Fabrication d’anisotrope polymères artificiels cellules présentatrices d’Activation des cellules T CD8 +

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour générer rapidement et de façon reproductible des inspirée, biodégradable articifical cellules présentatrices (VAMP) avec taille ajustable, forme et présentation de la protéine de surface des lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo .

Résumé

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) sont une plate-forme prometteuse pour la modulation du système immunitaire en raison de leur capacité puissante pour stimuler les lymphocytes T. Substrats acellulaires offrent des avantages clés sur vamp basés sur les cellules, y compris un contrôle précis des paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface de VAMP pour moduler ses interactions avec les lymphocytes T. Vamp, construit à partir de particules anisotropes, particules particulièrement ellipsoïdales, auraient dû être divulgués plus efficaces que leurs homologues sphériques de stimulation des cellules T en raison de la liaison accrue et de plus grande surface disponible pour les lymphocytes T contact, aussi bien réduit l’absorption non spécifique et des propriétés pharmacocinétiques améliorées. Malgré un intérêt accru dans les particules anisotropes, encore largement acceptée méthodes de génération de particules anisotropes comme minces étirement peut être difficile à implémenter et utiliser de façon reproductible.

À cette fin, nous décrivons un protocole pour la fabrication rapide et standardisé de vamp d’axée sur les particules anisotrope biodégradable avec taille ajustable, forme et signal de présentation pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou in vivo, ainsi que les méthodes de caractériser leur taille, la morphologie et la protéine de surface contenue et d’évaluer leur fonctionnalité. Cette approche à la fabrication de vamp anisotrope est évolutive et reproductible, idéale pour générer VAMP pour immunothérapies « sur étagère ».

Introduction

Cellules présentatrices d’antigène artificiel (VAMP) ont montré prometteur comme agents immunomodulateurs, parce qu’ils peuvent générer une réponse des lymphocytes T spécifiques de l’antigène robuste. Essentielles à ces plates-formes sont leur capacité à présenter efficacement les signaux cruciaux pour l’activation des cellules T. Vamp acellulaire sont une alternative intéressante aux cellulaires vamp parce qu’ils sont plus facile et moins coûteux à fabriquer, relever des défis moins pendant l’intensification et de la traduction et atténuer les risques associés à des thérapies à base cellulaire. Vamp acellulaire permettent également un degré élevé de contrôle sur les paramètres de présentation de signal et les propriétés physiques de la surface qui sera en interface avec les cellules de T¹.

Vamp doit récapituler un minimum de deux signaux essentiels pour l’activation des cellules T. Signal 1 prévoit la reconnaissance de l’antigène et se produit lorsque le récepteur des cellules T (TCR) reconnaît et s’engage avec un CMH de classe I ou II portant son antigène apparenté, culminant dans la signalisation à travers le complex TCR. Afin de contourner l’exigence de spécificité d’antigène, vamp systèmes portent souvent un agoniste monoclonal dirigé contre le récepteur CD3, qui stimule non spécifique du complexe TCR. Des formes recombinantes du CMH, particulièrement des multimères de MHC, ont également servis à la surface de vamp d’antigène spécificité^2,3. Signal 2 est un signal de costimulation qui dirige l’activité des cellules T. Pour fournir la costimulation nécessaire pour l’activation des cellules T, le récepteur CD28 est généralement stimulé avec un anticorps agoniste présenté sur la surface de Vamp, bien que les autres récepteurs de costimulation telles que 4-1BB ont été correctement ciblée⁴. Protéines de signal 1 et 2 sont généralement immobilisées sur la surface des particules rigides pour synthétiser la vamp. Historiquement, vamp ont été fabriquées à partir d’une variété de matériaux, y compris en polystyrène^4,5 et fer dextran⁶. Les systèmes plus récents utilisent des polymères biodégradables comme poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) pour générer la VAMP qui peut être facilement couplé pour signaler des protéines, est destinés à l’administration directe en vivoet peut faciliter la libération de Résumé des cytokines ou des facteurs solubles pour augmenter l’activation de lymphocytes T^7,8.

En plus de la présence de protéines de signal nécessaire, l’engagement du récepteur sur une surface suffisamment grande au cours de l’interaction de cellule de vamp/T est indispensable pour l’activation des cellules T. Ainsi, les paramètres physiques de la VAMP tels que la taille et la forme radicalement modifient leurs surfaces de contact disponible et influer sur leur capacité à stimuler les lymphocytes T. Vamp taille micron ont démontré d’être plus efficace à la stimulation des cellules T à leur échelle nanométrique homologues^9,10. Toutefois, les nano-vamp peut avoir biodistribution supérieure et meilleur drainage vers les ganglions lymphatiques qui peuvent améliorer leur performance en vivo sur micro-vamp¹¹. La forme est une autre variable d’intérêt pour les systèmes axés sur les particules de vamp. Vamp anisotrope ont récemment démontré pour être plus efficace que les particules isotropes à stimulation des cellules T, principalement en raison de l’interaction améliorée avec les cellules cibles couplé avec l’absorption réduite des cellules non spécifiques. Cellules fixent de préférence à l’axe long de particules ellipsoïdales, et le plus grand rayon de courbure et plus plat surface permettent plus de contact entre la vamp et les lymphocytes T¹². L’axe long de particules ellipsoïdales décourage également la phagocytose, résultant en temps de circulation accrue par rapport aux particules sphériques suit en vivo administration^12,,¹³. En raison de ces avantages, les particules ellipsoïdales véhiculent une plus grande expansion de spécifiques à l’antigène T cellules in vitro et in vivo par rapport aux particules sphériques, un effet observé à la micro et nanoscales^{12, 13}. Il existe différentes stratégies pour fabriquer des particules anisotropes, mais minces stretching est une méthode simple et largement acceptée, utilisée pour générer un ensemble de particules diverses formes¹⁴. Suite à la synthèse, les particules sont jetés dans les films et étirés dans une ou deux dimensions à une température supérieure à la température de transition vitreuse du matériau particulaire. Le film est ensuite dissous pour récupérer les particules. Malgré l’intérêt croissant pour les particules anisotropes, les approches actuelles de fabrication axée sur les particules vamp se limitent principalement aux systèmes isotropes et méthodes de modifier la forme des particules peuvent être difficiles à mettre en œuvre, incompatible avec la synthèse de certains vamp stratégies et manque de précision et reproductibilité¹⁵. Notre technique d’étirement minces peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée pour générer rapidement des particules anisotropes synthétisées dans une variété de polymères biodégradables, s’étendait à un format d’image désiré dans une ou deux dimensions¹⁵.

Issu de nos travaux antérieurs, nous avons développé une approche axée sur les particules biodégradable combinée avec scalable minces étirement technologie pour générer rapidement des vamp avec taille ajustable et la forme de manière standardisée pour les lymphocytes T expansion ex vivo ou en vivo. Notre stratégie de conjugaison de protéines permet de coupler les protéines d’intérêt aux groupes carboxyle sur la surface de la particule à une densité désirée, ce qui donne à ce système de vamp un haut degré de flexibilité. Nous décrivons également des méthodes pour caractériser la taille, la morphologie et la protéine de surface contenue de Vamp et d’évaluer leur fonctionnalité in vitro. Ce protocole peut être facilement adapté pour développer des cellules immunitaires ex vivo ou in vivo pour une variété d’applications immunothérapeutiques.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université Johns Hopkins.

1. fabrication de particules PLGA sphériques de taille ajustable

1. Préparation des matériaux pour la synthèse de la particule
   1. Préparer la solution à 5 % p/p d’alcool polyvinylique (PVA).
      1. Ajouter 500 mL d’eau désionisée de (DI) dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer et placer sur la plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.
      2. Lorsque la température de l’eau atteint environ 70 ° C, ajouter 25 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.
      3. Une fois tous les PVA est dissous (généralement 30 à 60 min), laisser filtre cool et stérile de solution. Conserver à 4 ° C pour une utilisation future.
   2. Préparer la solution de casting de film de 10 % p/p PVA et 2 % w/w glycérol.
      1. Verser 500 mL de l’eau distillée dans un erlenmeyer avec une barre magnétique remuer. Ajoutez 8 mL de glycérol à température ambiante et mélanger par trituration.
      2. Placer le ballon sur plaque chauffante agitateur à 500 tr/min et moniteur de température avec le thermomètre. Couvrir la fiole avec du papier d’aluminium pour éviter l’évaporation.
      3. Lorsque la température de la solution atteint environ 70 ° C, ajouter 50 g total de PVA par petits lots au fil du temps, en attente de PVA de dissoudre avant d’ajouter plus.
      4. Une fois tous les PVA est dissous (généralement 60 min), laisser le filtre cool et stérile de solution en utilisant un système de filtre à vide flacon avec une porosité de 0,22 μm. Conserver à température ambiante pour une utilisation future.
   3. Préparer une solution PVA 50 mL 1 % w/w. Ajouter 40 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % (fabriquée en 1.1.1) dans un bécher de 100-150 mL.
   4. Préparer une solution PVA 100 mL 0,5 % p/p. Ajoutez 90 mL de l’eau distillée et 10 mL de solution PVA de 5 % dans un bécher de 150 à 250 mL.
   5. Ajouter une barre d’agitation magnétique 0,5 % solution PVA et les introduire dans une hotte chimique sur une plaque d’agitation à température ambiante à 500 tr/min.
2. Synthèse de microparticules
   1. Peser 100 mg de poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) dans un flacon à scintillation et les dissoudre dans 5 mL de dichlorométhane (DCM). Vortex pour dissoudre la PLGA.
   2. Placez homogénéisateur dans la solution PVA de 1 % de 50 mL de sorte que l’homogénéisateur est aussi proche de la base du gobelet que possible sans le toucher. Homogénéisateur et régler à la vitesse désirée — 3 200 tr/min pour les particules de diamètre 5 μm, 5 000 tr/min pour 3 μm, 15 000 t/mn pour 1 μm (augmentant l’homogénéisation vitesse diminue la taille des particules). Une fois à la vitesse désirée, ajouter la solution PLGA dans le bécher et homogénéiser pendant 1 minute.
   3. Après homogénéisation, verser le 1 % PVA, solution au moyen de microparticules PLGA dans la solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.
   4. Laver les particules 3 fois dans l’eau distillée.
      1. Verser la solution de la particule dans tubes conique de 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes. Versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée.
      2. Remettre en suspension les particules au vortex. Une fois remis en suspension, remplissez les tubes coniques à 50 mL avec de l’eau distillée.
      3. Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.
3. Synthèse de nanoparticules
   1. Peser 200 mg de PLGA dans un flacon à scintillation et dissoudre dans 5 mL de DCM. Vortex pour dissoudre la PLGA.
   2. Mettre un bécher avec 50 mL de solution de PVA 1 % dans le récipient rempli de glaçons. Placer la sonde sonicateur dans le bécher au plus près le bas que possible sans toucher. Commencer la sonication et immédiatement ajouter PLGA solution dans le bécher. Laisser agir avec une puissance de 12 W pendant 2 minutes pour générer des nanoparticules avec un diamètre approximatif de 200 nm.
   3. Après la sonication, verser le 1 % PVA, solution de nanoparticules PLGA dans une solution PVA 100 mL 0,5 % sur une assiette pour mélanger et remuer pendant au moins 4 heures pour l’évaporation des solvants dans une hotte chimique.
   4. Verser la solution de particules dans les tubes coniques de 50 mL et centrifuger à 3 000 x g pendant 5 minutes pour éliminer les microparticules. Éliminer le surnageant et versez dans des tubes à centrifuger haute vitesse.
   5. Laver les particules 3 fois avec l’eau distillée. Centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes. Versez sur le surnageant et remettre en suspension dans l’eau distillée au vortex. Lavez à nouveau de la même façon deux fois plus.

2. fabrication de particules polymères de forme accordable

1. Après avoir lavé les particules PLGA trois fois, remettre en suspension les particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Ajouter la solution de casting de film de particules pour la concentration de la particule finale des particules de 2,5 mg/mL.
2. Pipetter, la suspension de particules en portions de 10 mL dans les plats de Pétri rectangulaire 75 x 50 mm pour les étirements unidimensionnel ou en aliquotes de 15 mL en plats de Pétri carré 100 x 100 mm pour deux dimensions qui s’étend. Enlever les bulles soit la pipette ou bulles poussant sur le côté et laisser sécher pendant la nuit dans une hotte chimique films.
3. Une fois que les films sont secs, enlever les films de vaisselle en plastique avec des pincettes et couper les bords des films avec des ciseaux. Enregistrer les bords dans un tube conique de 50 mL à utiliser sous forme de particules sphériques.
   1. Charger un film sur la couche mince automatisé qui s’étend du dispositif par le montage d’un film dans des blocs d’aluminium. Pour 1D étirement, monter le film dans des blocs d’aluminium d’un axe de la civière (Figure 2) en plaçant les deux bords courts du film entre deux morceaux de caoutchouc néoprène. À l’aide d’une clé Allen, visser les poignées métalliques sur le dessus de caoutchouc pour maintenir le film en place. Pour les étirements 2D, monter quatre bords sur quatre blocs d’aluminium s’étirer sur les deux axes (Figure 2).
   2. Mesurer et noter la longueur du film entre les blocs d’aluminium sur un axe pour les étirements 1D ou les deux axes pour les étirements 2D. Calculer la distance nécessaire d’étirer le film dans une ou deux directions en fonction désirée pli-stretch.
   3. Placez l’appareil d’étirement film-chargé dans un four à 90 ° C et ramener le film à température pendant 10 minutes. Placer un grand bécher dans le four avec un peu d’eau.
   4. Film étirable.
   5. Lors de l’étirement est terminée, retirer l’appareil qui s’étend du four et laisser le refroidir de film à température ambiante pendant 20 minutes.
   6. Pour 1D étirement, couper le film hors de l’appareil qui s’étend sur les bords. Pour les étirements 2D, couper dehors et enregistrer le centre carré de film qui est étiré uniformément sur les deux axes. Placer les films dans des tubes coniques avec 2 films par tube et jeter le reste du film.
   7. Ajouter environ 25 mL de l’eau distillée à chaque tube à fond conique et vortex jusqu'à ce que les films sont dissous.
   8. Une fois que les films sont des particules dissoutes, laver 3 fois avec l’eau distillée.
      1. Pour les microparticules, remplir des tubes coniques à 50 mL et centrifuger à 3000 x g pendant 5 minutes, déverser du liquide surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.
      2. Pour les nanoparticules, particules de transfert pour tubes de centrifugeuse de haute vitesse et centrifuger à 40 000 x g pendant 15 minutes, versez surnageant, ajouter environ 20 mL de l’eau distillée et vortex pour remettre en suspension les particules.
   9. Après le troisième lavage, remettre en suspension des particules dans environ 1 mL de l’eau distillée. Noter le poids du tube microcentrifuge et ajouter des particules dans le tube. Congeler des particules dans un congélateur à-80 ° C pendant 1 heure ou congélation flash dans l’azote liquide. Une fois congelé, lyophiliser particules durant la nuit.
   10. Une fois lyophilisé, peser des particules dans le tube de microcentrifuge et soustraire le poids enregistré du tube vide pour déterminer le poids des particules lyophilisés.

3. surface Protein conjugaison pour créer des cellules présentatrices de l’antigène artificiel

1. Préparer 2-(N-Morpholino) tampon d’ethanesulfonic acide (MES). Préparer une solution de 0,1 M de MES dans l’eau et ajuster le pH à 6.0 par titrage avec 1M d’hydroxyde de sodium (NaOH).
2. Resuspendre lyophilisée PLGA/PBAE micro/nanoparticules à 20 μg/mL dans le tampon MES au vortex. Remplir un tube de microcentrifuge polypropylène avec 900 μL de tampon de MES et ajouter 100 μL de la solution de particules dans le tube.
3. Préparer la solution d’EDC/NHS. Dissoudre 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et 48 mg de N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) dans 1 mL de tampon de MES.
4. Ajouter 100 μL EDC/NHS solution pour les particules et le vortex pour mélanger.
5. Incuber le tube sur un onduleur à température ambiante pendant 30 minutes.
6. Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS par Vortex (microparticules) ou la sonification à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules).
7. Pour les microparticules, ajouter 8 μg de la protéine du signal désiré 1 et 10 μg de anti-souris CD28 (clone 37,51) aux particules. Pour les nanoparticules, ajouter 16 μg signal 1 et 20 μg anti-souris CD28. Ajouter PBS pour porter le volume du tube à 1,1 mL.
8. Incuber le tube sur un variateur de fréquence à 4 ° C durant la nuit.
9. Le lendemain, laver les particules. Tournez en bas des microparticules à 5 000 x g pendant 5 minutes, ou nanoparticules à 17 000 x g pendant 5 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension des particules dans 1 mL de PBS stérile par Vortex (microparticules) ou la sonication à 2-3 W pendant 5 secondes (nanoparticules). Répéter deux fois.
10. Remettre en suspension les particules à la concentration voulue dans le milieu de culture pour un usage immédiat. Pour le stockage à long terme, remettre en suspension les particules à 10 mg/mL dans une solution de saccharose de 100 mM. Geler, lyophiliser et stocker les particules à-80 ° C.

4. caractérisation et évaluation de Vamp

1. Caractérisation de vamp taille et la forme (Figure 3)
   1. Caractériser les microparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Pour SEM particules lyophilisées d’imagerie, étalées sur une bande carbone ont adhéré à un aluminium louvoyer et bredouiller manteau avec or-palladium.
   2. Analyser la taille et les proportions de particules à l’aide de logiciels d’analyse image.
   3. Pour déterminer la taille des particules, définissez l’échelle à l’aide de la barre d’échelle et mesurer le diamètre des particules. Répétez pour environ 100 particules déterminer le diamètre moyen de particules et de générer un histogramme de tailles de particules.
   4. Pour déterminer le ratio d’aspect, mesurez la distance entre l’axe longitudinal et l’axe court des particules et diviser le long axe par axe court. Répétez pour environ 50 particules de chaque forme pour déterminer les proportions de moyenne des particules pour chaque forme et générer des histogrammes.
   5. Caractériser des nanoparticules de taille et de forme par imagerie de particules à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM). Analyser la taille et les proportions des nanoparticules avec logiciel d’analyse d’image tel que décrit en 5.1.2. Vous pouvez également mesurer la taille des nanoparticules sphériques utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) ou nanoparticules suivi d’analyse (NTA).
2. Efficacité de la protéine conjugaison
   1. Préparer la VAMP selon les méthodes 1 à 3, mais étape 3.7 utiliser le signal fluorescent étiquetés 1 protéine et CD28 anti-souris. Après conjugaison et lavage, resuspendre la VAMP dans 1 mL de PBS pour une concentration finale de 2 mg/mL vamp.
   2. Élaborer des normes de la protéine dans une microplaque de 96 puits en polystyrène noire. Ajouter 5 μg de protéines du signal fluorescent étiquetés 1 à PBS dans le premier puits de la plaque et faire des dilutions de 1:2 10 dans du PBS à travers la ligne de la plaque. Laisser le dernier vide bien. Répétez cette étape pour générer un autre ensemble de normes avec anti-CD28 fluorescent étiquetés.
   3. Pipetter 100 μL de la solution de vamp dans puits répétées de la microplaque de polystyrène noire en trois exemplaires.
   4. Lire la fluorescence sur un lecteur de fluorescence dans les longueurs d’onde appropriées. Les lectures de fluorescence dans les normes de la protéine permet de générer des courbes d’étalonnage pour chaque anticorps fluorescents. À l’aide de la courbe d’étalonnage, calculer les concentrations de signal 1 et anti-CD28 dans chaque puits échantillon et ensuite de calculer la quantité de protéine de surface et d’efficacité de conjugaison (Figure 4 a, Figure 5 a).
3. Évaluation de VAMP pour in vitro la stimulation des cellules T CD8 +
   1. Préparer les médias B' (RPMI additionné L glutamine, 10 % FBS, solution d’acides aminés Non essentiels 1 %, pyruvate de Sodium 1 %, solution de 1 % de vitamines MEM, 92 μM β-mercaptoéthanol et 10 ng/mL ciprofloxacin 30 U/mL IL-2.
   2. Sacrifier une souris noire 6 par l’exposition du dioxyde de carbone.
   3. Récolter la rate de la souris selon un protocole établi précédemment¹⁶. Recueillir la rate dans un tube conique de 50 mL avec 10 - 15 mL de PBS. À l’aide d’un pilon, écraser la rate à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube conique de 50 mL. Au cours de brassage, lavez le tamis avec 40 mL de PBS.
   4. Tournez les splénocytes à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les splénocytes dans 4 mL de tampon de lyse Ack à lyser les globules rouges. Permettre le tube s’asseoir non perturbés pendant une minute, puis ajoutez les PBS pour porter le volume dans le tube de 20 mL.
   5. Tournez les cellules à 300 x g pendant 5 minutes. Décanter le liquide surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   6. Faire tourner les cellules à 300 x g pendant 5 minutes et remettre en suspension dans le volume souhaité de tampon de séparation cellulaire. Isoler les cellules T CD8 + de la suspension de la cellule à l’aide d’une sélection négative de CD8 + kit d’isolation de lymphocytes T, suivant le protocole du fabricant.
   7. Après la séparation magnétique, spin des cellules T CD8 + à 300 x g pendant cinq minutes et retirer le tampon de séparation cellulaire. Remettre en suspension des cellules dans 1 mL de PBS et compter les cellules non vides. Cellules avec carboxyfluorescéine succinyl ester (CFSE) selon le protocole du fabricant de l’étiquette.
   8. Incuber 8 333 lymphocytes t CD8 + et 0,0833 mg (ou dose souhaitée) de vamp dans les milieux de 150 μL B' à chaque puits d’un 96 bien U-traitée pour la culture de tissu plaque de fond.
   9. Incuber à 37 ° C pendant 7 jours. Après 3-4 jours, actualisez le milieu de culture en ajoutant un milieu frais 75 μl à chaque puits.
   10. Après 3 jours d’incubation, analyser CFSE étiquetés cellules sur un cytomètre en flux afin d’évaluer la prolifération. Chaque pic sur l’histogramme CFSE de cytométrie de flux représente une génération de cellules en raison de la dilution CFSE avec chaque division cellulaire successifs.
   11. Après 7 jours, utilisez un hémocytomètre pour compter le nombre de cellules dans chaque puits. Avant le comptage, colorer les cellules mortes avec une solution de bleu de Trypan. Exclure les cellules mortes de globules final. Normaliser la concentration de la dernière cellule de la concentration initiale pour calculer le pli-expansion (Figure 4 et Figure 5).

Résultats

Une représentation schématique du film mince 2D automatisé, qui s’étend de dispositif est donnée à la Figure 1. Un schéma et une description pour un film mince de 1D qui s’étend du dispositif est donné en Ho et al.¹⁷ la civière est construite à partir de pièces d’aluminium à l’aide de techniques d’usinage et de fraisage standard. Semblable à la civière 1D, la civière 2D se compose de poignées métalliques et de rails de guidage. Vis de ...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode polyvalente pour la génération précise des particules de polymères anisotropes. La couche mince qui s’étend de la technique décrite ici est évolutif, hautement reproductible et peu coûteux. Des techniques alternatives pour générer des particules anisotropes souffrent de nombreuses limites, y compris le coût élevé, un débit faible et limitée de granulométrie. La couche mince qui s’étend de la démarche est également avantageuse car les particules sont modifiées afin d’être anisotrope après s...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poly(alcool vinylique), MW 25000, hydrolysé à 88 %	Polysciences, Inc.	02975-500
Glycérol	Sigma-Aldrich	G9012
Thermomètre numérique	Fluke	N/A	Nom du modèle : Fluke 52 II
Sonde de température d’immersion	Fluke	N/A	Nom du modèle : Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Agitateur	Benchmark Scientific	H3760-HS
Agitateur multipoint	Thermo Fisher Scientific	50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide)	Sigma-Aldrich	719900
Dichlorométhane	Sigma-Aldrich	D65100
Homogénéisateur	IKA	;
Sonorités sonicatrices	& Matériaux, Inc.	N/A	Numéro de modèle : VC 505
Boîtier d’insonorisation Sonicator	Sonics & Matériaux, Inc.	N/A	Référence : 630-0427
Sonde sonicatrice	Sonics & Matériaux, Inc.	N/A	Référence : 630-0220
Sonicator microtip	Sonics & Matériaux, Inc.	N/A	Référence : 630-0423
Centrifugeuse à grande vitesse	Beckman Coulter	N/A	Numéro de modèle : J-20XP (discontinué), modèle alternatif : J-26XP
Rotor de centrifugeuse à grande vitesse	Beckman Coulter	369691	Numéro de modèle : JA-17
Tubes à centrifuger en polycarbonate à grande vitesse	Thermo Fisher Scientific	3118-0050	50 mL, bouchon à vis
Pétri jetable rectangulaire parabole	VWR International	25384-322	75 x 50 x 10 mm
Boîte de Pétri jetable carrée	VWR International	10799-140	100 mm x 100 mm
LEAF  ; Anti-souris CD3&epsilon purifié ; Anticorps	Biolegend	100314
InVivoMab anti-souris CD28, clone 37.51	Bio X Cell	BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime ;-chlorhydrate d’éthylcarbodiimide	Sigma-Aldrich	E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sel	sodique Sigma-Aldrich	56485
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Alexa Fluor 488 anti-souris CD3 Anticorps	Biolegend	100212
APC anti-souris CD28 Anticorps	Biolegend	102109
Corning  ; Microplaque en polystyrène solide 96 puits	Sigma-Aldrich	CLS3915	fond plat, polystyrène noir
Tubes Protein LoBind, 1,5 mL	Eppendorf	22431081
RPMI 1640 Moyen (+ L-Glutamine)	ThermoFisher Scientific	11875093
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F4135	inactivée par la chaleur, filtrée stérilement
	Sigma-Aldrich	17850
2-Mercaptoéthanol	Sigma-Aldrich	M6250
IL-2 humaine recombinante (sans porteur)	Biolegend	589102
Pyruvate de sodium (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360070
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050
MEM Vitamin Solution (100X)	ThermoFisher Scientific	11120052
CD8a+  ; Kit d’isolement des lymphocytes T, souris	Miltenyi Biotech	130-104-075
CellTrace CFSE Kit de prolifération cellulaire	ThermoFisher Scientific	C34554
LS Colonnes	Miltenyi Biotech	130-042-401
Séparateur MidiMACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
MACS Multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
Cytomètre	en flux Accuri C6
Synergy 2 Lecteur de microplaques multi-détection	BioTek
autoMACS Running Buffer	Miltenyi BIotech	130-091-221
Filtre cellulaire	ThermoFisher Scientific	22363548	Stérile, 70 & micro ; m nylon mesh
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher Scientific	A1049201
C57BL/6J (Black 6) Souris	The Jackson Laboratory	000664	Mâle, âgé d’au moins 7 semaines
U-Bottom Plaques de culture tissulaire	VWR	353227	Stérile, 96 puits traités par culture tissulaire
Plaques d’alimentation 40 V DC	Probotix	LPSK-4010
PTFE Souris en fil revêtu		602-5858-100-01	Il s’agit d’une bobine de 100 pieds, mais un fil équivalent fonctionnera
Pilote de moteur pas à pas	Probotix	MondoStep5.6
Kit de connecteur IDC	Probotix	IDCM-10-12
Microcontrôleur	Probotix	PBX-RF
4A Fusibles	Radio Shack	2701026	Des fusibles équivalents fonctionneront également
DB25 Câble Mâle à Mâle	Probotix	DB25-6
Câble USB-A vers USB-B	Agrafes	2094915	Un câble équivalent fonctionnera également
Connecteurs Amphenol à 8 broches Souris mâle et femelle		654-97-3100A-20-7P et 654-97-3106A20-7S
Moteur pas à pas	Probotix	HT23-420-8
Vis mère à droite	Roton	60722
Vis mère gauche	Roton	60723
Vis	McMaster Carr	92196A151
Caoutchouc néoprène	McMaster Carr	8698K51
Écrou à bride pour droitier	Roton	91962
Écrou à bride pour gaucher	Roton	91963
Ordinateur de contrôle Linux	Probotix	LCNC-PC	Tout ordinateur avec des spécifications correspondantes et un système d’exploitation Linux fonctionnera
Système de filtre sous vide pour bouteilles Corning	Sigma-Aldrich	CLS431097
Trypan Blue Solution, 0,4 %	ThermoFisher Scientific	15250061