sur un support magnétique pendant 5 min jusqu'à ce que la solution devient clairement. Retirez le surnageant.
    NOTE : Cette concentration perle vise l’élimination des dimères d’amorce (< 60 bp). Si nécessaire, ajuster la concentration en perle pour supprimer les autres bandes non spécifiques.
  4. Avec tubes sur support magnétique, ajouter 500 μl de fraîchement préparés 80 % EtOH. Immédiatement après l’ajout d’EtOH à tous les tubes, distribuer le liquide. Ne pas enlever les perles. Répétez l’EtOH ajout et la suppression une fois de plus.
  5. Sécher les échantillons pour enlever l’excès EtOH en laissant les tubes ouverts sur la grille magnétique pendant 5 min, ou jusqu'à ce que les petites fissures sont visibles dans les perles.
  6. Ajouter 20 μL de tampon TE et incuber les échantillons au large de l’aimant, à température ambiante, pendant 5-10 min.
  7. Placer les tubes sur l’aimant. Une fois que les perles et les liquides sont séparés, transférer le surnageant dans un tube frais pour obtenir le produit PCR nettoyé.
  8. (Facultatif) Visualiser le produit pour confirmer la purification de l’amplicon réussie en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel de 1,5 %. Le groupe bp 460 doit être visible, et il ne devrait y avoir aucun dimère d’amorce.
  9. Si ne pas procéder immédiatement à l’index de PCR, stocker les échantillons 4 ° C.

5. exemple de codes à barres et Purification

  1. Affecter d’amorces unique à chaque échantillon en sélectionnant les amorces soit avant ou arrière, ou les deux, à partir d’un kit d’index de bibliothèque disponibles dans le commerce.
    Remarque : Unique d’étiquetage des échantillons permet la différenciation après séquençage. Kits fournissent généralement assez amorces pour séquencer 96-384 échantillons.
  2. Joignez le doubles amorces ou indices, aux échantillons en effectuant des PCR dans une réaction de 25 μL contenant 2,5 μL de chaque amorce (N7xx et S5xx), 12,5 μL de commercialement disponible mélange maître du PCR, 5 μL de ddH2O et 2,5 μl de produit nettoyé amplicon.
  3. Déplacer les tubes à un thermocycleur programmé pour : une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 3 min ; 8-14 cycles 1) 95 ° C pendant 30 s, 2) 55 ° C pendant 30 s, 3) 72 ° C pendant 30 s ; une extension finale à 72 ° C pendant 5 min ; et une dernière prise à 10 ° C.
  4. Une fois que la PCR est fait, visualiser le produit PCR en chargeant 4-6 μL/échantillon sur un gel d’agarose de 1,5 %. Recherchez une bande à 550 bp pour confirmer l’amplification.
    NOTE : Utiliser les résultats de visualisation pour informer des conditions cyclisme indice d’amplification. Réduire le nombre de cycle pour atténuer les liaisons non spécifiques ou augmenter le nombre de cycle pour obtenir des bandes visibles pour chaque échantillon.
  5. Répéter la procédure de nettoyage répertoriée à l’étape 4. Pour éviter la dilution lors du nettoyage, effectuez des index PCR en double exemplaire et poule produit ici.
  6. Dans le cas contraire, procéder immédiatement à la quantification de la bibliothèque et la normalisation, stocker les échantillons à 4 ° C.

6. normalisation et la Quantification de la bibliothèque

  1. Estimation de la concentration de chaque produit avec code à barres purifiée, de l’étape 5.5 à l’aide d’un fluorimètre ou spectrophotomètre (Voir l’étape 2.2). Diluer les échantillons dans un tampon TE pour obtenir des concentrations d’environ 13:00.
    NOTE : Quantification de la bibliothèque est nécessaire pour atteindre l’échantillon concentration recommandée pour la plate-forme de séquençage de chargement. Quantification de la bibliothèque est obtenue par le biais de qPCR, mais estimer la concentration de l’échantillon avant qPCR enregistre des réactifs et temps. La concentration de 13:00 est recommandée pour maximiser la précision de dosage de la bibliothèque, car il s’agit de la concentration moyenne des normes qPCR fourni dans le kit de quantification24.
  2. Effectuer qPCR dans une réaction de 10 μL contenant 6,0 μL de qPCR mélange principal (à partir de kit de quantification de bibliothèque), 2,0 μL de ddH2O et 2,0 μl de l’échantillon ou de la norme. Exécuter chaque échantillon et standard en triple exemplaire pour une plus grande exactitude et précision. Exécuter chaque échantillon à trois ou plusieurs niveaux de dilution (e.g., 12:01, 1 pm et 22:00 pour des concentrations estimées de départ) afin d’assurer une quantification précise.
    NOTE : Des informations détaillées sur les normes et les amorces fournies variera selon le kit de quantification utilisé et sont disponibles dans les fiches techniques de produits. Se référer à la Table des matières pour le kit de quantification utilisé dans cette étude.
  3. Déplacer la plaque de qPCR ou tubes à un appareil de PCR en temps réel, programmé pour : une dénaturation initiale de 95 ° C pendant 5 min ; 35 cycles de 1) 95 ° C pour 30 s et 2) 60 ° C pendant 45 s ; et une étape de dissociation de 1) 95 ° C pendant 15 s, 2) 60 ° C pendant 30 s et 3) 95 ° C pendant 15 s.
  4. Calculer la moyenne à partir de concentration pour chaque échantillon, en utilisant les valeurs de quantification obtenues à partir des résultats de qPCR et les niveaux de dilution d’échantillon utilisés.
    NOTE : par exemple, une concentration moyenne de 14:00 pour un échantillon dilué 1/100 000 donne une concentration de départ originale de 200 nM. Si aucun des niveaux de dilution pour un échantillon donné relève de la gamme des courbes standards, résultats de quantification ne soient pas exactes ; dans ce cas, régler les niveaux de dilution et de réexécuter qPCR.
  5. Diluer chaque échantillon barcoded purifiée, à 4 nM dans un tampon TE basé sur les concentrations moyennes calculé à l’étape 7,5.
    NOTE : par exemple, pour une concentration de l’échantillon moyen de 200 nM, diluer l’échantillon 01:50 dans TE mettre en mémoire tampon pour atteindre une concentration de nM 4. La concentration de l’échantillon précis variera selon le kit de séquençage de système et réactif utilisé. Consultez le guide de l’utilisateur système de séquencement pour la concentration recommandée.
  6. Créer la bibliothèque combinée en ajoutant des quantités égales (en général 5 à 10 μL) de toutes les bibliothèques individuelles dans un seul tube.
    Remarque : comme tous les échantillons doivent être à une concentration de nM 4, ajout de volumes égaux réalise une concentration égale de tous les échantillons dans la bibliothèque de mise en commun.
  7. Répétez les étapes 6.2-6,4 sur la bibliothèque combinée pour confirmer la concentration nM 4.
  8. Calculer la concentration de bibliothèque combinée et diluer ou reconstituer la bibliothèque finale, regroupée en utilisant un tampon Tris que nécessaire pour atteindre 4 nM.
  9. Dans le cas contraire, procéder immédiatement au chargement de l’échantillon, stocker les échantillons à-20 ° C. Effectuer le séquençage exécuté peu après quantification pour minimiser la perte ou changement dans la concentration d’ADN au cours du stockage.

7. Bibliothèque dénaturation et Dilution et séquençage exécuter (effectuer le jour même)

  1. Dénaturer la bibliothèque combinée de 4 nM de l’étape 6,9 avec NaOH.
    Remarque : Ces étapes de préparation de bibliothèque final différent pour chaque système de séquençage. Consultez le guide d’utilisateur système séquençage des protocoles plus détaillées et à jour. Nouveaux utilisateurs aura probablement besoin de recevoir une formation sur l’utilisation de la plate-forme de séquençage ou peuvent envoyer leurs bibliothèques vers une installation de séquençage de noyau.
  2. Diluer la bibliothèque dénaturée à la concentration de chargement désirée à l’aide de la mémoire tampon fournie dans le kit de réactifs de séquençage (Table des matières).
    Remarque : Les concentrations de chargement optimale varient par système séquentiel et, généralement, vont de 1 à 250 h25.
  3. Dénaturer et diluer le contrôle de séquençage.
    NOTE : Ajout d’un contrôle de séquençage corrige les problèmes de séquençage dus aux bibliothèques de faible diversité. Dénaturer le contrôle de séquence à l’aide de NaOH et diluer à la même concentration que la bibliothèque.
  4. Combiner la bibliothèque et le contrôle de séquençage.
    NOTE : Le rapport de contrôle de séquençage à Bibliothèque combinée dépendra de la diversité de la bibliothèque et le système séquentiel utilisé, mais il est généralement de 1:1,26.
  5. Charger la bibliothèque combinée et le mélange de contrôle de séquençage vers la cellule de flux de séquençage.

8. analyse de la séquence de l’Amplicon

  1. Évaluer le succès global de la course en examinant l’Etendue de la course sur l’environnement informatique de nuage correspondant au système de séquençage utilisé.
    Remarque : La métrique d’exécution, tels que le nombre de lectures de séquençage, variera selon séquençage kit de plate-forme et du réactif utilisé. Les valeurs cibles pour des systèmes communs de séquençage sont énumérés au tableau 1.
  2. Télécharger les données de séquençage brutes et désiré de bio-informatique, logiciels libres, Insights quantitatives en écologie microbienne (QIIME)27 ou Mothur28.
    NOTE : Les QIIME et Mothur sont open source et gratuit à télécharger. Des instructions détaillées sur l’utilisation de ces programmes peuvent être consultées en ligne et sont suffisamment détaillées pour les utilisateurs novices. Les étapes suivantes fournissent une vue d’ensemble d’un pipeline de bioinformatique mené en QIIME. Familiarité avec python n’est pas nécessaire mais permet de faciliter la réalisation des scripts suivants
  3. Créer et valider le fichier de mappage à l’aide du script de « validate_mapping_file.py » dans QIIME.
    Remarque : Le fichier de mappage contient toutes les métadonnées nécessaires pour effectuer l’analyse des données, y compris échant, séquences d’amorces amplicon et description de l’échantillon. L’étape de validation vérifie que toutes les données nécessaires ont été entrées dans le format approprié.
  4. Démultiplexer et filtrer les séquences en utilisant le script « split_libraries.py » (Figure 1).
    NOTE : Ce script affecte barcoded lectures aux échantillons basés sur les combinaisons d’amorces index et ID d’échantillon d’entrée dans le fichier de mappage. Il effectue également plusieurs qualité de filtrage des mesures de contrôle de séquençage d’erreur en fonction définie par l’utilisateur les seuils pour le niveau de qualité minimum, longueur de la séquence et éboutage.
  5. Affecter des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) aux séquences en utilisant le script « pick_open_references_otus.py ».
    Remarque : Dans cette étape, les séquences sont groupés contre une collection de séquence de référence basée sur un seuil d’identité (habituellement 97 %). Les lectures qui ne correspondent pas à la collection de séquences de référence sont regroupés contre l’autre. De novo et fermé-référence Uto cueillette options sont également disponibles, mais la cueillette libre-référence est recommandée par les développeurs de QIIME.
  6. Normaliser la table OTU en utilisant le script « alpha_rarefaction.py » ou « normalize_table.py ».
    Remarque : Cette étape corrige la variation dans les montants de la colonne ou la séquence totale lectures par exemple, résulter de technologies de séquençage moderne. Normalisation peut être effectuée à l’aide de raréfaction traditionnelle, ou par le biais de méthodes alternatives telles que la somme cumulée mise à l’échelle.
  7. Effectuer plusieurs diversité alpha, bêta-diversité et l’analyse de la composition taxinomique diversité à la fois en utilisant le script « core_diversity_analysis.py ».
    Remarque : Par ailleurs, ces analyses peuvent être exécutées séparément en utilisant les scripts individuels (par exemple, "alpha_diversity.py »).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un total de 42 tiques de trois œufs distincts embrayages et deux périodes d’exposition environnementale, 0 et 2 semaines dans le sol, ont été traitées pour l’ordonnancement de microbiome. Chaque groupe de traitement, considéré comme une seule fois d’embrayage et de l’exposition, contenue 6-8 échantillons tique de répliquer. Ces extraits de tique transformés ont été chargées dans un séquenceur de nouvelle génération et a donné 12,885,713 jumelé-fin lectures en passant le filtre. Inclus dan...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nouvelle génération séquençage des ARNr 16 s est devenu une approche normalisée pour identification microbienne et a permis l’étude d’incidence vecteur microbiomes et de transmission d’agents pathogènes. Le protocole décrit ici en détail l’utilisation de cette méthode pour étudier l’Assemblée de la communauté microbienne dans I. pacificus, une espèce de vecteur de la maladie de Lyme ; Toutefois, il peut facilement être appliqué à l’étude des autres espèces de tiques ou arthropode vecteur.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par National Science Foundation accorde à A.S. (# DEB 1427772, 1745411, 1750037).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nomde l’article Matériel/ÉquipementCatalogue de l’entreprise#
1DNeasy Blood & Kit de tissusQiagen69504
Fluorimètre 2Qubit 4ThermoFisher ScientificQ3326
3Spectrophotomètre NanoDrop 8000ThermoFisher ScientificND-8000-GL
42x KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapa BiosystemsKK2501
5billes AMPure XPAgen CourtA63880  ;
6Rack magnétiqueThermoFisher ScientificMR02
6Tampon TETeknovaT0223
7Kit d’index NexteraIlluminaFC-121-1011
8Kit de quantification de la bibliothèque KAPARocheKK4824
9Système MiSeqIlluminaSY-410-1003
10Kit de réactifs MiSeq v3  ;IlluminaMS-102-3001
1110 mM Tris-HCl avec 0,1 % Tween 20TeknovaT7724

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
  2. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
  3. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  4. Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
  5. Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
  6. van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
  7. Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
  8. Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
  9. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  10. Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
  11. Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
  12. Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
  13. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
  14. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  15. Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
  16. Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
  17. Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
  18. Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
  19. Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
  20. Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
  21. Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
  22. Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
  23. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  24. TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
  25. Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
  26. Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
  27. Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
  28. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
  29. Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
  30. Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
  31. Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
  33. Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
  34. Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
  35. Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
  36. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564(2014).
  37. Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
  38. Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
  39. McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
  40. Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
  41. Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
  42. Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
  43. Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
  44. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  45. Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
  46. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
  47. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19(2010).
  48. Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
  49. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

S quen age de l ARNr 16Smicrobiome vectorielPCR d ampliconsextraction d ADNlectrophor se sur gelbilles paramagn tiquesquantification par qPCRpr paration de biblioth quess quen age sur cellule de flux

Articles connexes