Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.
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Article de méthode
Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cancer de la vessie est un problème de santé important. On estime que plus de 16 000 personnes mourront cette année aux Etats-Unis d’un cancer de la vessie. Alors que 75 % des cancers de la vessie sont non invasif et peu susceptible de métastaser, environ 25 % évoluer vers un modèle de croissance invasive. Jusqu'à la moitié des patients atteints de cancers invasifs développera la rechute métastatique létale. Comprendre le mécanisme de progression invasive dans le cancer de la vessie est donc cruciale pour prédire des résultats pour les patients et de prévenir les métastases mortelles. Dans cet article, nous présentons un modèle d’invasion du cancer en trois dimensions qui permet l’incorporation des cellules tumorales et stromales composants pour reproduire in vivo les conditions rencontrées dans le microenvironnement de tumeur de la vessie. Ce modèle offre la possibilité d’observer le processus invasif en temps réel en utilisant l’imagerie Time-lapse, interroger les voies moléculaires impliquées utilisant des composés confocale par immunofluorescence, imagerie et écran risquent de bloc invasion. Ce protocole met l’accent sur le cancer de la vessie, mais il est probable que des méthodes similaires pourraient servir à examiner l’invasion et la motilité dans d’autres types de tumeur.
Introduction
Invasion est une étape essentielle dans la progression du cancer, qui est nécessaire pour les métastases et est associé à une survie plus faible et de mauvais pronostic chez les patients. Dans le cancer de la vessie humaine, la malignité plus courante du tractus urinaire, ce qui provoque environ 165 000 décès par an dans le monde entier, pronostic, traitement et stade de cancer sont directement liés à la présence ou l’absence d’invasion1. Environ 75 % des cas de cancer de la vessie sont envahissantes non musculaires et sont gérés avec résection locale. En revanche, les cancers de la vessie envahissement musculaire (environ 25 % des cas) sont des tumeurs agressives avec des taux élevés de métastatiques et sont traités avec la multimodalité agressif thérapie2,3. Comprendre les voies moléculaires déclenchant une invasion est donc essentiel de mieux caractériser le risque de progression invasive et de développer des interventions thérapeutiques qui peuvent empêcher la progression invasive.
La progression des tumeurs invasive se produit dans un environnement tridimensionnel complexe de (3-d) et implique l’interaction des cellules tumorales avec les autres cellules de la tumeur, stroma, membrane basale et d’autres types de cellules dont les cellules immunitaires, les fibroblastes, les cellules musculaires et vasculaires cellules endothéliales. Support perméable (p. ex., Transwell), systèmes de dosage sont couramment employées pour doser le cancer cell invasion4, mais ces systèmes sont limités car ils ne permettent pas suivi microscopique du processus invasion en temps réel et la Il est difficile de la récupération des échantillons pour une coloration plus loin et l’analyse moléculaire. Développement d’un système de sphéroïde de tumeur vessie 3D pour étudier l’invasion est souhaitable car elle permet l’incorporation de composants micro-environnementales définis avec la commodité des systèmes d’in vitro .
Dans ce protocole, nous décrivons un système pour interroger les processus invasifs des cellules cancéreuses de la vessie humaine à un dosage d’invasion de sphéroïde 3D intégrant des matrices de gel à base de collagène et de la microscopie confocale à permettre aux enquêteurs de surveiller la motilité cellulaire et invasion en temps réel (Figure 1A). Ce système est polyvalent et peut être modifié pour interroger les différents réglages/tumeur stromale. Il peut intégrer la plupart lignées de cellules cancéreuses de la vessie ou les tumeurs de vessie primaire et des cellules stromales supplémentaires telles que le cancer lié les fibroblastes et les cellules immunitaires5,6,7. Ce protocole décrit une matrice composée de collagène de type 1, mais peut être modifié pour incorporer d’autres molécules telles que la fibronectine, la laminine ou d’autres protéines de collagène. Processus invasifs peuvent être suivis pendant 72 heures ou plus en fonction de la capacité du microscope et le système. Fixation et immunofluorescence souillant de la tumeur, enfoui dans la matrice 3D avant, pendant et après l’invasion permet l’interrogation des protéines surexprimées dans les cellules envahissantes, fournissant ainsi des informations cruciales qu’habituellement absents ou difficiles à recueillir à l’aide d’autres modèles 3D de la culture. Ce système peut également être utilisé pour préliminaire des composés qui bloquent l’invasion et pour délimiter les voies de signalisation touchés par ces composés.
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Protocole
1. croissance du Cancer sphéroïdes
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De plus en plus de lignées cellulaires
- Cellules de cancer vessie humaine culture sous adherent classique des conditions de culture de cellules et de maintiennent dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2. Maintenir les cellules à < confluency 90 %.
Remarque : les milieux de Culture utilisés est de Dulbecco modifié minimal médias essentiels (DMEM) contenant 4,5 g/L de D-glucose, L-Glutamine, pyruvate de sodium 110 mg/L et fourni avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) tout au long de ce protocole. - Un jour avant le début de l’expérience, trypsinize (à l’aide de 0,25 % trypsine-EDTA) cellules, quantifier la concentration cellulaire et distribuer 1 x 106 cellules dans 3 mL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de fixation 6 puits ultra faible.
- Incuber les cellules dans des conditions de faible attachement à 37 ° C pendant ≥ 16 h. Cela devrait permettre un délai suffisant pour les cellules à s’agréger en sphéroïdes pour la plupart lignées de cellules cancéreuses de la vessie.
Remarque : La formation des sphéroïdes peut être observée par microscope inversé champ lumineux. La taille optimale et le nombre des sphéroïdes peuvent dépendre d’expériences individuelles, mais nous constatons que les sphéroïdes avec des diamètres de 50 µm à 150 µm sont généralement adaptés pour l’imagerie Time-lapse avec un objectif de 20 X. - Pour tenir compte des types de cellules supplémentaires, tels que les fibroblastes ou des cellules immunitaires dans les sphéroïdes, mélanger les cellules souhaitées avec les cellules cancéreuses au ratio désiré (1:1, 01:10, etc..) dans une pièce jointe ultra-basse plaque et incuber à 37 ° C pendant ≥ 16 h afin de permettre la formation de cellule mixte type sphéroïdes.
- Cellules de cancer vessie humaine culture sous adherent classique des conditions de culture de cellules et de maintiennent dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2. Maintenir les cellules à < confluency 90 %.
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De plus en plus de tumeurs primaires
Remarque : Tumeur sphéroïdes peuvent également provenir de tumeur de vessie primaire sources telles que les tumeurs développés à partir de tumeur de vessie induite par la substance cancérigène modèles8. Par exemple, les tumeurs de vessie générés des souris nourris avec N-butyl - N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN), peuvent être récoltées et hachées en petits morceaux (environ 0,5 mm3) à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles. La digestion des échantillons primaires de vessie humaine cancers peuvent également être étudiés dans ce système.- Recueillir et lavez 0,5 mm3 pièces de la tumeur à glacee tampon phosphate salin (PBS) 5 mL. Centrifugation à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter une fois cette étape de lavage.
- Rassembler les morceaux de la tumeur par centrifugation à 200 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et ajouter 5 mL de DMEM contenant 10 % FBS. Transférer le mélange de sphéroïde/médias tumeur à une plaque de fixation 6 puits ultra faible. Incuber à 37 ° C pendant ≥ 16 h avant l’intégration dans la matrice de collagène (voir étape 2.3).
2. préparation de la chambre de culture 3-d
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Diluer le collagène de type 1 (dérivé de queue de rat) en DMEM contenant 10 % FBS pour faire un mélange de 2 mg/mL selon les instructions du fabricant.
- En bref, la composition collagène avec une quantité appropriée de la solution de NaOH N 1et DMEM de pipetage doux basé sur les instructions du fabricant pour atteindre pH physiologique.
- Après le mélange collagène et DMEM, rapidement recouvrir les puits de la diapositive de la chambre (pour la plupart des applications, diapositives chambre sous un numéro 1.5-verre est optimal) avec le mélange de collagène-DMEM avant solidification (200 µL/puits). Laisser la lame de chambre couché à être stationnaire à température ambiante pendant 15 min.
Remarque : La composition de la matrice à base de collagène peut être modifiée en ajoutant d’autres ingrédients de la matrice extracellulaire, telles que la fibronectine ou laminine, selon l’application de l’expérience.
- Doucement ajouter 500 µL de milieux contenant des sphéroïdes (ou morceaux de tumeur, si l’échantillon de la tumeur primitive est utilisé) de la plaque de fixation 6 puits ultra faible dans un tube de microcentrifuge vide de 1,5 mL. Attendre 2 mn laisser les sphéroïdes se déposent au fond du tube.
- Retirer délicatement le surnageant du tube. Préparer un autre tube du collagène de type 1 (2 mg/mL) mélangé avec DMEM contenant 10 % FBS et rapidement ajouter 500 µL de ce mélange pour les sphéroïdes. Mélanger délicatement les sphéroïdes et collagène par pipetage lente.
- Ajouter 250 µL du mélange de sphéroïdes/collagène dans un puits de diapositive de collagène-pre-enduit chambre. Permettre à la matrice de collagène contenant des sphéroïdes à solidifier complètement (environ 30 min à 37 ° C).
- Après la matrice de collagène est solidifiée, ajouter 1 mL de DMEM contenant 10 % FBS dans chaque puits (Figure 1B). Incuber la lame de chambre dans un incubateur à 37 ° C livré avec 5 % de CO2 , jusqu’au moment de l’imagerie.
3. vivre la cellule imagerie Time-lapse
- Allumez la microscopie confocale en suivant les instructions du fabricant et s’assurer que la chambre climatique atteint 37 ° C et est fournie avec 5 % de CO2.
NOTE : Notre microscope et chambre exigent habituellement 1 h pour atteindre l’équilibre du système. - Transvaser avec soin la diapositive de la chambre à l’adaptateur de diapositives au microscope.
- Localiser les sphéroïdes d’intérêt à l’aide d’un objectif de faible puissance (par exemple, 5 X) et amorcer l’imagerie avec l’objectif de puissance plus élevée (en protocole actuel, objectif 20 X est utilisé pour la majeure partie de l’imagerie de cellules vivantes pour sa meilleure qualité d’image).
Remarque : Pour des échantillons de tumeur de vessie primaire, 5 X et 10 X objectifs peuvent être nécessaire afin de couvrir la plus grande zone d’imagerie. Pour notre imagerie Time-lapse, l’intervalle d’imagerie est défini comme 30 min et une pile de Z est utilisée pour l’ellipsoïde toute l’image. La distance entre Z-tranches est généralement définie à 4 µm pour la 20 X objectif et la distance totale de l’axe Z est autour de 200 µm. les Images peuvent être obtenus à l’aide de DIC et avec fluorescence si les cellules/tissus harbor marqueurs protéine fluorescente. - Effectuer l’imagerie Time-lapse pendant 24 à 72 h.
Remarque : La durée est déterminée par le type de cellule et les besoins de l’expérience.
4. préparation du bloc d’échantillons contenant des sphéroïdes de Cancer pour les coupes de tissus congelés
- Soulevez le bloc de gel de collagène et sphéroïdes de la glisse de la chambre à l’aide de petites pinces. Placez le bloc de gel de collagène dans un moule en plastique de l’histologie.
- Rincer le gel de collagène avec 1 x PBS rapidement et puis le fixer avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 30 min à température ambiante.
ATTENTION : PFA est carcinogène potentiel et doit être manipulé avec soin. - Laver le gel de collagène avec 1,5 mL de PBS 1 x sur un agitateur pendant 15 min. remplacer le PBS et répétez l’étape précédente de lavage 3 x.
- Appliquer une fine couche (environ 3 mm) de la température de coupe optimale (OCT) composée pour recouvrir le fond d’un moule en plastique histologie nouvelle. Placez le fixe et gel de collagène sur le dessus de l’outil OPO lavé composé, puis incorporez soigneusement le gel tout en remplissant le moule d’OCT composé tout en évitant la formation de bulles d’air dans l’OPO.
- Laisser le moule à 4 ° C pendant 1 h.
- Placer le moule contenant l’échantillon et l’OCT composé sur un plat de Pétri 100 mm flottant sur l’azote liquide. Laisser l’échantillon flash-geler complètement.
- Stocker le bloc congelé à-80 ° C pour une utilisation future.
5. immunofluorescence Imaging for Cancer coupes congelées sphéroïdes
- Transfert du bloc d’échantillons congelés du congélateur à-80 ° C à la chambre de-20 ° C d’un cryostat.
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Effectuer des coupes congelés classiques en définissant l’intervalle de section à 7 µm. Laissez les échantillons sectionnés à attacher à la lame de verre sans rides ou air emprisonné.
- Stocker les lames à-80 ° C avant d’effectuer une coloration plus loin.
Remarque : Différents intervalles peuvent servir aux besoins expérimentaux.
- Stocker les lames à-80 ° C avant d’effectuer une coloration plus loin.
- Sécher à l’air les diapositives pendant 1 h à température ambiante.
- Permeabilize les échantillons avec du PBS contenant 0,5 % Triton X-100 pendant 15 min.
- Lavage des échantillons 3 x avec PBS pendant 10 min par lavage.
- Encercler les échantillons sur la diapositive avec barrières hydrophobes en utilisant un stylo barrière hydrophobe.
- Traiter les échantillons avec la solution de saturation (1 x PBS contenant 5 % d’albumine sérique bovine (BSA)), pendant 1 h à température ambiante.
- Appliquer 40 µL de solution primaire contenant des anticorps (1 x PBS contenant 5 % de BSA avec dilution au 1/100 de l’anticorps primaire) pour chaque échantillon sur la lame.
- Incuber les lames dans l’anticorps primaire à 37 ° C pendant 1 h ou à température ambiante pendant la nuit (le temps d’incubation et les conditions varient selon l’anticorps primaire).
- Les échantillons de lavage 3 x avec PBS pendant 15 min (par lavage).
- Appliquer 40 µL de solution de contenant des anticorps secondaire (1 x PBS contenant 5 % de la surface corporelle avec une dilution de 1 : 300 anticorps secondaire) pour chaque échantillon sur la lame.
- Les échantillons de lavage 3 x avec PBS pendant 15 min (par lavage).
- Tacher les échantillons avec Hoechst 33342 solution (1 µg/mL, dilué dans du PBS) à température ambiante pendant 10 min. Laver ensuite les échantillons avec du PBS pendant 5 min.
- Monter les échantillons avec support de montage et recouvrez-les de tailles appropriée des lamelles. Laissez les diapositives dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 h et puis effectuez la microscopie confocale.
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Résultats
Création de sphéroïde de tumeur invasive de la vessie cancer exige la formation des sphéroïdes Fluxsol tumeur de lignées cellulaires ou de tumeurs primaires. Figure 2 A montre des sphéroïdes Fluxsol développés à partir de quatre lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine (UC9-UM, UM-UC13, UM-UC14, 253J et UM-UC18). Figure 2 B montre un sphéroïde de tumeur d’une tumeur de la vessie généré ...
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Discussion
Nous décrivons ici un modèle de sphéroïde de tumeur 3D qui permet l’observation en temps réel de l’invasion de cancer de la vessie qui est essentielle pour la progression du cancer et des métastases. Ce système se prête à l’intégration des diverses composantes stromales et cellulaires pour permettre aux enquêteurs de rappel mieux le microenvironnement de tissu où s’effectue l’invasion du cancer de la vessie. Les sphéroïdes de cancer de la vessie peut provenir de diverses sources telles que les lignées cellulaires (y comp...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire du Dr Howard Crawford (Université du Michigan) pour le support technique et mode de matériaux et équipements pour cette étude et Alan Kelleher pour le support technique.
Ce travail a été financé par des subventions de l’Université du Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01 a 1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Lignées cellulaires du cancer de la vessie humaine UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J | |||
| Milieu de culture cellulaire DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Sérum fœtal bovin ; | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Antibiotique-Antimycosique (100x) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 ; | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Costar Grappe à 6 puits à fixation ultra-basse ; | Corning | 3471 | |
| Microscope inversé conventionnel | Carl Zeiss | 491206-0001-000 | Utilisation générale pour la culture cellulaire et le contrôle des sphéroïdes |
| Collagène de type 1 à partir de la queue de rat, haute concentration ; | Corning | 354249 | |
| Nunc Lab-Tek II Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Carl Zeiss | LSM800 | Un miscoscope confocal avec chambre climatique, imagerie multi-sites et fonction de balayage Z-stack. | |
| Micromtome cryostat | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| Zen 2 Logiciel de traitement d’images ; | Carl Zeiss | ||
| Solution de paraformaldéhyde | Microscopie électronique Sciences | 15710 | |
| ImmEdge Barrière hydrophobe PAP Pen | Vector Laboratories ; | Composé H4000 | |
| O.C.T ; | Thermo Fisher Scientific | 23730571 | |
| Hoechst 33342 solution ; | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Anticorps anti-ATDC (Trim29) | Sigma-Aldrich | HPA020053 | |
| Anticorps anti-cytokératine 14 | Abcam | ab7800 | |
| Anticorps anti-vimentine | Abcam | ab24525 | |
| ProLong Diamond ; | Support de montage |
Références
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Réimpressions et autorisations
