Article de méthode

Fabrication de dispositifs de réfraction-index-assortie de microfluidique biomédicale

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DOI :

10.3791/58296

⸱

10 septembre 2018

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2Huntsman Cancer Institute, University of Utah

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication des dispositifs microfluidiques de MY133-V2000 pour éliminer les artefacts qui se posent souvent en microcanaux en raison des indices de réfraction incompatible entre les structures de microcanaux et une solution aqueuse. Ce protocole utilise un support acrylique pour compresser l’appareil encapsulé, améliorant l’adhérence chimiquement et mécaniquement.

Résumé

L’utilisation de dispositifs microfluidiques a émergé comme un outil déterminant pour des applications biomédicales. Lorsqu’il est combiné avec des techniques de microscopie moderne, ces dispositifs peuvent être implémentées dans le cadre d’une plate-forme robuste capable de prendre des mesures complémentaires simultanées. Le défi principal créé par la combinaison de ces deux techniques est la disparité dans l’indice de réfraction entre les matériaux utilisés traditionnellement pour fabriquer des dispositifs microfluidiques et les solutions aqueuses généralement utilisées en biomédecine. Ce décalage peut créer des artéfacts optiques près des bords de canal ou le périphérique. Une solution consiste à réduire l’indice de réfraction du matériau utilisé pour fabriquer le dispositif à l’aide d’un polymère fluoré tels que MY133-V2000, dont l’indice de réfraction est similaire à celle de l’eau (n = 1,33). Ici, la construction d’un dispositif microfluidique fabriqué à partir de MY133-V2000 en utilisant des techniques de lithographie douce est démontrée, à l’aide de plasma2 O en conjonction avec un support acrylique pour augmenter l’adhérence entre le dispositif de MY133-V2000 fabriqué et la substrat de polydiméthylsiloxane (PDMS). L’appareil est ensuite testé en incubant il rempli de milieux de culture cellulaire pendant 24 heures afin de démontrer la capacité de l’appareil pour maintenir des conditions de culture cellulaire au cours d’une expérience d’imagerie typique. Enfin, la microscopie quantitative phase (QPM) est utilisée pour mesurer la distribution de masse dans les cellules vivantes adhérentes dans le microcanaux. De cette façon, la précision accrue, activée par la fabrication du dispositif d’un polymère de faible indice de réfraction tels que MY133-V2000 en remplacement de matériaux traditionnels Lithographie douce comme le PDMS, est démontrée. Dans l’ensemble, cette approche de fabrication des dispositifs microfluidiques peut être facilement intégrée dans les workflows existants de lithographie douce afin de réduire les artefacts optiques et augmenter la précision de mesure.

Introduction

Le développement d’une technologie microfluidique a permis un large éventail de nouvelles techniques biomédicales qui s’appuient sur la physique unique de flux à l’échelle microscopique1,2. Cela inclut les techniques diagnostiques construites sur des plateformes microfluidiques qui quantifient les biomarqueurs cliniquement pertinents, y compris la cellule rigidité3marqueurs de surface4et5de la croissance. En manipulant les cellules individuelles, Dispositifs microfluidiques permet également de mesurer l’hétérogénéité biomarqueur, par exemple comme un indicateur de malignité6. La possibilité de combiner des applications microfluidic microscopie a augmenté davantage l’utilité de ces plateformes en permettant à des appareils qui mesurent différents biomarqueurs simultanément7.

QPM est une technique de microscopie qui mesure le décalage de phase comme lumière traverse et interagit avec la matière à l’intérieur des échantillons transparents. La masse de cellules individuelles peut être calculée à partir des mesures QPM, en utilisant la relation connue entre l’indice de réfraction et la densité de biomasse8,9. Travaux antérieurs ont montré que QPM est capable de mesurer des paramètres cliniquement pertinents tels que la cellule croissance10,11 et cellule propriétés mécaniques par trouble force12. Lorsqu’il est combiné avec la microfluidique, QPM est potentiellement utilisable pour mesurer le comportement de cellules dans un milieu hautement contrôlé en vitro. L’un des principaux défis alliant QPM microfluidique est l’indice de réfraction élevé de la plupart des polymères utilisés pour construire la microfluidique canaux via Lithographie douce13.

Un défi important pour la combinaison de microfluidique avec diverses techniques de microscopie est le décalage entre l’indice de réfraction du matériau périphérique par rapport à l’indice de réfraction de l’eau14,15. Une méthode pour remédier à cette passe par l’utilisation d’un polymère de faible indice de réfraction tels que CYTOP16 ou MY133-V200013. Ce dernier est un fluorés ultraviolet (UV)-polymère acrylate DURCISSABLE qui a un indice de réfraction similaire à l’eau (n = 1,33) et qui est compatible avec des techniques de lithographie douce, permettant une intégration en douceur en microfluidique établie beaucoup processus de fabrication de dispositif. Ceci rend MY133-V2000 non seulement destinée à la fabrication de dispositifs microfluidiques, mais aussi lui permet d’être facilement combinés avec QPM et autres méthodes de microscopie, pour mesurer le comportement de cellules aussi bien dans la colonie et sur une échelle de cellule unique. MY133-V2000 élimine les artefacts en raison de la phase de déballage en produisant peu ou pas, décalage de phase comme lumière traverse l’interface eau-MY133.

Bien qu’éliminer les différences d’indice de réfraction, un des principaux défis associés avec les dispositifs fabriqués à partir de polymères fluorés, tels que MY133-V2000, sont la faible adhésion à d’autres matériaux comme le verre ou PDMS. Le présent travail montre la fabrication d’un dispositif de microfluidique de MY133-V2000 utilisant Lithographie douce. À l’aide de plasma2 O pour traiter la surface de la chaîne et le PDMS substrat combiné avec un support acrylique fabriqués sur mesure garantit que l’appareil respecte au substrat, créant un canal scellé. Cet appareil est adapté pour la culture cellulaire et QPM pour mesurer la masse des cellules dans le canal, qui a des applications importantes pour mesurer la croissance de cellules vivantes et le transport intracellulaire de biomasse cellulaire, qui ont tous deux la pertinence clinique de diagnostic médecine et découverte de médicaments.

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Protocole

1. fabrication du polydiméthylsiloxane négatif

  1. Préparation du polydiméthylsiloxane
    1. Mesure 18 g d’élastomère de silicone PDMS et 1,8 g de réactif au durcissement. Versez le durcissement réactif dans un bateau mesure contenant l’élastomère.
    2. Mélanger l’élastomère et le réactif de polymérisation vigoureusement pendant 1 min et mettre le mélange dans une chambre à vide pendant 30 min.
    3. Retirer les PDMS de l’aspirateur, versez 15 g sur le négatif à l’aide d’un emporte-pièce (rayon = 3,8 cm) pour éviter le PDMS en cours d’exécution sur le côté et couvrir le reste du mélange PDMS.
    4. Mettre le moule contenant le PDMS dans la chambre à vide pendant 10 min.
    5. Enlever le moule contenant les PDMS de la chambre à vide, placez-le sur une plaque de cuisson a 150 ° C pendant 60 min à guérir et le couvrir avec du papier aluminium.
    6. Verser le PDMS restant sur un verre inversé Pétri (10 cm de diamètre), en utilisant un autre emporte-pièce comme un moule, pour créer un bloc de PDMS. Mettre cela dans la chambre à vide jusqu'à ce que le négatif PDMS est complètement guéri.
    7. Transférer la boîte de Pétri avec le PDMS de l’aspirateur à la plaque de cuisson préchauffée à guérir à 150 ° C pendant 60 min.
  2. Traitement de surface de plasma de polydiméthylsiloxane
    1. Insérer une lame de rasoir sous le PDMS et l’emporte-pièce pour retirer délicatement les PDMS de négatif.
    2. Utiliser un couteau pointu passe-temps pour découper le négatif de la plus grande pièce du PDMS ; elle doit être coupée avec suffisamment d’espace mémoire tampon pour fixer une autre pièce du PDMS dessus sans entraver le négatif.
    3. Insérer une lame de rasoir sous le PDMS durci avec le négatif pour retirer délicatement les PDMS de la boîte de Pétri.
    4. Utiliser un couteau hobby pour découper un morceau de PDMS du pad c’est la même taille que le morceau coupé pour la négative. Ensuite, couper un rectangle de la nouvelle pièce de PDMS avec assez de pièce pour s’adapter autour des microcanaux lorsqu’il est posé sur le négatif.
    5. Placez les deux pièces du PDMS (le négatif et le rectangle) sur un substrat plat (par exemple une lame de verre, quartz, polystyrène ou autre matériau) et insérez-les dans un plasma de radiofréquence (RF) nettoyant. Fermer la porte et sceller la chambre en évacuant l’air à l’aide d’une pompe à vide. Injecter l’air jusqu'à une pression de 400 mTorr à l’aide d’un contrôleur numérique de pression sous vide.
      Remarque : Si le substrat utilisé pour le nettoyage de plasma n'a pas été utilisé dans le plasma nettoyant, mettez-la dans le plasma nettoyant par elle-même pour 60 avant de s pour traiter le négatif, afin d’éviter que la couche de base acrylique d’adhérer au substrat.
    6. Activer le paramètre RF à haute, et un plasma air rose doit apparaître dans la fenêtre d’affichage. Plasma-traiter les deux morceaux de PDMS pendant 30 s, puis désactiver le paramètre de RF. Laisser l’air entrer lentement la chambre afin d’empêcher un flux d’air turbulent de dérangeant le contenu de la chambre.
    7. Retirez le PDMS du plasma nettoyant et posez-le sur une table de travail. Puis, soigneusement inverser le rectangle PDMS sur le négatif et l’enfoncer avec une paire de pinces. Laisser reposer pendant 10 min permettre les deux morceaux de PDMS d’adhérer les uns aux autres.
  3. Traitement de surface FLUOROSILANE de la polydiméthylsiloxane négatif
    1. Utiliser un compte-gouttes pour mettre 2 gouttes de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluoro-octyl) silane (PFOTS) dans un petit peser le bateau et l’insérer dans une chambre sous vide du verre.
    2. Inverser le PDMS sur un morceau de papier d’aluminium (de sorte que le négatif de microcanaux fait face vers le haut) et mettez-la dans la chambre sous vide du verre. Puis, évacuer la chambre en continu pendant 24 h.

2. fabrication de la MY133 Microchannel

  1. Formant la structure de microcanaux MY133-V2000
    1. Remplissez le PDMS négative de 400 µL de MY133-V2000.
      Remarque : Le négatif doit être légèrement a fait déborder.
    2. Placer le PDMS rempli MY133-V2000 négatif dans la chambre à vide pendant 2 h enlever les bulles.
    3. Retirer MY133-V2000 de l’aspirateur et appuyez lentement sur une lame de verre sur le dessus du peu trop négatif pour créer une surface plane de MY133-V2000 et pour empêcher l’oxygène d’inhiber la polymérisation.
      NOTE : PDMS, à la surface du canal, partiellement inhibe la polymérisation, permettant la liaison dans les stades avancés. La lame de verre a une transparence légèrement réduite des UV (35 %) par rapport au quartz, ce qui contribue à prévenir tout jaunissement du dispositif durci.
    4. Insérez MY133-V2000 dans un four UV W 400, puis affectez-lui le rayonnement UV 50 % de l’intensité maximale de 300 s pour guérir le microcanaux MY133-V2000.
      Remarque : La longueur d’onde du pic utilisé pour guérir l’appareil est environ 375 nm avec une bande passante d’environ 25 nm. Environ 4 500 mJ/cm2 de puissance a été utilisée pour guérir le microcanaux, qui est un peu plus que doubler le minimum puissance recommandée par le fabricant de polymérisation.
  2. Construire le support acrylique
    1. Dessiner la couche de base acrylique à l’aide d’un logiciel de dessin vectoriel. Assurez-vous que la couche de base est un rectangle qui est de 1,5 mm d’épaisseur, 75 mm de long et 25 mm de large, avec un rectangle centré qui mesure 25 x 11 mm.
    2. Dessiner la couche intermédiaire acrylique à l’aide d’un vecteur, logiciel de dessin. Assurez-vous que la couche intermédiaire est un rectangle (épaisseur 1,5 mm, 75 mm de long et 25 mm de large) avec un carré centré (5 x 5 mm) et deux cercles (à la fois avec un diamètre de 3 mm) séparées par 15 mm.
    3. Dessiner la couche acrylique à l’aide d’un vecteur, logiciel de dessin. Assurez-vous que la couche supérieure est un rectangle (3 mm d’épaisseur, 30 mm de long et 25 mm de large) avec un carré centré (5 x 5 mm) et deux cercles (à la fois avec un diamètre de 3 mm) séparées par 15 mm.
    4. Découper les conceptions de dispositif créées dans le logiciel de dessin vectoriel avec un coupe au laser. Utilisez l’exemple de paramètres de vitesse de puissance et 30 % de 100 %. Exécutez le programme deux fois pour s’assurer que l’acrylique est découpé.
    5. Touchez les trous dans la couche supérieure acrylique à l’aide d’un outil de 0,80 mm taraudage M5 taille.
    6. Essuyer les morceaux en acrylique avec de l’acétone pour enlever les marques résiduelles ou des brûlures.
  3. Collage de MY133-V2000 dans le support acrylique
    1. Fixez la couche de base de l’acrylique sur le substrat de verre à l’aide d’un adhésif, tels que les super colle cyanoacrylate. Placer deux petites gouttes sur les bords de l’acrylique, puis utilisez un outil disponible pour diffuser uniformément la colle. Placer le substrat de verre sur l’acrylique et laisser la colle sécher en utilisant le poids du verre pour maintenir en place.
    2. Enduire la surface du verre avec 100 µL de PDMS à l’aide d’une pipette volumétrique ; Ensuite, insérez le calque de base dans une coucheuse spin vide et définissez-la à 1 500 tr/min pendant 2 min enrober uniformément le verre avec un film PDMS environ 10 µm épais.
    3. Retirer la couche de base la coucheuse spin et soigneusement essuyer tout excès PDMS qui enduit l’acrylique avec l’acétone et papier essuie-tout. Veillez à ne pas déranger le PDMS non polymérisée.
    4. Cuire au four de la couche de base avec le PDMS dans un four à 65 ° C pendant 2 h pour guérir le PDMS.
    5. Pipette 1 mL de PDMS sur une lame de verre et, ensuite, utiliser une autre lame de verre pour répartir uniformément le PDMS jusqu'à ce qu’elle commence à suinter les côtés. Guérir cela sur une plaque de cuisson à 150 ° C pendant 10 min.
    6. Couper le PDMS durci en un rectangle avec les mêmes dimensions que le dispositif MY133-V2000 et, ensuite, à l’aide de la couche intermédiaire de l’acrylique comme un moule, percer des trous pour le réservoir et découper un carré en affichant la fenêtre dans le PDMS pour faire le joint PDMS.
    7. Placez le MY133-V2000, le côté du chenal, sur le même ou un substrat plat similaire que celui utilisé pour le traitement plasma le PDMS à l’étape 1.2.5. Placez la couche de base acrylique contenant le substrat PDMS durci aux côtés de la chaîne de MY133-V2000 dans le plasma de2 O nettoyant. Réglez la pression sous vide sur 200 mTorr et le RF niveau à haute et surface-traiter le substrat canal et verre pour 30 s.
    8. À l’aide de pinces, placer immédiatement le canal MY133-V2000 incliné dans le rectangle à découper de l’acrylique de la couche de base tels que le MY133-V2000 en contact avec le PDMS.
    9. Placer le joint PDMS sur le dessus de l’appareil MY133-V2000, en alignant les trous dans le joint avec les réservoirs de l’appareil.
    10. Placez l’appareil inachevé sur une plateforme surélevée au-dessus du banc pour fournir une surface de serrage pour l’assemblage de l’appareil.
    11. Extrait de 3 mL de ciment acrylique à l’aide d’une seringue. Distribuer suffisamment ciment acrylique sur le dessus de la couche de base pour fournir une couche mince. Faire le manteau comme même que possible et ne pas laisser le matériel puisser dans le canal.
    12. Placer l’éprouvette acrylique de couche intermédiaire sur le dessus de l’acrylique de la couche de base. Assurez-vous que les trous s’alignent les réservoirs du canal MY133-V2000.
    13. Utiliser 3 petites pinces pour tenir la couche de base et milieu couche ensemble aussi serré que possible pendant 2 min alors que le ciment acrylique durcit, pour coller les pièces ensemble en acrylique. S’assurer que les réservoirs ne sont pas obstrués pendant cette étape pour éviter que l’air soit emprisonné sous le dispositif MY133-V2000.
    14. Retirez la pression de l’appareil et placer le ciment acrylique sur la couche intermédiaire aux endroits de contact prévu avec la couche supérieure de l’acrylique.
    15. Placez la couche supérieure de l’acrylique sur le morceau de couche intermédiaire de l’acrylique, en veillant à ce que les trous soient alignés avec les réservoirs et laissez-le reste sur le banc pendant 2 min pendant que le ciment acrylique sèche.

3. essais et l’utilisation de l’appareil MY133-V2000

  1. Test de fuite
    1. Tester le dispositif MY133-V2000 en ajoutant 10 µL de colorant alimentaire ou de l’eau déionisée dans un des trous de réservoir pour tester l’adhérence et le débit.
    2. Insérer un tube (d’un diamètre extérieur 1/8 po) dans le réservoir et branchez l’autre extrémité à un piège sous vide. Tournez le vide à tirer la teinture ou l’eau à travers le canal pour s’assurer qu’un dispositif réussi est créé.
    3. Vérifier au microscope pour vérifier qu’il n’y a pas de fuites dans le canal ou le réservoir, remplir le réservoir avec de l’éthanol et permettre à l’éthanol siéger à la température ambiante pendant 10 min. Ensuite, tirez sur l’éthanol en utilisant le vide, pour nettoyer la teinture ou l’eau du chenal.
    4. Le canal de pulvérisation avec de l’éthanol et mettez-la dans un récipient stérile de polystyrène. Envelopper hermétiquement avec parafilm et stockez-la dans un environnement stérile jusqu'à ce que nécessaire.
      Remarque : À ce stade, l’appareil doit être manipulé aseptiquement afin d’éviter toute contamination. Lorsque vous êtes prêt à utiliser l’appareil, l’extérieur du conteneur doit être stérilisé à l’éthanol et présentée dans une coffret avant d’ouvrir le conteneur de biosécurité.
  2. Cellules MCF7 bordé dans le dispositif MY133-V2000
    1. La croissance de cellules MCF7 sur des plats de Pétri de 10 cm dans un média complet consistant indispensable milieu minimum de Dulbecco (DMEM), additionné de sérum de veau fœtal 10 %, la pénicilline-streptomycine, glutamine et acides aminés non essentiels, dans un incubateur de culture cellulaire qui maintient une atmosphère humide contenant 5 % de CO2 et 20 % O2 à une température de 37 ° C. Atteindre les cellules avant de les semer dans le microcanaux environ 80 % de confluence.
    2. Tout d’abord, vaporiser le polystyrène plat contenant le microcanaux avec l’éthanol à 70 %. Ensuite, aligner sur la biosécurité armoire avant de retirer le parafilm protéger le canal de l’environnement ambiant de laboratoire.
    3. Immobiliser fibronectine dérivés du plasma-homme sur la surface de microcanaux en diluant il dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) à 10 µg/mL. Ensuite, injecter 20 µL de cette solution dans le canal et il incuber à 20 ° C pendant 45 min.
    4. Lavez la solution de la fibronectine sorti du chenal en injectant 20 µL de milieux de culture cellulaire dans le canal et laisser incuber à 20 ° C pendant 10 min.
    5. Laver les cellules avec 10 mL de SPD et trypsinize les cellules en ajoutant 1 mL de trypsine 1 x. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 7 min. neutraliser la trypsine avec 9 mL de médias complet.
    6. Injecter 20 µL de cellules dans le canal et les incuber à 37 ° C pendant 45 à 120 min permettre la fixation au substrat avant l’imagerie.

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Résultats

Ce protocole décrit la fabrication de MY133-V2000, un polymère fluoré avec un faible indice de réfraction correspondant à celle de l’eau. Un élément clé de ce protocole est de savoir comment surmonter le manque d’adhérence qui est caractéristique des polymères fluorés à l’aide de plasma d’oxygène et de fabrication du dispositif dans un support acrylique pour fournir la force mécanique supplémentaire nécessaire pour assurer l’étanchéité du canal contre le substrat PDMS (

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Discussion

MY133-V2000 peut être utilisé comme une alternative aux matériaux de fabrication de la lithographie douce traditionnelle comme le PDMS. Travaux antérieurs ont démontré que les matériaux ayant un indice de réfraction élevé, comme le PDMS, introduisent artefacts importants près des murs du canal en raison de l’indices de réfraction incompatible entre le matériau de fabrication et de la solution aqueuse à l’intérieur du canal 13. MY133-V2000 permet correspondant à l’indice de réfraction du dispositif...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Université de l’Utah, Bureau du vice-président pour la recherche, ainsi que par des fonds en collaboration avec grant P30 CA042014, attribué à l’Institut de Cancer de Huntsman et au programme à l’Institut de Cancer de Huntsman CRR.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MY133-V2000MY PolymèresMY133-V2000
Sylgard 184Ellsworth Adhésifs184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Lames de microscope Fisher PremiumFisher Scientific12-544-4.118
"(3.0mm) x 12 » x 12 » Feuille acryliqueUnited States Plastic Corp44290.060
"(1.5mm) x 12 » x 12 » Feuille acryliqueUnited States Plastic Corp44200
SCIGRIP 3 Ciment acrylique à prise très rapideUnited States Plastic Corp45735
Feuille d’aluminium standard (.6 mm d’épaisseur)VWR89107-726
Kim WipesFisher Scientific06-666
Insta-Cure+ Super GlueBob Smith IndustriesBSI-109
1/8" Tube en PVCMcMaster Carr5231K55
McCormick Colorant alimentaireTarget13353207
X-Acto #1 Couteau de précisionX-ActoX3201
X-Acto #18 Lame de ciseau à bois épaisX-ActoX218
VWR Lames de rasoirVWR55411-055
Plats de culture cellulaire traités en surfaceFisher ScientificFBO12922
Fibronectin Plasma HumainSigma-AldritchF0895-1MG
Trypsine-EDTA 10xFisher Scientific15-400-054
Corning Dulbecco’s Phosphate Tamponné SalineFisherScientific MT21030CM
Gibco Pénicilline-StreptomycineFisher Scientific15-140-148
HyClone Acides aminés non essentiels 100xFisher ScientificSH3023801
Sérum fœtal bovinOmega ScientificFB-12
Corning DMEM avec L-glutamine et glucoseFisher ScientificMT10013CV
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma-Aldritch448931Réagit violemment avec l’eau
Éthanol, 200 proof Decon LabsFisher Scientific04-355-223
AcétoneFisher ScientificA18P-4
Bel-Art 42025 Dessicator en plastiqueCole-ParmerEW-06514-30
Epilog Fusion Laser Cutter, 120 WEpilog LaserEpilog Fusion M2 32 Laser
Isotemp Stir HotplateFisher ScientificSP88850200
Ateco 14111 Découpeur en acier inoxydable de 1,5 pouceAteco14111
Plat de culture cellulaire en verre PyrexFisher Scientific08-747B
Nettoyeur de plasma à radiofréquenceHarrick PlasmaPDC-32GUtilisé avec de l’oxygène gazeux
Black Hole Laboratories DigivacBlack Hole LaboratoriesModèle 215
Four ultraviolet Intelli-RayUvitronUVO338
Compact Spin CoaterMTI CorporationVTC-100A
Fisher Brand Isotemp OvenFisher Scientific15-103-0510convection forcée
P1000Fisher ScientificFD10006G
HeraCell VIOS 160iFisher Scientific13 998 212PM
Pipette à déplacement positif Gilson à

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Mots-clés

Adaptation de l indice de r fractionFabrication de dispositifs microfluidiquesTechniques de lithographie doucePolym re MY133 V2000Traitement au plasma d oxyg neMicroscopie quantitative contraste de phaseCollage de substrats en PDMSAssemblage du support acryliqueCompatibilit avec la culture cellulaireR duction des art facts optiques

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