Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Résumé

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé nouveau et facile net axée sur le moule pour créer des tissus cardiaques d’en trois dimensions (3d) sans matériel d’échafaudage supplémentaires. Cardiomyocytes de DERIVES de cellules-souches humaines pluripotentes (iPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont isolées et utilisés pour générer une suspension de cellules avec 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. Ils sont conjointement mis en culture dans un système de « goutte suspendue » de fixation ultra faible, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné. Les cellules agrègent et forment spontanément sphéroïdes de battement après 3 jours de culture mixte. Les sphéroïdes sont récoltés, ensemencées dans une cavité de moule roman et cultivées sur un agitateur dans l’incubateur. Les sphéroïdes devient un tissu fonctionnel mature environ 7 jours après le semis. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette nouvelle méthode a un potentiel prometteur comme une méthode reproductible et rentable de créer des tissus conçus pour le traitement de l’insuffisance cardiaque à l’avenir.

Introduction

Ingénierie de tissu cardiaque actuelle vise à développer une thérapie pour remplacer ou réparer la structure et la fonction du tissu myocardique lésée¹. Méthodes pour créer des modèles 3D de tissu cardiaque présentant les propriétés contractiles et électrophysiologiques importantes du tissu cardiaque indigène ont rapidement étendu^2,3. Diverses stratégies ont été exploré et utilisé dans les études^4,5. Ces méthodes vont de l’utilisation des hydrogels bioactifs naturels et synthétiques spécifiques, comme la gélatine, le collagène, fibrine et peptides⁶, à la bio-encre dépôts technologies² et bioprinting technologies⁷.

Il a été démontré que méthodes exempte d’échafaudage peuvent produire des tissus comparables comme les méthodes axées sur les biomatériaux, sans les inconvénients de l’incorporation de matière étrangère échafaudage⁸. Oren Caspi et coll. ont montré que l’incorporation de différents types de cellules active la génération de fortement vascularisé humain tissu cardiaque machiné⁹. Menton et coll. mis au point une méthode d’impression 3D pour la création de patch cardiaque de sphéroïdes. Correctifs qui en résultent sont composées des cardiomyocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales dans un ratio de 70:15:15¹⁰. Sphéroïdes ont démontré être efficaces « building blocks » de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage, comme ils résistent contre l’hypoxie et posséder une intégrité mécanique suffisante pour implantation^11,12. Des études antérieures ont démontré plusieurs méthodes de fabrication pour la création de sphéroïde, y compris l’utilisation de la pendaison de glisser méthode, fileur flacons¹³, de systèmes microfluidiques¹⁴et les surfaces de culture non adhérents non couchés ni enduits avec d’agarose micro-moules¹⁵. Dans ce protocole, nous utilisons la pendaison goutte périphérique, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné.

Cette étude présente une nouvelle et efficace méthode sans échafaudage pour la création de tissu cardiaque, qui comprend l’ensemencement manuellement les sphéroïdes dans une cavité de moule carré et en incubant le tissu sur un agitateur pour la maturation. Dans des conditions de culture statique habituel, diffusion de l’oxygène est limitée aux aspects extérieurs de la construction des tissus, entraînant une nécrose centrale. Cependant, avec le moule net, tous les sphéroïdes ensemencées dans le moule sont immergés dans les médias avec un mouvement constant fluidique, permettant la diffusion accrue de nutriments et d’oxygène. En outre, cette méthode axée sur le moule permet la création simultanée de patchs de tissus de différentes tailles avec un minimum d’effort manuel et le tissu qui en résulte peut être facilement retiré du moule. Cette nouvelle méthode permet la création efficace et reproductible des patchs cardiaques sans échafaudage et multicouches.

Protocole

1. préparation des Cardiomyocytes

1. Plaques 6 puits manteau avec membrane basale matrice et la culture anthropique des cellules souches pluripotentes (hiPSCs) comme décrit plus haut¹⁷.
2. La différence de hiPSCs en hiPSC-CMs à l’aide des méthodes décrites précédemment,¹⁸.
3. À différenciation après d 16-18, suspendre les cardiomyocytes en rinçant chaque puits avec 2 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ou magnésium, suivi par incubation avec 1 mL/puits de la trypsine ou cellule réactif de dissociation (voir Table de Matériaux) pendant 5 min à température ambiante.
4. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un volume égal de milieux cellulaires de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionnés de B-27 (milieux de cellules RPMI/B-27). Pipetter en haut et en bas pour décoller les cellules adhérentes.
5. Recueillir les cardiomyocytes suspendus avec une pipette sérologique de 10 mL et de les transférer dans un tube conique de 50 mL.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un culot cellulaire.
7. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux cellulaires RPMI/B-27.
8. Combinez 20 µL de suspension cellulaire avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.
9. Utilisez un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.

2. préparation des fibroblastes

1. Initier une culture d’une lignée de cellules de fibroblaste cardiaque humain (HCF) (type adulte ventriculaire) comme décrit plus haut¹⁶.
2. Suspendre les CS en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 5 min à température ambiante,¹⁶. Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.
3. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir un Pellet.
4. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de croissance de fibroblaste (voir Table des matières).
5. Combinez 20 µL de la suspension cellulaire HCF avec une quantité égale de solution de bleu de trypan 0,4 % et mélanger doucement.
6. Utiliser un compteur de cellules automatisé ou manuel hémocytomètre pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la nouvelle suspension cellulaire.

3. préparation des cellules endothéliales

1. Initier une culture d’une lignée de cellules endothéliales (HUVEC) de veine ombilicale humaine comme décrit plus haut¹⁷. Suspendre les HUVECs en incubant eux avec une quantité appropriée de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) pendant 3 min à température ambiante¹⁷. Neutraliser le réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire (voir Table des matières) à l’aide d’un égal volume de liquide, puis transférer dans un tube conique de 50 mL et centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min à température ambiante pour obtenir une boulette.
   Remarque : Pour un flacon de T175, 10 mL de réactif de dissociation de la trypsine ou cellulaire a été utilisé.
2. Resuspendre le culot dans 10 mL de milieu de culture de cellules endothéliales (voir Table des matières).
3. Mélanger 20 µL de la suspension HUVEC et souiller avec une quantité égale de solution de bleu de Trypan 0,4 % et mélanger doucement.
4. Utiliser un compteur de cellules automatisées ou un hémocytomètre manuels pour compter et obtenir la viabilité cellulaire et de la concentration de la suspension cellulaire.

4. création de la pendaison des sphéroïdes Drop

1. Placez la pendaison goutte périphérique qui contient des 850 micropores (chacun avec un diamètre de 350 µm) en plaques de 6 puits stériles.
2. Isoler les trois types de cellules comme décrit ci-dessus : hiPSC-CMs, CS et HUVECs. Combiner dans une proportion de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs dans un tube conique de 50 mL avec les milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL.
3. Diluer 4 mL de la suspension cellulaire (2 475 000 cellules / mL) dans chaque puits d’un accessoire ultra faible système goutte (d’un diamètre de micropore de 350 µm) assis dans une plaque 6 puits.
4. Sphéroïdes seront forme spontanément dans les 12 h de dispenser la suspension cellulaire dans la pendaison goutte périphérique. Continuer à la culture pour un total de 72 h (3 jours) à 37 ° C, 5 % de CO₂et 95 % d’humidité pendant la maturation des sphéroïdes.
5. Après 72 h de culture, récolter les sphéroïdes à travers les pores au bas de la pendaison drop système en plaçant l’appareil dans un plat avec un moyen et en agitant délicatement pour libérer les sphéroïdes de la pendaison goutte périphérique.

5. création de Patch 3D en utilisant le nouveau moule Net

1. La base carré plaque de fond, filet de base et 10 côté couches filets sont assemblés pour créer le nouveau moule à l’aide d’une paire de pince stérile. Tout d’abord, empiler et alignez la base, le socle carré et fond net en utilisant les poteaux d’angle. Ensuite, la pile et couche les filets 10 côté en alternant les instructions pour créer un réseau de fines broches en acier inoxydable.
2. Rincer le remplissage base avec PBS ou moyen pour réduire la tension superficielle et, ensuite, transférer le moule assemblé sur la base de remplissage.
3. Mouiller la cavité du moule net avec PBS ou moyen dans la même méthode. Remplir lentement les sphéroïdes dans la cavité présupposée de la taille désirée (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, ou 6 x 6 x 1 mm).
   Remarque : Assurez-vous que 120 % du volume prévu des sphéroïdes est introduit dans la cavité, afin que les agrégats de cellules sont en lien étroit et restent statiques.
4. Assembler le haut net et le haut de la page plaque carrée sur les poteaux d’angle et sécuriser les bouchons et les tubes d’exploitation afin d’éviter un affaissement des sphéroïdes.
5. Transférer le système rempli de moisissure net à une plaque 6 puits 6 ml de milieux cellulaires RPMI/B-27 ou dans un contenant stérile avec assez moyen pour couvrir le moule assemblé ensemble.
6. Incuber la plaque 6 puits avec le système de moule rempli sur un agitateur oscillant pendant 7 à 10 jours à 3 000-4 000 x g.
   Remarque : La durée de l’incubation est décidée par la taille des patchs cardiaques. Avec des taches plus grandes, le temps d’incubation devra être augmentée pour la maturation de patch cardiaque.

6. suppression du correctif du roman moule Net

1. Enlever la moisissure des médias et placez-le sur le tapis de manutention stérilisé dans un récipient stérile de 10 cm.
2. Enlever le tube de l’exploitation, bouchons, la plaque carrée supérieure et le haut de la page net. Glisser délicatement les filets côté en couches une par une avec une paire de pince stérile. Après décanulation, un patch cardiaque intact est obtenu au sommet du filet de base.
3. Transférer le filet de base dans un plat de 35 mm avec 5 mL de RPMI/B27 médias et relever le filet de base avec le correctif à l’aide d’une pince stérile. Desserrer doucement le patch dans le filet de base en agitant doucement le filet dans le plat, ou avec un grattoir de cellules stériles. Après le détachement du fond net, le tissu cardiaque peut être cultivé avec médias RPMI/B27.
4. Continuer à incuber le patch cardiaque 3D flottant librement dans le plat de 35 mm. Battement synchrone fonctionnelle peut être observée dès 24h après l’enlèvement du moule.
5. Après avoir enlevé le patch du moule net, observer que sa forme est maintenue avec intégrité et de l’intensité de battement synchrone augmente avec le temps.
   Remarque : Les correctifs cardiaques 3D basé sur moule nets exposé intégration électrique du composant cardiospheres après décanulation. Nous avons observé une fréquence de battement allant de 60 à 80 battements par minute qui perdure depuis plus de 60 jours.

Résultats

Dans nos expériences, nous avons utilisé une suspension cellulaire de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs en milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL. Après avoir créé la suspension cellulaire, nous avons distribué 4 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un accessoire ultra faible chute de système, comme indiqué au point 4.3 du protocole. L’utilisation de la pendaison goutte système conduit à la formation spontanée de centaines de batt...

Discussion

L’importance de cette méthode réside dans sa reproductibilité et l’efficacité du tissu cardiaque multicouche qui en résulte. Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, l’un des objectifs actuels est d’identifier une méthode pour construire les patchs cardiaques 3D battant, multicouches et fonctionnelles. Nous rapportons une méthode efficace et reproductible de création de plusieurs couches de tissus cardiaques par semis manuel direct des sphéroïdes composés des cardiomyocytes, cellules endothéliales, fibroblas...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibroblastes cardiaques humains (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 Se compose d’un milieu basal	Sciencell	2331	HCF
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit  ;	Lonza	CC5035	Milieu de culture HUVEC
E8 media  ;	Invitrogen	A1517001	HiPSC
Geltrex  ;	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher	12604013	Trypsine et réactif de dissociation cellulaire
Milieu RPMI	Invitrogen	11875093	avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM
Supplément B-27 (50x)	Le milieu Thermo Fisher 17504044		RPMI avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Fisher	15250061
Novel moule à filet	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
Plaque de chute suspendue	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6 plaques de puits  ;	Sigma-Aldrich	CLS-3516