Ce protocole décrit l'implantation d'une fenêtre en verre sur la moelle épinière d'une souris pour faciliter la visualisation par microscopie intravitale.
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Article de méthode
Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce protocole décrit une méthode pour la laminectomy de moelle épinière et l'implantation de fenêtre en verre pour l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris. Un vaporisateur numérique intégré est utilisé pour obtenir un plan stable d'anesthésie à un faible débit d'isoflurane. Une seule colonne vertébrale vertébrale vertébrale est enlevée, et un verre de couverture disponible dans le commerce est recouvert sur un lit agarose mince. Une plaque arrière en plastique imprimée en 3D est ensuite apposée sur les épines vertébrales adjacentes à l'aide d'adhésif tissulaire et de ciment dentaire. Une plate-forme de stabilisation est utilisée pour réduire l'artefact de mouvement de la respiration et du rythme cardiaque. Cette méthode rapide et sans pinces est bien adaptée pour la microscopie à fluorescence multiphoton. Des données représentatives sont incluses pour une application de cette technique à la microscopie à deux photons de la vascularisation de la moelle épinière chez des souris transgéniques exprimant eGFP:Claudin-5 — une protéine de jonction serrée.
Introduction
Les modèles animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes, lorsqu'ils sont combinés avec la microscopie intravitale, fournissent une plate-forme puissante pour aborder la biologie et la pathophysiologie. Pour appliquer ces techniques à la moelle épinière, des protocoles spécialisés sont nécessaires pour préparer la moelle épinière à l'imagerie. Une telle stratégie est de mener une laminectomy et l'implantation de fenêtre de moelle épinière. Les principales caractéristiques d'un protocole idéal de laminectomy pour la microscopie incluent la conservation de la structure et de la fonction indigènes de tissu, la stabilité du champ de formation image, le temps rapide de traitement, et la reproductibilité des résultats. Un défi particulier est de stabiliser le champ d'imagerie contre le mouvement induit par la respiration et le rythme cardiaque. Plusieurs stratégies ex vivo et in vivo ont été signalées pour atteindre ces objectifs1,2,3,4,5. La plupart des méthodes in vivo impliquent le serrage des côtés de la colonne vertébrale2,4 et est souvent suivie par l'implantation d'un appareil métallique rigide3,4 pour la stabilité pendant la chirurgie et applications d'imagerie en aval. Le clampage de la colonne vertébrale peut potentiellement compromettre le flux sanguin et induire la barrière hémato-encéphalique (BBB) remodelage des protéines.
Le but de cette méthode est de rendre la moelle épinière intacte disponible pour l'imagerie optique chez la souris vivante tout en minimisant l'invasivité du protocole et en améliorant les résultats. Nous décrivons une procédure simple de laminectomy et de couverture-verre d'implantation jumelée à une plaque arrière en plastique ovale mini-invasive 3D-imprimée qui réalise toujours la stabilité mécanique robuste. La plaque arrière est directement adhérée aux épines vertébrales antérieures et postérieures avec du ciment dentaire. La plaque arrière est équipée de bras d'extension latérales avec des trous de vis qui se fixent rigidement à l'étape du microscope via un bras métallique. Ceci ancre effectivement la vertèbre antérieure et postérieure intacte au stade de microscope, fournissant la résistance mécanique à l'artefact de mouvement qui autrement serait présenté par la respiration et le battement de coeur. La méthode a été optimisée pour la laminectomy d'une seule vertèbre au niveau thoracique 12, omettant les pinces utilisées dans les stratégies alternatives pour la stabilité pendant l'imagerie in vivo. La procédure est rapide, prenant environ 30 min par souris.
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les mécanismes de la maladie de la BBB. Le BBB est un système microvasculaire dynamique composé de cellules endothéliales, de muscles lisses vasculaires, de péricytes et de processus astrocytes qui fournissent un environnement très sélectif pour le système nerveux central (SNC). Les données représentatives décrivent l'application de ce protocole chez les souris transgéniques conçues pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP): Claudin-5, une protéine de jonction serrée BBB. Les fichiers d'impression backplate fournis peuvent également être personnalisés pour d'autres applications.
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Protocole
Toutes les expériences suivent les protocoles du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de l'Illinois à Chicago. Il s'agit d'une procédure terminale.
1. Préparation de réactif
- Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour contenir 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2'6H2O, 2 mM CaCl2'2H 2O dans le filtre ddH2O. Sterile et congeler dans les aliquots à usage individuel. Réchauffer l'aCSF dans un bain d'eau à 39 oC avant de l'utiliser.
- Agarose chaude à faible point de fusion (2 %) dans aCSF jusqu'à dissolution complète dans un bain d'eau réglé à 65 oC. Pendant la laminectomie, refroidir l'agarose aliquot fondue à 39 oC dans un bain d'eau, de sorte qu'il peut prêt à près de la température physiologique pour l'étape 5.2.
Remarque : La solution d'agarose peut être stockée à -20 oC dans des aliquots à usage unique. - Préparer le carprofène stérile de 50 mg/mL dans de l'eau bactériostatique. Conserver à 4 oC.
- Nettoyez les verres de couverture avec 70 % d'éthanol, trois lavages de ddH2O et entreposez-les à sec dans un contenant sans poussière.
2. Impression 3D Backplate
- Utilisez le logiciel CAO 3D est utilisé pour créer un modèle aux dimensions indiquées dans la figure 1. L'intérieur est une ellipse plus large à la surface inférieure par rapport à l'imprimante et coupé avec une coupe élevée à une ellipse plus petite formant un lumen à la surface opposée. Deux bras de projection avec des trous pour accepter des vis s'étendent latéralement, pour l'attachement à la fourche de fixation de plaque arrière. À partir de cette structure 3D, créez un fichier de maillage 3D triangulé (. fichier STL).
Note: Voir La figure 1B'u2012D et les fichiers complémentaires 1 et 2. - Téléchargez le fichier de maillage 3D triangulé sur une imprimante 3D.
- Imprimez les plaques arrière à l'aide d'une buse chaude de 0,4 mm et d'une hauteur de couche de 0,2 mm. Sélectionnez la température de la buse de 205 oC, la température du lit de 45 oC et la vitesse d'impression de 45 mm/s.
- Évaluer visuellement les plaques arrière imprimées en 3D qui en résultent pour l'intégrité structurale (figure 1E); défaillance structurale brute (absence de lumen, mur effondré) indique des défauts d'impression (figure 1F).
3. Préparation chirurgicale
- Préchauffer le coussin chauffant.
- Chargez l'isoflurane dans la seringue de livraison tout en travaillant dans une hotte chimique de fumée. Fixez la seringue de livraison à l'unité isoflurane.
- Sélectionnez une souris de 8 ans et plus. Pesez l'animal. Induire l'anesthésie en utilisant 2% isoflurane dans une chambre d'induction. Injecter du carprofène à 5 mg/kg sous-cutané.
- Placez le cône nasal et livrez l'isoflurane à 2 % avec un débit de 150 ml/min pour l'entretien d'un plan chirurgical d'anesthésie (Figure 2A'u2012E). Enveloppez le coussin chauffant d'un coussin absorbant jetable pour faciliter le nettoyage.
- Placez un animal sur le coussin chauffant au poste chirurgical et installez le cône nasal. Lubrifier le thermomètre avec de la gelée de pétrole et l'insérer 5 mm dans le rectum. Tapez la sonde du thermomètre à la queue pour plus de stabilité. Appliquer l'onduleur ophtalmique sur les yeux de la souris.
- Pour maintenir l'hydratation, appliquez 200 ll de la solution de Ringer lactée par injection sous-cutanée toutes les 30 min jusqu'à la fin de l'expérience.
- Vaporiser le dorsum avec 70% d'éthanol, retirer la fourrure avec des tondeuses, et nettoyer le site avec de l'iode povidone.
4. Laminectomy
- Placer l'animal entre les barres d'oreilles; ceux-ci maintiennent la position de tête de la souris par rapport au cône de nez.
- Confirmez que l'animal est profondément anesthésié tel qu'évalué par l'absence de réflexe de pincement internumérique et de schéma respiratoire régulier.
- Faire une incision rostrale-caudale de 1,5 cm à mi-ligne au-dessus de la région lombaire thoracique/supérieure inférieure à l'aide d'#11 lame (figure 2). Séparez la peau en la saisissant avec des forceps émoussés et/ou des doigts gantés. Utilisez des forceps pour séparer et éplucher tout tissu conjonctif transparent restant sous la peau. La musculature superficielle devrait maintenant être exposée; déplacer cela avec une lance chirurgicale en mousse.
- Utilisez des lances chirurgicales en mousse (ou une curette) pour effacer la musculature restante et plus profonde de la vertèbre cible (thoracique 12). Pour créer un siège pour la plaque arrière, également effacer le muscle de l'aspect postérieur de 11 thoracique, et l'aspect antérieur de thoracic 13. Contrôlez tout saignement en appliquant une pression douce avec une lance chirurgicale ou utilisez un pouls minimal avec un pistolet de cautérisation. Continuer à enlever le muscle restant loin des tendons à l'aide de forceps
- Une fois les muscles enlevés, détachez soigneusement les tendons en coupant avec des forceps. Il devrait y avoir beaucoup d'espace pour visualiser et manipuler le cordon lorsque cette étape est terminée. Vérifiez que la matière dura de l'espace intervertébral, l'os laminaire semi-transparent, le vaisseau sanguin superficiel central sous l'os, et l'artère rayonnante antérieure sont maintenant clairement visibles.
- Mouillez la région avec un aCSF chaud. Utilisez le microdrill pour éclaircir répétitivement l'os laminaire à l'aide de traits droits parallèles à l'axe long de la moelle épinière (Figure 2, Figure 3). Si vous le souhaitez, utilisez une étape de glisse pour faire pivoter la plate-forme chirurgicale pour un confort ergonomique amélioré (par exemple, un opérateur droitier peut faire pivoter la plate-forme chirurgicale dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour l'étape de forage).
Remarque : L'étape de glisse utilisée est constituée d'une plaque supérieure en aluminium qui glisse de 15 mm par rapport à la plaque de base fixe. - Saisissez doucement le processus spinous superficiel avec des forceps et soulevez la vertèbre ; l'os doit s'éloigner facilement. S'il y a résistance, répétez l'amincissement des os avec la perceuse et, si nécessaire, utilisez des ciseaux à l'iris, en prenant soin de viser les pointes de ciseaux vers le haut pour éviter d'endommager le tissu.
Note: Afin de maintenir la dura intacte, il est essentiel de ne pas tirer sur l'os. - Utilisez #4 forceps pour éliminer les éclats d'os. Utilisez une lance chirurgicale pour appliquer une légère pression constante pour contrôler tout saignement. Rincer le tissu avec l'aCSF chaud. Ne laissez pas le tissu sécher.
5. Implantation de verre de couverture
- Appliquer délicatement un verre de couverture borosilicate de 3 mm sur le cordon exposé.
- Assurez-vous que l'agarose est refroidie à 39 oC. À l'aide d'une petite spatule, appliquer une aurrose chaude de 2 %/aCSF sur le bord du verre de couverture et permettre à l'action capillaire de la dessiner sous la surface.
Remarque : À des températures inférieures à 39 oC, l'agarose peut commencer à geler. Si cela se produit, réchauffement à l'aide d'un bain d'eau ou micro-ondes. Certains opérateurs préfèrent d'abord appliquer une goutte d'agarose et poser le couvercle sur le dessus. - Appliquer l'adhésif tissulaire sur les processus articulaires osseux exposés de la vertèbre adjacente intacte au niveau thoracique 11 colonne vertébrale vertébrale vertébrale vertébrale vertébrale et thoracique de niveau 13 colonne vertébrale vertébrale vertébrale. Appliquer un adhésif tissulaire supplémentaire dans un anneau autour du site de laminectomy, au-dessus du tendon adjacent et du processus transversal.
Remarque : L'adhésif tissulaire est nécessaire pour une bonne observance du ciment dentaire dans les étapes suivantes. Les procédés articulaires forment un siège naturel sur lequel la plaque arrière peut reposer de façon stable (Figure 3). L'adhérence aux processus articulaires formera les points d'attachement les plus forts. - Mélanger le ciment dentaire avec l'accélérant dans un plateau à mélanger en porcelaine. Utilisez une petite spatule pour transférer le ciment dentaire sur la couche adhésive tissulaire. Utilisez du ciment dentaire pour adhérer à la plaque arrière du champ chirurgical, centrée sur la fenêtre. Prévoyez 10 minutes pour que le ciment dentaire guérisse.
Note : L'adhérence ferme de la plaque arrière aux processus articulaires antérieurs et postérieurs fournit la stabilité structurelle fondamentale de l'implant. - Utilisez du ciment dentaire supplémentaire pour remplir la base intérieure de la plaque arrière, et le dessous de la plaque arrière : interface tissulaire.
Remarque : L'application supplémentaire de ciment dentaire améliore l'adhérence et réduit le risque de fuite de liquide d'immersion objectif au microscope (salin) au fond de la plaque arrière. - Avancez le support de plaque arrière fourchu à la position appropriée au-dessus de la fenêtre. Fixer la plaque arrière dans le support de la plaque arrière avec des vis.
Remarque : Ce protocole a utilisé un support de plaque arrière usiné sur mesure (Figure 2G'u2012H). - Appliquer saline sur la plaque arrière pour tester les fuites. En cas de fuite de liquide, séchez la zone et appliquez plus de ciment dentaire.
6. Préparation à l'imagerie
- Transférer l'animal sur la plate-forme chirurgicale à la table optique.
Note : Notre plate-forme chirurgicale, support de plaque arrière, et support de nez-cône d'isoflurane peuvent être transportés entre les stations chirurgicales et les stations d'imagerie de deux photons comme unité, tout en appliquant l'anesthésie continue d'isoflurane (figure 2D,H). Des unités similaires peuvent être assemblées à partir de fourches de retenue, de poutres et de poteaux de pilier de soutien pouvant être obtenus auprès de sources commerciales(p. ex. ThorLabs). Pour la microscopie intravitale, il devrait y avoir au moins 11 pouces de dégagement entre l'objectif du microscope et la table optique pour s'adapter à la hauteur de la plate-forme chirurgicale. - Affix la plate-forme chirurgicale à la table optique à l'aide d'un poteau de montage en acier inoxydable et d'une fourchette de serrage contre-travaillée.
- Appliquer la saline fraîche dans le puits de la plaque arrière. Abaissez une lentille d'immersion en eau dans le puits.
- Utilisez la lumière transmise ou épifluorescence pour identifier la zone d'intérêt et de concentration. Passez au mode de balayage laser et effectuez l'imagerie in vivo selon la longueur d'onde appropriée d'excitation laser de deux photons, les dichroics et les filtres de bandpass pour les fluorophores présents dans le tissu6.
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Résultats
Les fenêtres en verre implantées et la microscopie intravitale à deux photons constituent un outil utile pour évaluer les changements dynamiques dans les protéines du SNC. L'intégrité fonctionnelle du BBB est influencée par l'expression, la localisation subcellulaire et les taux de rotation des protéines de jonction serrées7. Des études antérieures ont démontré que les protéines de jonction serrées subissent un remodelage rapide et dynamique à l'état stable
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Discussion
La méthode décrite ici permet une imagerie stable de la moelle épinière chez la souris à travers une fenêtre en verre. Cette méthode a été appliquée pour évaluer le remodelage de BBB dans les souris transgéniques eGFP:Claudin5/- qui expriment une protéine fluorescente de jonction serrée de BBB, mais elle pourrait être appliquée également bien pour des études de toutes les protéines fluorescentes ou des cellules dans la moelle épinière.
Des méthodes multiples pour la laminectomy et la stabilisa...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
S.E. Lutz est soutenu par le National Center for Advancing Translational Sciences, les National Institutes of Health, sous Grant KL2TR002002 et les fonds de démarrage de l'Université de l'Illinois Chicago College of Medicine. Simon Alford est soutenu par RO1 MH084874. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH. Les auteurs remercient Dritan Agalliu du département de neurologie du Columbia University Medical Center pour les souris Tg eGFP:Claudin-5, des discussions scientifiques et des idées sur le développement du protocole chirurgical et des applications d'imagerie. Les auteurs remercient Sunil P. Gandhi du Département de neurobiologie et de comportement de l'Université de Californie à Irvine d'avoir conçu le premier prototype de l'appareil stéréotaxique et du contrôleur de température animale, d'avoir discuté du protocole chirurgical et formation à la microscopie à deux photons. Les auteurs remercient également Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) pour son aide dans la personnalisation du stéréomicroscope chirurgical, et Ron Lipinski (Whale Manufacturing) pour l'usinage de pièces stéréotaxiques.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Imprimante 3D | Raise3D | Pro2 | Pour l’impression de plaques arrières |
| PLA Filament d’impression 3D | Inland | PLA+-175-B | Matériau d’impression 3D en plastique noir |
| Logiciel de CAO 3D | Dassault Systèmes | Logiciel Solidworks | utilisé pour concevoir des formes 3D |
| Logiciel d’imprimante 3D | Logiciel Raise3D | Ideamaker | Logiciel utilisé pour s’interfacer avec l’imprimante 3D |
| Plaque arrière ovale imprimée en 3D | sur mesure | Champ d’imagerie stabilisateur | |
| Microscope chirurgical de dissection | Leica | M205 C | Équipé de Leica FusionOptics, d’un objectif Planapo 0,63x de la série M et d’une platine de glissement |
| Caméra microscope | Leica | MC170 | Caméra couleur HD pour la visualisation du champ chirurgical |
| Platine de descente | Leica | 10446301 | L’étage de vol à voile est constitué de deux plaques métalliques. La plaque de base est fixe. La plaque supérieure coulisse sur une interface graissée pour permettre un mouvement de rotation et linéaire. |
| Poste chirurgical et fourche de stabilisation | Whale Manufactoring | Custom Laminectomie | |
| SomnoSuite Unité d’administration d’isoflurane à faible débit | Kent Scientific | SS-01 | Administration d’anesthésie chirurgicale avec vaporisateur numérique intégré |
| Poteau de montage en acier inoxydable de 1,5 pouce | ThorLabs | P50/M | Pour le montage du poste chirurgical sur une table optique pour l’imagerie |
| à deux photonsFourche de serrage contre-alésée pour montage 1,5" Poteau | ThorLabs | PF175 | Pour stabiliser le poste chirurgical Monter sur une table optique pour l’imagerie à deux photons |
| Microdrill osseux idéal | Appareil de Harvard | 72-6065 | Amincissement de l’os pour laminectomie |
| Bain d’eau | Fisher Scientific | 15-462-10 | Sérum salin chauffant |
| Pistolet de cautérage | FST | 18010-00 | Cautérisation mineure |
| Coussin chauffant | Benchmark | BF11222 | 1,9 » x 4,5 » chauffant en silicone avec 20 » Sondes en téflon, 10W, 5V |
| Sonde rectale thermocouplée de type K | Physitemp | RET3 | Mesure de la température corporelle |
| la souris Vaseline | Sigma | 8009-03-8 | Sonde rectale lubrifiante |
| Contrôleur thermique régulé par rétroaction | personnalisé | NA | Les alternatives disponibles dans le commerce comprennent la série Physitemp TCAT |
| PVA Lances oculaires chirurgicales | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbeur de sang |
| Tondeuse électrique | Wahl | 41590-0438 | Lame de fourrure de souris |
| , #11 | FST | 14002-14 | Outil chirurgical |
| Pince, #5 | FST | 11254-20 | Outil chirurgical |
| Pince, #4 | FST | 14002-14 | Outil chirurgical |
| Pince dentée Titatnium | WPI | 555047FT | Outil chirurgical |
| Ciseaux à iris en titane | WPI | 555562S | Outil chirurgical |
| Colle tissulaire Vetbond | 3M | 084-1469SB | Préparation de la surface tissulaire pour l’acrylique dentaire |
| Plateau de mélange en céramique | Jack Richeson | 420716 | Mélange d’agent acrylique dentaire avec accélérateur |
| Orthojet acrylique dentaire | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Collage permanent de la plaque arrière sur les tissus |
| Petit verre de couverture rond, épaisseur #1, 3 mm | Appareil Harvard | 64-0720 | fenêtre optique |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | Pour aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | Pour aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | Pour aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Pour aCSF |
| MgCl2& point moyen ; 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | Pour aCSF |
| CaCl2· ; 2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Pour aCSF |
| Carprofène | Rimadyl | QM01AE91 | Analgésie |
| Eau bactériostatique | Henry Schein | 2587428 | Diluant pour carprofène |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthésie |
| Solution de sonnerie lactée | Baxter | 0338-0117-04 | Hydratation pour souris |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | point de gel 34-37 degrés C |
| Pommade lubrifiante ophtalmique | Akwa Tears | 68788-0697 | Prévenir le dessèchement de la cornée |
| MOM Microscope à deux photons | Sutter |
Références
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- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
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Réimpressions et autorisations
