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Article de méthode

Liposomes antigéniques pour la production d’anticorps spécifiques à certaines maladies

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DOI :

10.3791/58285

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25 octobre 2018

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1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Décrit est la préparation de nanoparticules LIPOSOMALES antigéniques et leur utilisation en stimulant cellules B activation in vitro et in vivo. Uniforme et robuste d’anticorps conduit à l’élaboration d’un nouveau modèle d’allergie à l’arachide. Le protocole pour générer des liposomes antigéniques peut être étendu à des antigènes différents et des modèles de vaccination.

Résumé

Les réponses anticorps fournissent une immunité protectrice critique à un large éventail d’agents pathogènes. Il reste un grand intérêt dans la production d’anticorps robustes pour la vaccination ainsie que de comprendre comment pathogènes anticorps réponses se développent dans les allergies et les maladies auto-immunes. Génération d’anticorps spécifiques de l’antigène robuste n’est pas toujours trivial. Dans des modèles murins, il nécessite souvent plusieurs séries de vaccins avec adjuvant qui mène à une grande variabilité dans les niveaux d’anticorps induits. Un exemple est dans des modèles murins d’allergies aux arachides, où les modèles plus robustes et reproductibles qui réduisent au minimum le nombre de souris et l’utilisation de l’adjuvant serait bénéfiques. Présenté ici est un modèle de souris hautement reproductible de l’anaphylaxie de l’allergie à l’arachide. Ce nouveau modèle s’appuie sur deux facteurs : (1) spécifiques de l’antigène splénocytes sont Moutschen transférés d’une souris sensibilisés à l’arachide dans une souris destinataire naïf, normalisant le nombre de mémoire spécifiques de l’antigène B et T-cellules dans un grand nombre de souris ; et (2) souris bénéficiaires sont amplifiées par la suite avec un immunogène multivalent solide sous forme de nanoparticules LIPOSOMALES affichant le principal allergène d’arachide (Ara h 2). L’avantage majeur de ce modèle est sa reproductibilité, qui réduit en fin de compte le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude, tout en minimisant le nombre d’animaux ayant reçu de multiples injections d’adjuvant. L’Assemblée modulaire de ces liposomes immunogènes fournit une adaptabilité relativement facile à d’autres modèles allergiques ou auto-immunes qui impliquent des anticorps pathogènes.

Introduction

Allergie alimentaire touche 8 % des enfants aux Etats-Unis et a augmenté dans la prévalence au cours de la dernière décennie1. Allergie à l’arachide affecte 1 % des enfants et n’est pas généralement dépassé2. Bien que plusieurs essais cliniques prometteuses sont en cours pour le traitement des allergies alimentaires, y compris l’immunothérapie par voie orale (OIT), l’immunothérapie sublinguale (fente) et immunothérapie épicutanée (romaric), il n’y a actuellement pas de stratégies de traitement approuvé par la FDA pour la désensibilisation des personnes allergiques aux arachides3,4,5,6,7,8. Donc, les personnes allergiques doivent éviter strictement allergènes afin d’éviter l’anaphylaxie. De nombreuses questions restent en ce qui concerne les voies d’une sensibilisation et qui sous-tendent les mécanismes du développement d’allergie alimentaire.

Les modèles de souris sont un outil précieux pour étudier les mécanismes de l’allergie ainsi que le développement de nouveaux tolérogène et désensibilisation thérapies9,10,11,12. Cela est particulièrement vrai parce que le principal allergène d’arachide (Ara h 2 ; Ah2) chez l’homme est aussi décrit de l’allergène dominante dans plusieurs souris modèles13,14. Alors que les modèles murins d’allergie à l’arachide ont une valeur inestimables pour l’étude des mécanismes de sensibilisation et de la tolérance, un inconvénient est qu’ils peuvent être variables et nécessitent l’utilisation d’adjuvants. Immunogènes plus puissant serait une façon de réduire la variabilité intrinsèque de ces modèles. Étant donné que les lymphocytes B sont fortement activées par des antigènes multivalents, liposomes antigéniques affichant l’allergène sont une bonne option en raison de leur capacité à activer potentiellement lymphocytes B par le récepteur des cellules B (BCR) tout en ayant également la propriété de façon efficace amorçage du compartiment de lymphocytes par non spécifiquement que présentatrices d’antigène des cellules.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la conjugaison des antigènes protéiques aux nanoparticules LIPOSOMALES en utilisant une stratégie modulaire et facile. En utilisant un antigène de substitution, les IgM anti-fragment Fab, nous démontrons comment puissant ces liposomes antigéniques peuvent être dans l’activation des lymphocytes B stimulante. Liposomes antigéniques affichant Ah2 antigène ont servi à élaborer un nouveau modèle de souris de sensibilité conféré. Dans ce modèle, splénocytes de vérifié souris allergiques aux arachides, contenant les mémoires d’arachide-spécifiques et T-lymphocytes B, sont transférés dans la souris congéniques naïves. Réponses d’anticorps de mémoire sont induites par l’injection de liposomes conjugués avec Ah2 dans les souris bénéficiaires, afin d’induire des anticorps contre Ah2. Suivi par seulement un coup de pouce Ah2 soluble, anticorps spécifiques Ah2 donnent lieu à une forte réaction anaphylactique lors de ces souris sont subséquemment contestés avec Ah2. Souris en cours de la réaction allergique répondent de manière très uniforme et n’ont pas reçu un adjuvant, cette approche est un modèle d’allergie à l’arachide souhaitable et les résultats suggèrent qu’il pourrait avoir utilité dans d’autres modèles de souris conduits par dirigée contre des antigènes allergènes et éventuellement les auto-antigènes.

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Protocole

La méthode générale de couplage des protéines au lipide qui intègrent dans des liposomes repose largement sur les précédents travaux15. Toutes les procédures animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par l’University of North Carolina à Chapel Hill animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC). Toutes les souris utilisées dans le modèle de l’allergie à l’arachide sont femelles BALB/cJ achetées à l’âge de 3 semaines. Les soins aux animaux de l’Université de l’Alberta et utiliser Comité (ACUC) a approuvé les expériences impliquant l’utilisation des rates de souris pour ex vivo analyse de souris C57Bl/6 d’au moins 6 semaines d’âge.

1. la conjugaison d’antigène de protéine et de lipides pégylé

  1. Ajouter 3 g de billes de gel de dextran réticulé avec une gamme de fractionnement de 1 500 – 30 000 Daltons (Da) dans un ballon de 250 mL vide. Ajouter 60 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remuer constamment avec une barre magnétique remuer. Sceller la fiole et attachez à un aspirateur pour initier le dégazage sur une plaque de remuer pendant au moins 1 h.
  2. Dans une colonne de chromatographie de verre 1,0 cm x 30 cm, avec le chiffre d’affaires de bouchon fermé, ajouter PBS à la colonne de lavage. Ouvrir le bouchon de chiffre d’affaires et vider la colonne. Après lavage, ajouter le lisier de perles hors gazés à la colonne. Continuellement ajouter la boue jusqu'à ce que la colonne est remplie jusqu'à une hauteur de talon d’environ 24 cm.
  3. Une fois que la colonne a une « tête » d’environ 4 à 5 cm de PBS ci-dessus les perles emballés, avoir les étapes suivantes prêts.
    1. Créer un siphon d’écoulement de gravité en mesurant un morceau de tuyau assez longtemps pour atteindre un plateau 1 à 2 pieds au-dessus de la colonne et de créer une boucle qui dépose au bas de la colonne et renvoie vers le haut de la colonne. Ajouter un bouchon de chiffre d’affaires à une extrémité de la tubulure, en laissant un côté du tube ouvert. Placer l’extrémité de tube ouvert dans une bouteille de 500 mL de PBS et les placer sur l’étagère au-dessus de la colonne.
    2. Prenez l’extrémité avec le bouchon de chiffre d’affaires et fixez une seringue de 10 mL. Ouvrir la vanne de bouchon de chiffre d’affaires sur la ligne de tuyauterie et dessiner des PBS à travers le tube. Une fois que le PBS a atteint les trois quarts du chemin dans la tubulure, sortir la seringue rapidement et ajouter le bouchon de chiffre d’affaires vers le haut de la colonne — liquide doit être en cours d’exécution sur la colonne.
      Remarque : La quantité de « tête » de PBS à gauche sur le dessus de la colonne doit être comprise entre 1 et 3 cm. Le montant minimal pour laver la colonne est 3 volumes de colonne.
  4. Déterminer la quantité de protéines (moles) soit liée au lipide basé sur son poids moléculaire (MW).
    Remarque : Le fragment Fab de chèvre anti-souris IgM (elle-même une IgG) est utilisé ici comme un antigène universelle porteuse pour la stimulation polyclonale des lymphocytes B. Par conséquent, le fragment Fab d’IgG de chèvre a un MW d’environ 48 kilodaltons (kDa) et est commercialisé en une quantité totale de 1,3 mg. Ainsi, la quantité de protéine liée est 27,1 µmol.
  5. Déterminer le coefficient d’extinction de la protéine d’intérêt. Si inconnu, mesurer l’absorbance de la protéine à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre et diviser la valeur de280 A par le nombre de moles calculée à l’étape 1.4.
    Remarque : L’extinction coefficient de Fab de chèvre IgG à 280 nm est de 64 600 M-1.
  6. Pour assurer cette trace des quantités de contenant des amines tampon sont enlevés, dessalement de la protéine sur la colonne créée aux étapes 1,1 à 1,3 et recueillir des fractions protéiques dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL (~ 500 µL par fraction).
    1. Fermer la vanne de bouchon de chiffre d’affaires reliée à la partie supérieure de la colonne et enlever la partie supérieure de la colonne. Si ce n’est déjà ouvert, ouvrez la valve de taquet de chiffre d’affaires en bas de la colonne et attendre jusqu'à ce que la « tête » de PBS frappe le dessus des perles.
    2. Ajouter lentement dans la protéine d’intérêt vers le haut des billes à l’aide d’un verre de pipette Pasteur, en prenant soin de minimiser la perturbation vers le haut des perles.
    3. Une fois que la « tête » de la solution de protéine a atteint le sommet des perles, ajouter 1 mL de PBS doucement via une pipette Pasteur. Répéter trois fois. Ajouter PBS pour créer une tête de 4 à 5 cm et répétez l’étape 1.3 pour laver la colonne.
      Remarque : Cette étape peut être sautée si il est certain qu’aucun tampon contenant des amines n’est présent.
  7. Déterminer les fractions contenant des protéines en mesurant les valeurs A280 et mettre en commun les fractions qui donnent environ 90 % de récupération de la protéine.
    Remarque : Cela dilue généralement la protéine 1,5 à 2 fois. Déterminer la concentration de protéine après mise en commun. Concentrer les protéines à cette étape, si nécessaire, à l’aide d’un concentrateur de centrifugation.
  8. Ajouter 2,5 équivalent molaire de la RETICULATION hétérobifonctionnel à la protéine.
    1. Tout d’abord, peser environ 5 mg de succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (DPS, MW = 314 g/mol) dans un tube de microcentrifuge. Pour déterminer le volume de dissolution du DPS, prenez la concentration molaire de protéine et multipliez-le par 250 x permettant de générer une solution 100 x qui donnera un excès molaire 2,5 dans la réaction.
      NOTE : par exemple, si la concentration en protéine est de 50 µM, une solution de DPS à 12,5 mM est nécessaire. Pour 5 mg de DPS, cela revient à 1,27 mL du diméthylsulfoxyde (DMSO).
  9. Ajouter DPS à la protéine d’intérêt à une dilution au 1/100. Placez la réaction dans un agitateur oscillant à température ambiante (RT) pendant environ 1 h.
  10. Pour supprimer les excès DPS et protéger l’obligation disulfure endogènes, de la protéine dans l’étape de réduction subséquente, équilibrer et laver la colonne créée dans les étapes 1.1-1.3 en 100 mM l’acétate de sodium (NaOAc) à pH 5,5 ou créer une colonne identique uniquement pour une utilisation dans ce mémoire tampon.
  11. Après 1 h d’incubation avec le DPS, dessalement la protéine sur la colonne équilibrée dans 100 mM NaOAc. Procéder à cette étape de manière identique comme étape 1.6 sauf à l’aide de 100 mM NaOAc (pH 5,5) comme l’éluant. Recueillir les fractions, déterminer l’A280et mettre en commun les fractions supérieurs. Laver la colonne dans du PBS.
  12. Préparer une solution de 2,5 M de la TNT (MW = 154 g/mol) à double distillée (ddH2O). Ajouter 25 mM DTT regroupées fractions de protéine pendant 5-10 min.
  13. Mesurer l’A280 de la protéine et cela divise par le coefficient d’extinction. En outre, déterminer l’A343. Calculer le ratio reliant reposant sur la molarité de protéines (une280) et éditeur de liens (un343).
    Remarque : Désactivez l’A340 d’automatique-calibrage Si à l’aide d’un spectrophotomètre nanodrop. L’unité343 représente l’absorbance du groupe de thione-2 pyridine (coefficient d’extinction = 7550 M-1) qui est prélevée sur le réticulant DPS par la TNT. Un rapport molaire de linker : ratio de protéine de 1,2 à 1,5 est généralement réalisé lors de l’exécution de la réaction avec un excès molaire 2,5 de sur le PSDPS sur un large éventail de protéines.
  14. Passez les fractions regroupées sur la colonne lavée dans du PBS comme décrit ci-dessus. Recueillir les fractions, déterminer l’A280et fractions albums en commun. Déterminer la concentration de protéine par A280 après mise en commun les fractions.
  15. Préparer le DSPE-PEG (2000)-maléimide (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)-maléimide. Cela s’ajoutera à la protéine dans un rapport molaire de 10:1. Préparation d’un stock de 100 x de DSPE-PEG (2000)-maléimide pour obtenir la concentration désirée.
    1. Par exemple, si la concentration de protéines a 10 µM après étape 1.14, préparation d’un stock de DSPE-PEG (2000)-maléimide à 10 mM. Peser soigneusement DSPE-PEG (2000)-maléimide (MW = 3 000 g/mol) et ajouter la quantité appropriée de DMSO. Plusieurs séries de Vortex doux et sonification peuvent obtenir entièrement dissous.
  16. Déterminer le volume total des fractions de l’étape 1.14 et transvaser la solution soigneusement dans une petite (10-25 mL) (RBF) ballon à fond rond. Ajouter la quantité appropriée de 100 x DSPE-PEG (2000)-maléimide à la protéine d’atteindre un 1 x, 10 fois concentration molaire en excès, final. Doucement agiter la solution pour s’assurer que le DMSO est complètement dispersé.
  17. Réaction du jour au lendemain sous atmosphère d’azote s’exécuter dans un RBF scellé. Utilisez un septum en caoutchouc et placez dans une hotte de laboratoire.
    1. Retirer de l’atmosphère par perforation de la cloison avec une aiguille de 20 G, attachée à une seringue de 3 mL à l’extrémité du tuyau attaché à un vide et vide pour 3 à 5 s.
    2. Remplacer l’atmosphère avec de l’azote. Remplir un ballon attaché à une seringue de 3 mL, coupée en deux avec de l’azote et attacher une aiguille de 20 G. Percer la cloison pour remplir l’atmosphère à l’intérieur du ballon à fond rond avec de l’azote. Répétez l’élimination de l’atmosphère et le remplacement avec de l’azote une fois de plus et laisser le ballon d’azote attachée pendant la nuit.
  18. Préparer une colonne de perle de gel distinct dextran réticulé avec une gamme de fractionnement de 4 000 – 150 000 Da dans une colonne de chromatographie de verre de 1,0 cm x 50 cm (selon les étapes 1.1 à 1.3).
  19. Le lendemain, retirer la protéine du ballon préparé à l’étape 1.17 et exécuter (suivre la méthode utilisée à l’étape 1.6) sur la colonne de perle de gel réticulé dextran (de l’étape 1.18).
    Remarque : Le montant total à charger sur la colonne doit être pas plus de 2 mL. Si une plus grande réaction a été utilisée, scindé en deux et exécutez sur colonnes séparées ou sur une colonne de diamètre plus grande.
    1. Recueillir les fractions, déterminer l’A280, fractions top de piscine et déterminer la concentration de protéine. La présence des lipides n’affectera pas les mesures.
  20. Stocker les fractions commun finales de protéine lipide-liés à 4 ° C jusqu’au moment de l’utilisation.

2. préparation de liposomes

  1. Peser les lipides : DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000, MW = 2805.5 g/mol ; Cholestérol (3 b-Hydroxy-5-cholestène, 5-cholestène-3 b-ol), MW = 386.7 g/mol ; et DSPC (1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine), MW = 790.1 g/mol créer une solution de 5 mg/mL du CSCB, 4 mg/mL solution de cholestérol et 2 mg/mL de solution de DSPE-PEG(2000) dans le chloroforme.
  2. S’assurer que le rapport molaire des lipides dans les liposomes est : 57 % CSCB, 38 % de cholestérol et 5 % DSPE-PEG(2000), tel que représenté dans le tableau 1.
    Remarque : Il est important de contrôler la quantité d’antigène sur les liposomes, qui varie généralement de 0,01 à 0,1 %. Dans le tableau 1, 0,1 % de chèvre anti-souris fragment Fab d’IgM lié aux lipides pégylé est utilisé. Il est essentiel de tenir compte de la molaire 10 fois excès de DSPE-PEG (2000)-maléimide qui a été ajouté à la protéine à l’étape 1,15, pour s’assurer que la quantité totale de lipides pégylé ne dépasse pas 5 %.
  3. Examiner les quantités de lipides final (µmol) lors de la création des lipides pour l’extrusion. Voir le tableau 1 pour obtenir un exemple de calcul des concentrations molaires de lipides pour la création des liposomes à une concentration de lipides totaux µM 1,25.
  4. Une fois que le montant exact de chaque lipide à être additionnés a été calculé, mélanger ensemble dans un tube à essai en verre borosilicate 12 mL.
  5. Souffler avec soin le chloroforme.
    1. Utiliser le tube et une seringue de 3 mL avec aiguille, préparé à l’étape 1.17.1, à souffler avec soin de chloroforme dans le tube avec de l’azote. Souffler doucement un flux d’azote sur la solution tout en tournant le tube avec l’autre main. Veillez à réduire au minimum les éclaboussures ou provoquant le liquide à exécuter de façon sur le côté du tube car il peut être plus difficile à obtenir ceci en solution dans l’étape suivante.
  6. Ajouter 100 µL de DMSO dans chaque tube et lyophiliser cette solution du jour au lendemain. Recouvrir le haut du tube avec une lingette de laboratoire non statique, fixer avec un élastique et congeler à-80 ° C.

3. liposome Extrusion

  1. Ajouter 1 mL de PBS contenant la protéine lipide-liés dans le tube de 12 mL contenant des lipides. Laisser agir la solution pendant environ 30 s à 1 min dans un bain d’eau de sonication. Le repos pendant au moins 5 min entre chaque tour et répéter 3 à 4 fois.
  2. Préparer une extrudeuse comme indiqué par le fabricant.
    1. Ajouter des supports de filtre à l’aide de la membrane interne, verser quelques gouttes (10 µL de chaque) de PBS sur le film de paraffine. À l’aide de pinces à épiler, prenez un bord du support filtre et trempez-le dans la baisse de 10 µL.
    2. Placer le filtre à l’intérieur du joint torique. Cela pour les deux parties. À l’aide de pinces à épiler, prenez un filtre de 0,8 µm sur le bord et plonger dans la baisse de 10 µL et enduire l’extérieur du joint torique avec du PBS. Placer le filtre de 0,8 µm doucement sur le joint torique ainsi le filtre ne fait pas trop accrocher le soutien de la membrane interne.
  3. Placez le bloc de chauffage extrudeuse sur une plaque chauffante pour préchauffer l’extrudeuse. Basculer la plaque de cuisson à faible température et permettre l’extrudeuse un bloc de chauffage à la température désirée. Pour éviter d’éventuels problèmes avec l’agrégation des protéines, ne pas chauffer le bloc passé 37 ° C.
  4. Charger l’échantillon aux ultrasons dans une des seringues extrusion placés dans l’extrudeuse. Placer la seringue extrudeuse dans l’autre extrémité de l’extrudeuse. Veillez à ce que le piston de la seringue vide est défini sur zéro. La seringue vide se remplira comme le lipide est extrudé à travers la membrane de polycarbonate 0,8 µm. Essayez d’éviter de passer les bulles en arrière à travers la membrane.
  5. Placez l’extrudeuse entièrement assemblé dans le bloc chauffant. Poussez doucement le piston de la seringue remplie avec des lipides à la seringue vide. Selon la concentration de lipides, ce sera difficile à faire accepter. Répétez 20 x.
  6. Retirer le bloc chauffant de l’extrudeuse entièrement assemblé. Lentement, retirez la seringue remplie de l’extrudeuse, n’oubliez pas de collecter des lipides qui peuvent écouler lors du retrait. Placez les liposomes dans une cuvette propre. Répétez les étapes à l’aide de 3,4 à 3,6 en polycarbonate 0,2 µm et 0,1 µm membranes.
  7. Créer une colonne de perle de 0,7 x 50 cm2 agarose réticulée avec ordre de séparation de 0,7-10 Mega Daltons (MDa) équilibrés dans du PBS. Ajoutez les liposomes et exécutez comme au point 1.6. Les fractions contenant des liposomes seront ont diminué de transmission de la lumière dans la gamme de 250 à 400 nm.
  8. Stocker les liposomes à 4 ° C et ne pas congeler.

4. le Flux de calcium surveiller l’Activation des lymphocytes B par les Liposomes antigéniques

  1. Euthanasier souris par le dioxyde de carbone (CO2) ou de surdose d’isoflurane, selon les modes opératoires normalisés institutionnels. Confirmer l’euthanasie de souris par dislocation cervicale.
  2. Stériliser les instruments chirurgicaux et les carcasses de souris à l’aide d’éthanol à 70 %. Utilisation 10 cm de long, extrémité de 0,8 mm, curved forceps iris pour séparer la peau recouvrant la cavité thoracique de la cage thoracique. 10 cm de long, tout droit ciseaux de dissection permet de pratiquer une incision distale avec une incision bilatérale.
  3. Utiliser forceps iris incurvé et ciseaux de dissection pour extraire la rate de la cavité abdominale. Enlever du tissu graisseux qui entoure la rate et puis placez-le dans un tube conique en polystyrène de 15 mL, rempli de RPMI1640 moyen contenant sérum de veau foetal du 1 % (FCS) et de la pénicilline-streptomycine.
  4. Transfert rate et des médias sur un tamis de cellule de 40 µm, monté sur un tube conique de 50 mL. À l’aide de l’extrémité en caoutchouc d’un piston de seringue de 3 mL, écraser doucement de la rate. Lavez le tamis de cellule de 40 µm avec les médias. Répétez ce processus jusqu'à ce que seulement le tissu graisseux est laissé dans la passoire de cellule 40 µm. Rincer le tamis avec 3 à 5 mL de médias pour accroître la récupération de la cellule.
  5. Centrifuger l’homogénat de cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Après centrifugation, éliminer le surnageant et ajouter 10 mL de tampon de lyse 1 x RBC au culot. Pipette de haut en bas, laisser pendant 2 à 3 min à ta et puis centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
  6. Jeter le surnageant et remettre en suspension les globules rouges appauvri splénocytes dans 10 mL de médias. Déterminer le nombre total de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou autre cellule dispositif de comptage. Pellet les cellules par centrifugation, tel que décrit ci-dessus.
    Remarque : La concentration finale idéale nécessaire pour chargement Indo-1 des splénocytes est 10 – 20 x 106 cellules/mL, mais une concentration plus faible de cellules peut être utilisée.
  7. Remettre en suspension les splénocytes à 15 x 106 cellules/mL dans le flux de calcium chargement tampon (RPMI1640 milieu contenant 1 % FCS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic d’acide (HEPES), le chlorure de magnésium (MgCl2), 1 mM (1 mM) éthylène glycol-bis Éther de β-aminoéthyl)-N, N, N', N'-tétraacétique acide (EGTA) et 5 % la pénicilline-streptomycine). Ajouter à 1,5 µM Indo-1 d’une solution mère de DMSO de 1 mM, inverser le tube plusieurs fois pour mélanger. Protéger de la lumière et incuber les cellules au bain-marie à 37 ° C pendant 30 min.
  8. Après l’incubation de 30 min, ajouter 5 fois le montant du flux calcique, tampon de chargement. Centrifuger à 300 x g pendant 7 min à température ambiante.
  9. Pour le blocage sur les cellules B, tacher les cellules avec 1 : 200 anti-souris CD5-PE et 1 : 200 d’anti-souris B220-PE/Cy7 dans 0,5 mL de tampon à 4 ° C pendant 20 min, abri de la lumière de chargement.
  10. Laver les splénocytes dans le flux de calcium chargement tampon et centrifuger à 300 x g pendant 7 min à RT. remettre en suspension les cellules à 10 – 20 x 106 cellules/mL dans le flux de calcium tampon (Hank équilibré de solution saline (HBSS) contenant 1 % FCS, 1 mM MgCl2 et 1 mM chlorure de calcium (CaCl2)). Stocker sur ice, abri de la lumière jusqu’au moment d’exécuter le cytomètre en flux.
  11. Le programme d’installation cytométrie de flux avec des contrôles de tache non colorées et unique d’indemnisation.
    1. Exécuter les cellules colorées pour installer les portes correctement (voir la Figure 2 a). Installation Indo-1 (violet) par rapport à l’intrigue Indo-1 (bleu), de régler les tensions dans les canaux de l’Indo-1 pour placer les cellules à une pente de 45 à 60 ° pour optimiser le signal : bruit de la violette Indo-1 : bleue modification du rapport suite à la stimulation des lymphocytes B.
      Remarque : Assurez-vous que les tensions ne sont pas trop élevées, telle qu’un pourcentage important des cellules (> 5 %) sont contre la partie supérieure de l’intrigue.
    2. Créer un portail diagonal qui encapsule la partie supérieure gauche (Violet+bleu–) de l’intrigue, telle que sans stimulation < 10 % des cellules sont dans la porte, qui devrait idéalement passer à > 75 % suite à la stimulation.
  12. Ajouter 0,5 mL de cellules à un plafonnés 5 mL rond bas tube en polystyrène (activés par fluorescence cellulaire tri tube (FACS)) et chauffer les cellules à 37 ° C pendant 3 à 5 min dans un bain d’eau. Placer le tube de FACS dans la chambre de carter de 37 ° C qui est connectée à un bain d’eau recyclée.
    1. Exécutez le tube dans le water-jacket sur le cytomètre en flux et démarrer l’acquisition, sans stocker les données, à environ 5 000 – 10 000 événements/s. Une fois que les cellules sont stabilisées (15 à 30 s), lancer acquisition et collecter des données au moins 10 s pour établir le contexte.
    2. À la marque s 10, rapidement retirer le tube du cytomètre en flux, ajouter la stimulation (liposomes antigénique 5-50 mM en 2 – 20 mL), le vortex de l’impulsion et tube de FACS dans le cytomètre en flux de retour. Maintenir l’acquisition de données et le stockage par le biais de cette époque et collecter des données pendant 3 à 5 min.
  13. Analyser les données dans le logiciel d’analyse appropriée sous les fonctions de cinétique.

5. préparation de l’extrait d’arachide

  1. Extrait de protéines d’arachide en mélangeant la farine d’arachide dans un rapport 1:5 (wt:vol) en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 1 M de chlorure de sodium (NaCl). Mélanger la solution sur plaque magnétique remuez pendant 2 h à ta tout en maintenant à un pH de 8,5.
  2. Solution de centrifuger à 3 000 x g pendant 45 min à 4 ° C. Décanter et le filtre-stériliser surnageant séquentiellement à travers un filtre de 0,4 µm suivi d’un filtre de 0,2 µm. Déterminer la concentration de protéines de bicinchoninic acide (BCA) essai de l’albumine sérique bovine (BSA) comme la norme.
  3. Réduire et dénaturer un échantillon de protéines d’arachide avec 50 mM le dithiothréitol (DTT) dans un tampon contenant du dodécyl sulfate de lithium à un pH de 8,4, qui permet pour une activité maximale de l’agent réducteur et de la chaleur à 70 ° C pendant 10 min.
  4. Exécutez 10 µg de protéines d’arachide dénaturé sur un gel de polyacrylamide Bis-Tris 4 – 12 % precasted conçu pour donner la séparation optimale gel de gradient avec poids moléculaire pré-teint standard.
  5. Souillez le gel avec disulfonated triphénylméthane et décolorer avec FD2identification d’o. connu principaux allergènes d’arachide Ara h 1, 2 et 3 dans les préparations de l’extrait. Ara h 1 s’affiche à 63 kDa, Ara h 2 devrait apparaître comme deux isoformes à 17 et 19 kDa et Ara h 3 apparaît à 37 kDa (sous-unité acide).

6. sensibilisation des souris à arachide

  1. Remettre en suspension de la toxine cholérique 1 mg dans 1 mL d’eau ultrapure. Préparez 200 µL dilué extrait d’arachide contenant 2 mg de protéines d’arachides et de la toxine cholérique 10 µg dans du PBS.
  2. Administrer 200 µL de l’extrait d’arachide contenant choléra toxine (2 mg de protéines d’arachide et 10 µg de la toxine cholérique) par gavage oral dans chaque souris femelle de 4 – 5 semaines vieux BalB/cJ. Répéter une fois par semaine pendant trois semaines (c'est-à-dire les jours 0, 7 et 14).
  3. Administrer 300 µL dilué extrait d’arachide (contenant 5 mg de protéine d’arachide et 10 µg de la toxine cholérique) par gavage oral à chacune des souris dans la quatrième semaine (c.-à-d., jour 21).

7. challenge souris avec extrait d’arachide

  1. Le 28e jour, préparer un extrait d’arachide à une concentration finale de 1 mg/mL dans du PBS. Mesurer la température corporelle de base à l’aide d’un thermomètre rectal (environ 37,5 – 38,5 ° C). Administrer 200 µL (200 µg) d’extrait d’arachide par injection intrapéritonéale (i.p.).
  2. Mesurer la température corporelle avec thermomètre rectal toutes les 15 min pendant 1 h après l’injection. Un plongeon dans la température du corps indique allergie à l’arachide.
    Remarque : L’hypothermie est une caractéristique de l’anaphylaxie chez les souris. Ce défi démontrera que les souris sont allergiques à l’arachide. En général, 90 % des souris Balb/cJ qui subissent le protocole de sensibilisation développent des réactions allergiques pendant le défi caractérisé par au moins une baisse de température de 2 à 3 ° C.

8. isolement des splénocytes de souris allergiques et transfert adoptif

  1. Isoler les splénocytes de naïfs et souris allergiques aux arachides.
    1. Le jour 30, euthanasier fois naïf et souris allergiques aux arachides confirmées par l’administration de 3 L/min de CO2 dans une chambre à gaz. Confirmer l’euthanasie de souris par thoracotomie bilatérale. Stériliser les instruments chirurgicaux et les carcasses de souris à l’aide d’éthanol à 70 %. Utiliser les pinces pour séparer la peau recouvrant la cavité thoracique de la cage thoracique. Utiliser des ciseaux de dissection droites pour pratiquer une incision bilatérale briser les côtes gauche et droite.
    2. Utiliser les pinces et ciseaux de dissection pour extraire la rate de la cavité abdominale. Enlever du tissu graisseux qui entoure la rate avant de les placer dans le tube à fond conique polystyrène 15 mL, rempli de la moyen 10 mL RPMI 1640.
    3. Sous une hotte à flux laminaire stérile, versez rate et des médias dans un polystyrène de 35 mm boîte de Pétri. Garder naïf et allergiques splénocytes Pétri distinct et les médias lors de l’isolation de la cellule. Utiliser forceps stérilisé et dissection des ciseaux pour couper rate en trois morceaux et revenir à la boîte de Pétri.
    4. En utilisant le bord rugueux, givré de deux lames de verre, doucement homogénéiser (dans RPMI) les morceaux de rate jusqu'à ce que le tissu blanc reste entre les diapositives. Modifiez les diapositives entre les groupes.
    5. Transfert en cellule homogénat de Pétri à travers un tamis de cellule 70 µm monté sur un tube conique de 50 mL. Traverser les fragments restants de la rate la crépine avec un piston d’une seringue de 1 mL. Rincer le tamis avec 5 mL de RPMI à maximiser la récupération de la cellule. Transvaser le filtrat dans un tube conique de polystyrène 15 mL et centrifuger (450 x g, 10 min, RT).
    6. Aspirer le surnageant et ajouter le culot cellulaire remettre dans le tampon de lyse des globules rouges 2 mL (chlorure d’ammonium de 0,83 % dans un tampon Tris 10 mM, pH 7,2). Mélanger et laisser incuber à RT pendant 2 à 3 min. Ajouter 10 mL de PBS - 2 % FBS et centrifuger à 300 x g pendant 7 min à température ambiante.
    7. Laver les cellules encore avec 12 mL de PBS - 2 % FBS pour complètement supprimer n’importe quel chlorure d’ammonium résiduel et centrifuger à 300 g pendant 7 min à RT. remettre en suspension les cellules granule dans 2 mL de milieu RPMI 1640. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou analyseur automatique d’hématologie.
  2. À l’aide d’un G 27, aiguille 5/8 pouce sur une seringue de 1 mL insuline, injecter par voie intraveineuse 15 x 106 allergique ou naïf splénocytes extraites telle que décrite ci-dessus (dans 200 µL) via la queue veineuse dans souris naïves (sensibilis).

9. injection de souris avec les Liposomes antigéniques de Ara h 2

  1. Préparer Ah2 liposomes contenant 0,1 % Ah2 à lipides 2,5 mM. Pour le calcul de la concentration de protéines, le coefficient d’extinction de Ah2 est de 15 000 M-1. Diluer les liposomes à 300 µM dans du PBS stérile.
  2. Un jour après le transfert adoptif (31 jours) des allergiques ou naïf splénocytes, injecter par voie intraveineuse 200 µL de PBS ou les liposomes antigéniques Ah2 (300 µM) contenant un total de 1,38 mg Ah2 via la veine caudale des souris BALB/cJ qui a reçu les splénocytes à l’étape 8.2.

10. boost et le défi de la souris avec l’Ara h 2

  1. Deux semaines après l’injection avec les liposomes Ah2, jour 45, utilisez une lancette animaux de 4 mm pour recueillir 50 – 200 µL de sang de la jonction sous-maxillaire de la souris. Recueillir le sang dans un tube de séparateur de sérum sans héparine ; séparé du sérum par centrifugation à 6 000 x g pendant 15 min. Utilisez le sérum recueilli plus tard sur les anticorps antigène-spécifiques de mesure.
  2. Jour 46, deux semaines après l’injection de souris avec les liposomes (étape 9.2), Poussée souris par une injection intrapéritonéale de 200 µL de PBS ou 200 µg de Ah2 soluble (purifiée comme décrit plus haut16).
  3. Le jour 60, recueillir 50-200 µL de sang de la jonction sous-maxillaire de la souris et traiter le sang comme décrit plus haut.
  4. Jour 61, contester chaque groupe de souris avec une injection intrapéritonéale de 200 µL de 300 µg Ah2 soluble. Mesurer la température du corps avec sonde rectale toutes les 15 min comme dans l’article 7.

11. quantification des Ara h 2-specific IgE et IgG1 par ELISA

  1. Enduire un test de 96 puits immuno-enzymatique (ELISA)-plaque compatible avec 100µl HSA-DNP (2, 4-dinitrophényl haptène conjugué à l’humain de sérum albumine, 20 µg/mL) pour la courbe d’étalonnage ou Ah2 (5 µg/mL) pour les échantillons de sérum prélevés en étapes 10.1 et 10.3, dilué dans tampon de revêtement (tampon carbonate-bicarbonate de 50 mM, pH 9,6) à 4 ° C durant la nuit ou 37 ° C pendant > 1 h.
  2. Laver trois fois avec 200 µL de PBS-T (PBS avec 0,05 % Tween-20) et bloquer les puits avec 200 µL PBS-T contenant 2 % de BSA à 37 ° C pendant > 2 h.
  3. Pour ELISA d’IgE spécifiques Ah2, ajouter 50 normes de IgE-anti-DNP µL (2 – 0,002 µg/mL, préparé à partir de 1:2 dilutions en série) ou des échantillons de sérum de souris (01:20 dilution) et incuber une nuit à 4 ° C. Pour Ah2 spécifiques IgG1 ELISA, ajouter 100 µL purifiée normes IgG1-anti-DNP (2 – 0,002 µg/mL, préparé à partir de dilutions en série 1:2) ou (dilution 1/500) des échantillons de sérum de souris et incuber une nuit à 4 ° C ou 1 h à 37 ° C.
  4. Laver trois fois avec 200 µL de PBS-T. Pour ELISA d’IgE spécifiques Ah2, ajouter 100 µL mouton anti-souris IgE (0,5 µg/mL) et incuber à 37 ° C pendant 1 h. Pour Ah2 spécifiques IgG1 ELISA, ajouter 100 µL HRP chèvre anti-souris IgG1 (dilué 1:40,000 BSA PBS-T - 2 %). Incuber à 37 ° C pendant 1 h.
  5. Laver trois fois avec 200 µL de PBS-T. Pour les IgE spécifiques Ah2 ELISA, ajouter 100 µL biotinylé-Donkey anti-Sheep IgG (0,5 µg/mL) et incuber à 37 ° C pendant 45 min. Pour Ah2 spécifiques IgG1 ELISA, passez à l’étape 11,7.
  6. Laver trois fois avec 200 µL de PBS-T. Pour ELISA d’IgE spécifiques Ah2, ajouter 100 µL de manière neutre chargée la peroxydase de raifort-avidine (p. ex., neutravidine-HRP, 0,3 µg/mL) et incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  7. Ajouter 100 µL de 3, 3', 5, 5'-tétraméthylbenzidine (TMB) substrat, incuber 10-15 min ou jusqu'à ce que les échantillons tourner bleu foncé, puis ajouter 100 µL de solution de stop TMB. Lire la plaque à 450 nm.

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Résultats

Conjugaison de la protéine d’intérêt avec DSPE-PEG(2000) peut être démontrée en exécutant un réducteur montrant une augmentation poids moléculaire par rapport à la protéine non conjuguée. Figure 1 a montre un gel représentatif de conjugaison de anti-souris IgM F(ab) fragment de PEG-DSPE, qui montre un bandshift kDa de 2-3 pour la protéine dénaturée. Notez qu’environ 50 % des protéines semble être modifié, qui est attendu compte tenu du fait que la stoechiomét...

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Discussion

Les méthodes décrites ici sont un protocole général pour la conjugaison d’une protéine à un lipide qui permet l’affichage de la protéine sur les nanoparticules LIPOSOMALES. Pour les très grands plusieurs sous-unités protéiques, ce protocole peut avoir une utilité limitée. La méthode idéale serait l’introduction d’une balise spécifique au site qui permet une stratégie de liaison chimique établies à utiliser. S’exprimant la protéine inoculation, cela peut être possible à l’aide de stratégies spécifiques disponibles

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été financée par des subventions du ministère de la défense (W81XWH-16-1-0302 et W81XWH-16-1-0303).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Modèle 2110 Collecteur de fractionsBioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma grade 99 %
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
ExtrudeuseAvanti610000Seringue de 1 mL avec support/bloc chauffant
Filtres 0.1 µ ; mAvanti610005
Filtres 0.8 & micro ; mAvanti 610009
10 mm Supports de filtreAvanti6100014
Flacon en verre à fond rondSigmaZ100633
BouchonsThermo Fisher ScientificP-301398
Tube ThermoFisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Perles Sephadex G50GE Life Sciences17004201
Perles Sephadex G100GE Life Sciences17006001
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleurThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
1x tampon de lyse des globules rougesThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112sans calcium et magnésium
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anti-sourisIgM Jackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anti-sourisIgM Jackson ImmunoResearch115-006-020
Farine d’arachideGolden Peanut Co.52127112 % de matières grasses torréfaction légère, 50 % de protéines
Aiguilles d’alimentation animaleCadence Science792022g x 1,5", 1,25 mm - droite
Thermomètre à microsondePhysitempBAT-12
Sonde rectale pour sourisPhysitempRet-3
Toxine cholérique, de Vibrio choleraList Biological Laboratories, Inc.100BAzide free
BCA Protein Assay KitPierce23225
Tampon carbonate-bicarbonateSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxydase SubstratKPL5120-0077
96 puits Immulon 4HBX plaqueThermo Scientific3855
Soluble purifié Ara h 2N/AN/Apurifié comme dans : Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Souris IgE anti-DNPPrécis ChimiqueBYA60251
Mouton anti-sourisIgE Le site de liaisonPC284
Âne biotinylé anti-mouton IgG PrécisJNS065003
Protéine neutravidine, HRPThermoFisher Scientific31001
Souris IgG1 anti-DNPProduit chimique précisMADNP105
HRP Chèvre anti-souris IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL Seringues à insulineBD329412U-100 Insuline, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Superfrost Lames de microscopeFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1,0 mm
Tampon de lyse ACKgibco de Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Filtre à cellulesCorning35235070 &mu ; m Nylon, Blanc, Stérile, Emballé individuellement
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein GelsInvitrogenNP0322BOX10 gels
NuPAGE LDS buffer, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Pré-coloré standardInvitrogenLC5925500 µ ; L
NuPAGE MES/SDS tampon de fonctionnement, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL

Références

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