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Article de méthode

Analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et sécrétion

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DOI :

10.3791/58308

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25 août 2018

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1Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Hunter Medical Research Institute, 3Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, 4School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

Dans cet article

Résumé

Nous rapportons ici, la localisation de l’immunofluorescence de dynamine pour illustrer les protocoles pour la détection des protéines dans les sections dans l’épididyme de paraffine souris et ceux d’une lignée de cellules épididymaires immortalisé (mECap18). Nous décrivons également les protocoles pour l’isolement des protéines sécrétoires du fluide épididymaire et milieux cellulaires conditionné.

Résumé

L’épididyme mammifères génère l’un des fluides intraluminal plus complexes de toute glande endocrine afin de favoriser la maturation post-testiculaire et le stockage des spermatozoïdes. Une telle complexité se pose en raison de l’activité combinée de sécrétion et d’absorption des paroi des cellules épithéliales. Nous décrivons ici les techniques pour l’analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et de la sécrétion en mettant l’accent sur la famille de protéine modèle de dynamine (DNM) mechanoenzymes ; grand GTPases qui ont le potentiel pour réglementer les événements trafic bidirectionnel membrane. Pour l’étude de l’expression des protéines dans les tissus dans l’épididyme, nous décrivons une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections de paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines via la microscopie en immunofluorescence. Nous décrivons également méthodologie optimisée pour l’isolement et la caractérisation de l’exosome comme des vésicules, appelée epididymosomes, qui sont sécrétés dans la lumière dans l’épididyme de participer à la communication intercellulaire avec la maturation des spermatozoïdes. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules épithéliales dans l’épididyme (mECap18) souris SV40-immortalisé caput. En outre, nous discutons de l’utilité de la lignée cellulaire de mECap18 comme un modèle approprié in vitro permettant d’étudier la régulation de l’activité sécrétrice épididymaire. À cette fin, nous décrivons les exigences de culture pour le maintien de la lignée cellulaire de mECap18 et de l’utilisation des schémas d’inhibition pharmacologique sélective qui sont capables d’influer sur leur profil de protéine sécrétoire. Ces derniers sont facilement évalués par le biais de la cueillette de milieu de culture conditionné, la concentration des protéines sécrétées par l’intermédiaire de précipitation de l’acide trichloroacétique et d’acétone et leur analyse ultérieure par SDS-PAGE et immunoblotting. Nous croyons que ces méthodes combinées sont adaptés pour l’analyse des protéines épididymaires autres cibles comme un prélude à déterminer leur rôle fonctionnel dans la maturation des spermatozoïdes et/ou de stockage.

Introduction

Les spermatozoïdes de toutes les espèces mammifères acquièrent la possibilité d’afficher la motilité progressive vers l’avant et de féconder un ovule durant leur descente prolongée par le biais de l’épididyme, une région hautement spécialisée du système conduit extra testiculaire mâle, qui peut prendre de 7 à 14 jours pour naviguer (selon les espèces)1. En raison de l’extrême condensation de la chromatine paternelle et l’effusion de la majorité du cytoplasme qui accompagne la cytodifférenciation des spermatozoïdes dans les testicules, leur maturation fonctionnelle ultérieure est conduite exclusivement par leur interaction avec le microenvironnement dans l’épididyme. Ce milieu est, à son tour, créé par l’activité de sécrétion et d’absorption du soma épididymaire doublure et affiche un niveau exceptionnel de segment segment variante1. Ainsi, les segments plus actifs sur le plan de la synthèse des protéines et la sécrétion sont celles qui sont situées dans la partie proximale de l' épididyme (à savoir, le caput et corpus)2. Cette activité reflète le profil fonctionnel des spermatozoïdes, avec le début de premières cellules pour afficher les caractéristiques de compétence fonctionnelle (i.e., motilité progressive et la capacité de lier aux glycoprotéines acides solubilisée zona) suivant leur passage dans l' épididyme de caput3. Ces attributs fonctionnels continuent de développer avant d’atteindre un niveau optimal, comme les spermatozoïdes atteignent le segment distal dans l’épididyme (cauda), dans lequel ils sont stockés dans un état de repos dans la perspective de l’éjaculation. La formation et le maintien de ce réservoir de stockage de sperme est aussi intimement liée à l’épithélium de la muqueuse, qui dans la cauda est dominé par la forte activité absorbante4,5. Bien que les différences anatomiques ont été déclarés6,7,8, ce régionalisé division du travail semble être une caractéristique de l’épididyme qui est partagé par la majorité des espèces de mammifères étudiés à ce jour, y compris notre propre9,10. En effet, d’un point de vue clinique, il est connu que la dysfonction épididymaire apporte une contribution importante à l’étiologie du facteur masculin infertilité11, mettant ainsi en évidence l’importance de comprendre la régulation de ce tissu spécialisé.

Il est donc regrettable que notre compréhension de la physiologie dans l’épididyme et les mécanismes qui régulent les phases séquentielles de la maturation des spermatozoïdes et de stockage au sein de ce tissu, restent à être entièrement résolus. Parmi les facteurs contributifs, limitantes avancées de la recherche dans l’épididyme sont la complexité globale de ce tissu et la connaissance des mécanismes qui exercent un contrôle réglementaire sur son microenvironnement luminale. Anatomiquement, nous savons qu’au-delà de la distinction des segments caput, corpus et cauda, l’épididyme peut être subdivisé en plusieurs zones (Figure 1 a), chacune séparées par des septa12 et caractérisée par des profils distincts de gènes/protéines expression13,14,15,16,17,18. En effet, sur la base de profilage détaillées transcriptionnelle segmentaire d’expression de gène dans l’épididyme, comme 6 et 9 zones épididymaires distinctes ont été signalés dans les modèles de souris et le rat, respectivement19,20. Une telle complexité sans doute reflète la composition de l’épididyme soma, un épithélium pseudostratifié comprenant de nombreux types de cellules différents ; chaque diffèrent en ce qui concerne leurs activités d’abondance, la distribution et sécrétoire/absorption le long des voies. Ainsi, les cellules principales sont de loin le plus abondant des cellules épididymaires type constituant plus de 80 % de toutes les cellules épithéliales. En conséquence, cellules principales sont responsables de la majeure partie des protéines épididymaires la biosynthèse et la sécrétion5. En revanche, la population de cellules claires, qui comptent comme le type de cellule deuxième plus abondant dans le soma épididymaire, est principalement liée à l’absorption sélective des composants luminales et l’acidification de ce micro-environnement5. Ajoutant une autre couche de complexité, androgènes et autres facteurs de lumicrine d’origine testiculaire exercent un contrôle différencié sur chacun de ces types de cellules épididymaires selon leur positionnement le long du tractus.

Malgré les limitations imposées par une telle complexité, des percées significatives continuent d’être déployés en résoudre la base mécaniste de la fonction épididymaire. Des clés de ces études a été l’application de stratégies avancées spectrométrie de masse à établir des inventaires à grande échelle du protéome dans l’épididyme, en tandem avec des analyses détaillées des protéines individuelles choisis parmi ces enquêtes initiales. Une illustration de cette approche est notre caractérisation récente de la famille DNM de mechanoenzymes dans la souris modèle21. Notre intérêt initial en DNM a été alimentée par sa double action dans l’accouplement d’exo - et processus de l’endocytose. S’appuyant sur ces observations, nous avons pu démontrer que les trois isoformes canoniques de DNM (DNM1 - DNM3) sont fortement exprimés dans l’épididyme de souris et convenablement positionnés pour s’acquitter des rôles régulateurs dans la sécrétion de protéines et l’absorption21 . En outre, nous avons pu clairement différencier chaque isoforme DNM sur la base de leur localisation cellulaire et subcellulaire, suggérant ainsi qu’ils possèdent complémentaires, par opposition aux activités redondantes, au sein de l' épithélium épididymaire21.

Nous décrivons ici la méthodologie expérimentale employée pour l’étude de l’expression DNM dans l’épididyme de souris avec l’espoir que cette information va trouver une application plus large dans la caractérisation de protéines épididymaires alternatifs et ainsi contribuer à notre compréhension de la fonction de cet élément important du système reproducteur masculin. Plus précisément, nous décrivons l’élaboration d’une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections épididymaires paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines par immunofluorescence microscopie. On trouvera plus loin nos protocoles récemment optimisé22 pour l’isolement et la caractérisation des epididymosomes ; petites vésicules exosome-like qui constituent des éléments essentiels du profil épididymaire sécrétoire et semblent tenir un rôle important dans la promotion de maturation des spermatozoïdes23. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules immortalisées souris caput épithélium épididymaire (mECap18) et l’utilisation de cette ressource comme un modèle pour explorer la régulation de l’épididyme in vitrode l’activité sécrétoire.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales portant sur la collection de tissus d’origine animale ont été approuvés par de l’Université de Newcastle et protection des animaux et Comité d’éthique.

1. immunofluorescence souillant des Sections paraffine dans l’épididyme (Figures 1 et 2)

  1. Immédiatement après l’euthanasie de souris adultes par inhalation de CO2 (souris Swiss, âgé de plus de 8 semaines), soigneusement disséquer l’épididyme (à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux) recouvrant de tissu conjonctif et graisse et s’immerger dans le fixateur de Bouin solution (> poids volume/tissu dix fois) pour la fixation au jour le jour.
  2. Laver le tissu avec l’éthanol à 70 % avec 2 × changements par jour pendant 2 jours et puis déshydrater par graduée éthanol (70 %, 95 % et 100 %) en vue de l’infiltration et l’incorporation dans un bloc de paraffine.
  3. Les blocs de paraffine sur une épaisseur de 4-6 µm et monter sur les diapositives en préparation pour immunofluorescence souillant l’article.
  4. Sous une hotte, déparaffinage les sections de paraffine épididymaire en ajoutant une quantité suffisante de xylène dans le récipient de diapositive pour immerger complètement la section tissulaire (3 × 5 min chaque fois).
  5. Réhydrater les sections de tissu par l’immersion dans des solutions graduées éthanol dilué dans purifiée H2O (100 % éthanol 5 min, 100 % éthanol 5 min, 90 % éthanol 1 min, 1 min, éthanol à 70 % éthanol à 80 % 1 min et 50 % d’éthanol 1 min).
  6. Laver les sections dans un bocal de glisser une fois pendant 5 min avec du sérum physiologique tamponné au phosphate suffisante (PBS) à immerger complètement la section tissus ensemble (suivez ces instructions pour tous les lavages ultérieurs).
  7. Décanter la solution de l’antigène approprié (i.e., 10 mmol/L sodium citrate, 50 mmol/L de Tris pH 10,5 ou solutions de récupération antigène alternative, selon l’antigène à détecter) dans une grille coulissante et micro-ondes jusqu'à ébullition. Plonger les lames dans cette solution et sous réserve des coupes de tissus conditions de récupération de chaleur induite par l’antigène optimisées pour chaque anticorps (voir tableau 1).
    ATTENTION : Veiller à ce que les lames sont complètement immergés dans la solution de l’antigène au cours du processus de récupération de l’antigène.
  8. Retirez le récipient de diapositive du micro-ondes et refroidir à température ambiante.
  9. Rincer les lames avec du PBS et utiliser un marqueur liquide hydrofuge diapositive à tracer autour de la section de tissu.
  10. Déposer les lames dans un conteneur humidifié (créé par un tissu humidifié à la base du récipient) et d’appliquer la solution de saturation (3 % BSA/PBS, préalablement filtré à travers un filtre de 0,45 µm) pendant 1 h à 37 ° C.
  11. Rincer les lames une fois avec du PBS.
  12. Incuber les sections avec l’anticorps primaire approprié diluée à une concentration expérimentalement optimisée dans filtrée 1 % BSA/PBS à 4 ° C durant la nuit (1/60 pour anti-DNM1, DNM2 et DNM3 des anticorps ; 1/100 pour les anticorps anti-ATP6V1B1, voir Table des matières pour les détails d’anticorps).
    Remarque : Pour distinguer spécifiques de liaison de l’anticorps non spécifiques, il est nécessaire d’inclure les résultats négatifs sévères (i.e., anticorps secondaire primaire, seul anticorps preabsorbed contre la vaccination peptidique) et les témoins positifs24.
  13. Réchauffer les diapositives en plaçant à température ambiante pendant 30 min.
  14. Laver le × diapositives 3 avec du PBS sur une plate-forme vibrante (60 t/mn) pour 10 min chacun.
  15. Incuber les sections avec des anticorps secondaire approprié, dilué à 1 % BSA/PBS (filtré par un filtre de 0,45 µm) à 37 ° C pendant 1 h (dilution 1 : 400 pour tous les anticorps secondaires, voir la Table des matières anticorps).
    ATTENTION : Garder le conteneur de la diapositive dans le noir de cette étape à partir. Pour l’étiquetage double, choisir une combinaison compatible d’anticorps secondaires (i.e., Anticorps secondaires doivent ont été soulevées dans différentes espèces).
  16. Laver le × diapositives 3 avec du PBS sur une plate-forme vibrante (60 t/mn) pour 10 min chacun.
  17. Contre-coloration les sections avec l’iodure de propidium (PI, 7.48 μmol/L) ou 4΄, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 4,37 μmol/L) pendant 2 min à température ambiante pour étiqueter le noyau de la cellule.
  18. Laver les lames deux fois avec du PBS sur une plateforme vibrante (60 t/mn) de 5 min chacun.
  19. Monter les sections 10 % Mowiol 4-88 préparé dans une solution de glycérol à 30 % à 0,2 mol/L Tris (pH 8,5) et 2,5 % 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-indice d’octane.
  20. Sceller la lamelle avec du vernis à ongles et stocker les lames à 4 ° C pour l’observation future.
    ATTENTION : Il est recommandé d’effectuer l’imagerie des diapositives aussitôt que possible après la préparation pour éviter la perte excessive de la fluorescence.

2 isolation des Epididymosomes partir de l’épididyme Caput de souris (Figure 3)

  1. Immédiatement après l’euthanasie de souris adultes par inhalation de CO2 (souris Swiss âgé de plus de 8 semaines), perfuse leur vascularisation avec du PBS (préchauffée à 37 ° C) pour minimiser la contamination du sang des tissus dans l’épididyme.
    ATTENTION : le plasma sanguin contient diverses populations d’exosomes, qui sont de taille semblable à epididymosomes25. L’efficacité d’habilitation de sang provenant de tissus dans l’épididyme sont accessibles par l’intermédiaire de l’inspection du segment initial, un segment fortement vascularisé épididymaire situé proximal au segment caput (i.e., zone 1 dans la Figure 1 a)
  2. Disséquer attentivement l’épididyme libre de graisse sus-jacente et du tissu conjonctif et rinçage avec le milieu modifié Biggers, Whitten et Whittingham (BWW ; pH 7,4, osmolalité de 300 mmol/kg eau26,27) afin de réduire tout risque de surface contamination du sang.
  3. Épongez le tissu dans l’épididyme pour retirer les excès médiatique, disséquer l’épididyme caput (i.e., zones 2-5 dans la Figure 1 a) et le transfert à une boîte de Pétri fraîches (35 x 10 mm) contenant le support BWW. S’assurer que la quantité de médium est suffisante pour le rétablissement final.
    Remarque : Pour 6 caput épididymes, il est recommandé d’utiliser 1,1 mL du milieu afin de permettre une reprise de ~ 900 µL, qui est ensuite uniformément répartis et appliqué au sommet des 2 gradients préparés à l’avance (voir étape 2,9).
  4. Faire un certain nombre de petites incisions dans le tissu de caput avec une lame de rasoir. Ne pas découper le tissu et ainsi éviter la contamination de l’échantillon avec contenu cytosolique excessive. Incuber la plaque contenant le tissu avec une légère agitation à 37 ° C pendant 30 min libérer le contenu luminal.
  5. Filtrer la suspension obtenue par le biais de 70 µm membranes pour éliminer les débris cellulaires.
  6. Recueillir le filtrat et ceci sous réserve des étapes successives de centrifugation à 4 ° C, avec une augmentation de la vitesse afin d’éliminer les débris cellulaires (i.e., × 500 g, 2 000 × g, 4 000 × g, 8 000 × g, 5 min chacun ; 17 000 x g pendant 20 min et enfin 17 000 × g pour une supplémentaire de 10 min ou jusqu'à ce qu’aucune granule n’est formé après centrifugation).
    ATTENTION : Il est important d’évaluer la couleur de la pastille après la première étape de centrifugation 500 × g pour contamination minime de sang soit présente. Jeter tous les échantillons dans lesquels ce pellet affiche une coloration rose.
  7. Préparer des gradients d’iodixanol discontinu (formée de 40 %, 20 %, 10 %, 5 % couches) en diluant un milieu de gradient de densité (composée de 60 % (p/v) iodixanol aqueuse) avec une solution de saccharose 0.25 de mol/L et 10 mmol/L Tris (pH 7.5).
  8. Préparer le gradient dans un tube ultracentrifugeuse (11 × 35 mm), avec chacune des fractions de 450 µL (Figure 3). Inspecter visuellement le dégradé après l’application de chacune des fractions à veiller à ce que les interfaces sont correctement formés entre chaque couche avant le chargement de l’échantillon de fluide épididymaire. Préparer chaque frais dégradé le jour d’utilisation, cependant, l’échantillon de fluide épididymaire luminal peut être conservé à 4 ° C pendant 2 h avant l’embarquement.
  9. Ajouter avec précaution 450 µL d’épididymaire luminale suspension fluide (correspondant à la matière recueillie de la caput de 3 épididymes) au sommet d’un dégradé simple.
  10. Ultracentrifugeuse les gradients à 160 000 × g à 4 ° C pendant 18 heures.
    ATTENTION : Puisque cette centrifugation est réalisée à très haute vitesse, tous les tubes ultracentrifugeuse doivent être jumelés et équilibrés avec précision. Vérifier les tubes pour s’assurer qu’ils sont exempts de signes visibles de dommages susceptibles de compromettre leur intégrité.
  11. Retirer délicatement les 12 fractions égales (chacun composé de 185 µL) à partir de la couche superficielle et progressant vers le bas de la pente. Mettre en commun les fractions équivalentes extraite chaque dégradé, le cas échéant (jusqu'à deux gradients).
    Remarque : La souris epididymosomes sont plus fortement enrichi en fractions 9-11,22, voir Figure 4 et Discussion.
  12. Après la récupération et la mise en commun des fractions 9 – 11, diluer dans 2 mL de PBS et ultracentrifugeuse les échantillons à 100 000 × g à 4 ° C pendant 3 h (tube à 56 mm à × 13) pour granuler l’epididymosomes.
    ATTENTION : Puisque le culot d’epididymosome peut être difficile à voir, faire en sorte que l’orientation des tubes est remarquée qu’ils sont placés dans le rotor et marquent le tube pour indiquer la position future de la pastille d’epididymosome. S’assurer que chaque tube contienne un volume suffisant (i.e., dépassant 50 % de sa capacité totale) pour exclure le risque d’effondrement du tube.
  13. Aspirer avec précaution et éliminer le liquide surnageant sans déranger le culot d’epididymosome.
  14. Évaluer la pureté de l’epididymosome (Figure 4).
  15. Resuspendre le culot d’epididymosome dans un milieu désiré selon l’ou les applications en aval. Par exemple, BWW milieu est généralement utilisé pour les expériences impliquant la collaboration d’incubation avec spermatozoïdes ou, alternativement, un tampon de lyse appropriées en vue de la résolution du protéome épididymaire par SDS-PAGE.

3. immunofluorescence souillant des cellules mECap18

  1. Préparation de lamelles stérile (doit être effectuée sous une hotte de culture cellulaire)
    1. Faire tremper les lamelles couvre-objet (12 × 12 mm) dans l’éthanol à 70 % pendant 10 min et désinfecter par séchage à haute température au-dessus d’une lampe à l’éthanol.
    2. Cool la lamelle pour 10 s avant de les transférer sur une plaque bien 12.
    3. Appliquer une solution stérile de la poly-L-lysine pour couvrir la lamelle couvre-objet et se contenter de 10 min à température ambiante.
    4. Jeter la solution de la poly-L-lysine et rincer la lamelle avec stérile H2O ou échéant moyen.
  2. Cellules de mECap18 de préparation
    1. Passage les aliquotes de 2 × 105 mECap18 cellules dans chaque puits de la plaque bien 12 contenant les lamelles couvre-objet.
    2. Les cellules avec mECap18 cellule moyenne (DMEM additionné de 1 % L-glutamine, pyruvate de sodium 1 %, 1 % pénicilline/streptomycine et 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN 50 μmol/L) contenant 10 % sérum de veau fœtal (SVF) dans un incubateur à 37 ° C sous une atmosphère de 5 % de la culture CO2 pendant la nuit.
    3. Une fois que les cellules adhèrent à la lamelle, jetez le milieu et rincer les cellules deux fois avec du PBS.
    4. Ajouter une quantité suffisante de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) diluée dans du PBS à immerger la lamelle entière et fixer les cellules à température ambiante pendant 15 min.
    5. Jetez la solution PFA et rincez les lamelles deux fois dans du PBS.
  3. Immunofluorescence souillant
    1. Permeabilize des cellules mECap18 par immersion dans 0,1 % Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min.
    2. Rincer les lamelles couvre-objet avec du PBS.
    3. Bloquer des cellules mECap18 avec 3 % de BSA et procéder à l’immunomarquage des cellules utilisant des protocoles équivalentes à celles décrites pour les coupes de tissus dans l’épididyme.

4. isolement des protéines du milieu de Culture cellulaire conditionné

  1. Collection de milieu de culture cellulaire conditionné
    1. Passage des parties aliquotes de 4 × 105 mECap18 cellules dans chaque puits de 6 plaque bien avec un milieu cellulaire mECap18 additionné de 10 % FBS pendant 24 h.
    2. Laver mECap18 cellules trois fois avec un milieu cellulaire mECap18 (préparé sans FBS) pour supprimer la FBS résiduel et ses associés contaminants de protéine.
    3. Ajouter 1,5 mL de milieu de cellules mECap18 (préparé sans FBS) dans chaque puits et incuber les cellules mECap18 pendant 12 h dans un incubateur à 37° C moins de 5 % de CO2.
      Remarque : les cellules mECap18 à cette étape peuvent être évaluées pour les antigènes cibles différentes selon la conception expérimentale.
    4. Après 12 heures d’incubation, recueillir le milieu cellulaire et centrifuger à 2 000 × g pendant 10 min enlever tous les débris cellulaires.
      Remarque : La durée d’incubation peut être modifiée conformément à l’évaluation de la conception expérimentale/point de terminaison et en tenant compte de la tolérance de la cellule aux traitements appliqués. Il est recommandé d’adapter le calendrier d’incubation basée sur des schémas expérimentaux spécifiques pour s’assurer que les résultats optimaux sont obtenus.
    5. Évaluer la viabilité des cellules mECap18 via l’application d’une norme bleu de trypan exclusion test28. Jeter tous les matériaux dont la viabilité cellulaire a diminué inférieur à 90 % pour éliminer les biais introduits par les protéines libérées des cellules morts ou moribonds.
    6. Isoler des protéines du milieu cellulaire comme suit ou préserver un milieu à-80 ° C.
  2. Isolement des protéines (qui se déroulera en une hotte aspirante)
    1. Ajouter 20 % du volume de l’acide trichloroacétique réfrigérés 100 % à 80 % du volume d’un milieu cellulaire conditionné à précipiter les protéines libérées des cellules cultivées mECap18. Incuber à 4 ° C durant la nuit avec un mélange constant.
    2. Après l’incubation, pellets protéine précipitée par centrifugation (17, 000 × g, 4 ° C pendant 10 min).
      Remarque : Étant donné le nombre limité de protéines censées être sécrétée dans le milieu, il est possible que le culot ne va pas être visualisé facilement après centrifugation. Il est donc impératif de bien orienter le tube avant la centrifugation et prendre soin de ne pas pour déranger l’emplacement pellet femmes enceintes au moment du retrait du liquide surnageant.
    3. Jeter le surnageant et laver le culot deux fois avec de l’acétone refroidi avant la ré-centrifugation (17, 000 × g, 4 ° C pendant 10 min).
    4. Soigneusement, enlever et jeter le surnageant avant séchage à l’air toute acétone résiduel dans une hotte aspirante.
    5. Resuspendre le culot de protéine dans une mémoire tampon d’extraction approprié en préparation pour l’analyse du point de terminaison détecter les profils de protéine sécrétoire complète et/ou protéines cibles individuelles (p. ex.., SDS-PAGE, immunoblotting).

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Résultats

Figure 1 et Figure 2 montrent des résultats représentatifs de la localisation d’immunofluorescence de DNM dans l’épididyme de caput de souris. Chacun des trois isoformes DNM étudié les profils d’affichage localisation distincte. Ainsi, DNM1 est caractérisée par un marquage diffus relativement modeste des cellules épididymaires tout au long de l’épididyme de segment et caput initiale (Figure 2...

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Discussion

Ces études incorporé l’utilisation de tissu épididymaire fixe de Bouin, qui avait été soumis à l’enrobage de paraffine et de protocoles standard de l’amputation. Solution de fixation de Bouin comprend un mélange de formaldéhyde, l’acide picrique et l’acide acétique, chaque composant ayant une fonction spécifique et complémentaire. Ainsi, formaldéhyde réagit avec les amines primaires pour former des liaisons transversales des protéines, acide picrique pénètre lentement le tissu formant des sels et donc la coagulation des ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs aimerait la National Health and Medical Research Conseil de projet Australie Grant APP1103176 pour la prise en charge de ce travail.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps Dynamine 1Abcamab108458Espèce hôte : Lapin, isotype : IgG, Classe : polyclonale
Dynamine 2 AnticorpsSanta Cruzsc-6400Espèce hôte : Chèvre, isotype : IgG, Classe : Anticorps polyclonal
Dynamin 3Proteintech14737-1-APstrong>Host species : Rabbit, Isotype : IgG, Class : polyclonal
ATP6V1B1 anticorpsSanta Cruzsc-21206Host species : Goat, Isotype : IgG, Class : anticorps polyclonal
CD9BD Pharmingen553758Espèce hôte : Rat, isotype : IgG, Classe : monoclonale
Flotilline-1 AnticorpsSigmaF1180Espèce hôte : Lapin, isotype : IgG, Classe : anticorps polyclonal
ALOX15Abcamab80221Host species : Rabbit, Isotype : IgG, Class : polyclonal
TUBBanticorps Santa Cruzsc-5274Host species : Souris, Isotype : IgG, Class : anticorps monoclonal
PSMD7Abcamab11436Espèce hôte : Lapin, isotype : IgG, Classe : polyclonale
Anti Lapin Alexa Fluor 488ThermoA11008Espèce hôte : Chèvre, Isotype : IgG, Classe : polyclonal
Anti Chèvre Alexa Fluor 488ThermoA11055Espèce hôte : Âne, Isotype : IgG, Classe : polyclonale
Anti Chèvre Alexa Fluor 594ThermoA11058Espèce hôte : Âne, Isotype : IgG, Class : polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594ThermoA11007Host species : Chèvre, Isotype : IgG, Class : polyclonal
Anti Rabbit HRPMilliporeDC03LHost species : Goat, Isotype : IgG, Class : polyclonal
Anti Rat HRPMilliporeDC01LHost species : Chèvre, Isotype : IgG, Class : polyclonal
Anti Mouse HRPSanta Cruzsc-2005Host species : Goat, Isotype : IgG, forte : polyclonale
4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)SigmaD9564
iodure de propidium (PI)SigmaP4170
Mowiol 4-88Calbiochem475904
Albumine sérique bovine bovine (BSA)SigmaA7906
sérum fœtal bovin (FBS)BovogenSFBS-F
DMEMThermo11960-044
L-glutamineThermo25030-081
pénicilline/streptomycineThermo15140-122
5&alpha ;-androstan-17&beta ;-ol-3-oneC-IIINSigmaA8380
pyruvate de sodiumThermo11360-070
Trypsine-éthylènediaminetétraacétique acide (EDTA)SigmaT4049
Paraformaldéhyde (PFA)EMS15710
XylèneVWR Chemicals1330-20-7
ÉthanolVWR Chemicals64-17-5
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)SigmaP4417
Citrate de sodiumSigmaS1804
TrisAstral0497-5KG
GlycérolSigmaG5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octaneSigmaD2522
Poly-L-gysineSigmaP4832
Triton X-100Sigma78787
Bleu trypanSigmaT6146
Acide trichloracétiqueSigmaT9159
AcétoneAjax FinechemA6-2.5 L GL
SaccharoseSigmaS0389
Poly (alcool vinylique)SigmaP8136
D-GlucoseAjax Finechem783-500G
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556
Microscopie à fluorescenceZeissZeiss Axio Imager A1
UltracentrifugeuseBECKMAN COULTEROptima Max-XP
MicrocentrifugeusesEppendorf5424R
IncubateurHeracell150
Grand agitateur orbitalRatekOM7
Micro-ondesLGMS3840SR /00
PH-mètre de laboratoireLabPHM220
Marqueur de diapositive hydrofugeDaido SangyoMini
CoverslipThermo586
Plaque 6 puitsCELLSTAR657160
Plaque 12 puitsCELLSTAR665180
LameMikro-GlassSF41296PLMK
0.45 µ ; filtre mMillox-HVSLHV033RS
Kimwipes Dustless PaperKIMTECH34155
Tube à ultracentrifugeuse (2,2 ml, 11 × ; 35 mm)BECKMAN COULTER347356
Tube à ultracentrifuger (3,2 ml, 13 × ; 56 mm)BECKMAN COULTER362305
Filtre à cellules 70 µ ; m NylonFALCON352350
Boîte de Pétri 35 × ; 10 mm avec camesSARSTED82.1135.500
Pot à lamesTRAJAN#23 319 00
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Références

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