Article de méthode

Une méthode automatisée pour déterminer la Performance de la drosophile en réponse aux changements de température dans l’espace et le temps

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DOI :

10.3791/58350

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12 octobre 2018

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1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen, 2Department of Cell Biology, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Ruijsink Dynamic Engineering, 4Department of Psychology, University of Groningen

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour déterminer automatiquement la performance locomotrice de la drosophile aux changements de température à l’aide d’une arène programmable à température contrôlée qui produit des changements de température rapide et précis dans le temps et l’espace.

Résumé

Température est un facteur environnemental omniprésent qui influe sur les espèces distribuent et se comportent. Différentes espèces de mouches à fruit drosophile ont des réponses concrètes aux changements de température selon leur tolérance physiologique et l’adaptabilité. Drosophile mouches possèdent également un système devenu fondamentale pour comprendre les bases neurales de la température de transformation en ectothermes thermosensibles. Nous présentons ici une arène à température contrôlée qui permet des changements de température rapides et précis avec contrôle temporel et spatial pour étudier la réponse de mouches individuels aux changements de température. Les mouches individuels sont placés dans l’arène et exposées aux températures préprogrammées défis, tel que progressive uniforme augmente de température pour déterminer les normes de réaction ou de températures distribuées spatialement en même temps afin de déterminer les préférences. Les personnes sont suivies automatiquement, ce qui permet la quantification de la vitesse ou l’emplacement de préférence. Cette méthode permet de quantifier rapidement la réponse sur une large gamme de températures afin de déterminer les courbes de performance de température chez la drosophile ou d’autres insectes de la même taille. En outre, il peut être utilisé pour des études génétiques pour quantifier les préférences de la température et les réactions des mutants ou mouches de type sauvage. Cette méthode peut aider à découvrir la base de la spéciation thermique et adaptation, ainsi que les mécanismes neuronaux derrière la transformation de la température.

Introduction

La température est un facteur environnemental constant qui influe sur les organismes fonctionnent et comportent1. Différences de latitude et altitude conduisent à des différences dans le type de climats organisme sont exposés, qui se traduit par une sélection évolutive pour leurs réponses à température2,3. Organismes réagissent à différentes températures moyennant des adaptations morphologiques, physiologiques et comportementales qui maximisent le rendement dans leurs environnements particuliers4. Par exemple, chez la drosophile Drosophila melanogaster, les populations des différentes régions ont préférences de température différente, dimensions corporelles, developmental fois, longévité, fécondité et performance marche à différentes températures2 ,5,6,7. La diversité observée entre les mouches d’origines différentes s’explique en partie par la variation génétique et expression de gène en plastique8,9. De même, Drosophila espèces provenant de régions différentes répartir différemment entre les gradients de température et montrent les différences de résistance à la chaleur extrême et essais de froid10,11,12.

Drosophile est récemment devenu le modèle de choix pour comprendre les bases génétiques et neurales de température perception13,14,15,16,17. De façon générale, les mouches adultes perçoivent la température par le biais de capteurs de température périphérique chauds et froids dans les antennes et capteurs de température dans le cerveau13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20. les récepteurs de la périphérie pour les températures chaudes expriment Gr28b.d16 ou21de la pyrexie, tandis que la périphérie froides récepteurs sont caractérisés par des Brivido14. Dans le cerveau, la température est traitée par les neurones exprimant TrpA115. Des études comportementales sur les mutants de ces voies sont améliorent notre compréhension de la façon dont la température est traitée et donnent un aperçu des mécanismes qui diffèrent entre les populations de Drosophila provenant de différentes régions.

Nous décrivons ici une arène à température contrôlée qui produit des changements de température rapides et précis. Les enquêteurs peuvent préprogrammer ces changements, qui permet des manipulations de température standardisées et reproductibles sans intervention humaine. Les mouches sont enregistrés et suivis avec un logiciel spécialisé pour déterminer leur position et leur vitesse à différentes phases d’une expérience. La principale mesure présentée dans le présent protocole est la vitesse de marche à des températures différentes, parce que c’est un indice écologiquement pertinent de performance physiologique qui permet d’identifier une adaptabilité thermique individuel5. Ainsi que des mutants de récepteur de température, cette technique peut aider à révéler les mécanismes d’adaptation thermique aux niveaux cellulaires et biochimiques.

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Protocole

1. préparation du milieu alimentaire mouche

  1. Verser 1 L d’eau du robinet dans un bécher de verre de 2 L et ajouter un magnétique. Placer le bécher sur une plaque chauffante magnétique à 300 ° C jusqu'à ce que la température d’ébullition est atteinte.
  2. Remuer à 500 tours/min et ajoutez le code suivant : 10 g d’agar, 30 g de glucose, 15 g de saccharose, 15 g de semoule de maïs, 10 g de germe de blé, 10 g de farine de soja, 30 g de mélasse et 35 g d’active levure sèche.
  3. Lorsque le mélange des mousses vigoureusement, baissez la température de la plaque de cuisson à 120 ° C tout en continuant de remuer.
  4. Tourner à la température de la plaque chauffante plus loin jusqu'à 30 ° C après 10 min et continuer à remuer jusqu'à ce que le mélange refroidisse à 48 ° C. Mesurer la température en insérant un thermomètre directement dans la nourriture sans toucher les parois du bécher.
  5. Dissoudre 2 g d’ester méthylique de l’acide p-hydroxy-benzoïque dans 10 mL d’éthanol à 96 % et ajoutez-le au mélange, avec 5 mL d’acide propionique de 1 M. Continuer à remuer pendant 3 min.
  6. Éteindre la plaque chauffante et versez 45 mL d’aliment dans les bouteilles et les 6,5 mL d’aliment dans les flacons de collection d’élevage.

2. préparation des mouches

  1. Place 20 garçons et 20 filles vole dans les bouteilles d’élevage contenant 45 mL de milieu de nourriture volée. Transférer les mouches de nouvelles bouteilles après 3 à 4 jours en tapant dessus vers le bas et puis les puiser dans les bouteilles fraîches. Jeter les mouches après trois changements.
    1. Placer les bouteilles à l’intérieur de l’incubateur cycles sombres de lumière/12 h 12 h avec une température constante de 25 ° C.
      Remarque : Une nouvelle génération de mouches seront eclose après dix jours.
  2. Anesthésier nouvellement éclos de mouches sur des tampons en dioxyde de carbone pour un maximum de 4 min et à leur rassemblement dans des flacons d’élevage mouche de 2,5 x 9,5 cm 6,5 ml de milieu de nourriture volée à l’aide d’un pinceau.
    1. Recueillir les mouches seulement vierges et séparez-les par sexe en groupes de 20 mouches par flacon d’élevage.
    2. Placer les flacons à l’intérieur des incubateurs pendant 5 à 7 jours, changeant les mouches de nouveaux flacons tous les 2-3 jours et les jours précédant les expériences.

3. cadre de lumières

  1. Faire un cadre en bois de 10 cm de long, largeur 4 cm, hauteur 4 cm et 0,5 cm d’épaisseur.
  2. Sur chacun des bords courts, créer une bordure de 4 cm de long, 4 cm de hauteur et largeur de 1,5 cm vers l’intérieur zone du cadre en bois. Laissez la face interne de l’ouverture de la frontière.
  3. Percer deux trous de 0,5 cm de diamètre à l’intersection de l’un des bords longs de l’armature en bois et à chacune des frontières sur les bords courts.
  4. Placer 10 cm d’une bande de LED blanche chaude à l’intérieur de chacune des frontières sur les bords courts. Peler le dos de la bande de LED à coller immédiatement en place.
    Remarque : Pour des expériences en quel illumination doit être éliminé, la bande de LED blanche chaude peut être substituée à LED infrarouge bandes.
  5. Connectez une extrémité de la bande de LED dans l’une des frontières de l’alimentation à découpage et son autre extrémité de la bande de LED au bord opposé.
  6. Allumez l’alimentation à découpage pour vérifier que les deux bandes de LED s’allume.
  7. Couvrir le côté ouvert de chaque frontière avec une feuille blanche de papier.
  8. Collez un autre morceau de papier sur chacune des phases internes longitudinal.

4. température contrôlée Arena

  1. Allumez l’arène à température contrôlée (Figure 1 a et 1C). S’assurer que le ventilateur se met en marche et l’anneau en aluminium commence à réchauffer.
  2. Utilisez un câble USB pour connecter l’arène à température contrôlée pour l’ordinateur exécutant le script TemperaturePhases avec des séquences de température.
  3. Ouvrez le script TemperaturePhases dans l’ordinateur et vérifiez que la séquence de température est correctement mises en place (vidéo 1).
    1. Vérifiez que la durée de chaque phase expérimentale est réglée à 60 s en vérifiant que « au pair. StimulusDur » est égal à 60 s.
    2. Vérifiez que le numéro 1) égal à désiré nombre de phases, 2) itératifs marche/arrêt réglage de la lumière rouge indicative des diodes électroluminescentes (del), augmentation de la température 3) 2 ° C par phase, et 4) 16 ° C sous la température de départ sont toutes correctes dans le « démarrer l’expérimental section de bloc ».
      Remarque : Laissez les mouches s’acclimater à l’aréna de voler pendant 7 min à 16 ° C afin d’éviter une augmentation artificielle de la vitesse au cours des premières phases expérimentales (Figure 2).
    3. Exécutez le script TemperaturePhases . Le logiciel s’initialise pendant 5 secondes, selon la définition de « arena. Wait » et puis arrêter.
    4. Appuyez sur la barre d’espace du clavier pour commencer à exécuter les phases expérimentales, une fois qu’une mouche a été soufflée dans l’arène de voler (étape 5.3).
      Remarque : Le TemperaturePhases est le script courant, contrôle de la boîte ; Toutefois, il est possible de créer d’autres scripts personnalisés pour utiliser ce dispositif qui s’ajustent aux besoins des différentes expériences.
  4. Connectez la caméra sur le dessus de l’arène à l’ordinateur de l’enregistrement à l’aide du câble USB de la caméra.
  5. Ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (voir Table des matières) dans l’ordinateur de l’enregistrement en sélectionnant « fichier | Nouvel enregistrement de film ». Un écran affichant l’image de la caméra s’ouvrira.
    1. Veiller à ce que l’image de la caméra capte tous les bords de l’arène et les LEDs rouges indicatives.
    2. Démarrer l’enregistrement en appuyant sur le bouton rouge au milieu de la partie inférieure de l’écran montrant l’image de la caméra après avoir réglé l’armature de lumières autour de l’arène (étape 5.4).
      NOTE : petits changements dans l’éclairage peut affecter la précision de la localisation. Il est recommandé de maintenir l’éclairage de l’arène de contrôle de la température constante en fixant l’emplacement de l’appareil.

5. la température des expériences comportementales

  1. Préparer la mouche Arena (Figure 1).
    1. Mettez un brin d’auto-ADHESIF blanc sur le dessus les tuiles en cuivre, assurant que tous les bords sont couverts.
    2. Placez l’anneau d’aluminium chauffée autour des tuiles de cuivre. Le bord de l’anneau s’adapte autour des tuiles en cuivre donc il est toujours placé au même endroit.
    3. Nettoyer le couvercle en verre avec un tissu propre et placez-le sur le dessus de l’anneau en aluminium, en laissant un espace à travers lequel une mouche peut être soufflée dans.
      Remarque : Avant les expériences, recouvrir le couvercle en verre avec l’agent siliconizing pour créer une surface glissante. Appliquer l’agent siliconizing pour 24h et rincez-le à l’eau avant utilisation.
  2. Exécutez le script TemperaturePhases (étape 4.3.3) et ouvrez le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5).
  3. Souffler la volée d’un flacon d’élevage (étape 2.2.2) dans l’arène de voler (e.g., 1 mâle à la mouche dans la Figure 3).
    1. Prendre un flacon de mouches de l’incubateur, touchez deux fois pour les forcer à aller vers le bas, piéger une mouche avec un aspirateur à bouche et fermer le flacon et remettez-le dans l’incubateur.
    2. Placez la mouche sur la scène par le biais de l’écart qui a été laissé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium (étape 5.1.3).
    3. Combler le fossé entre le couvercle en verre et anneau en aluminium en appuyant sur le couvercle en verre jusqu'à ce qu’elle atteigne le bord de l’anneau en aluminium dès que la mouche est introduite dans l’arène de voler.
  4. Placer le cadre de lumières autour de l’arène afin d’assurer l’éclairage symétrique.
    1. Marquer l’emplacement (p. ex.., à l’aide d’un marqueur permanent) de la trame de lumières autour de l’arène de voler (Figure 1) pour s’assurer que le cadre est toujours placé au même endroit.
  5. Démarrer l’enregistrement avec le programme d’enregistrement vidéo (étape 4.5.2) et appuyez sur la barre d’espacement du clavier de l’ordinateur de contrôle pour commencer à exécuter les phases expérimentales (étape 4.3.4).
  6. Phases expérimentales après tout terminés, enregistrer la vidéo au format .mp4 ou .avi et retirer la mouche de l’arène de voler avec l’aspirateur de la bouche.
    Remarque : La fin des phases expérimentales peut être déterminée par les deux LEDs rouges indicatifs étant éteints ou par l’arrêt du script TemperaturePhases .
    1. Arrêter l’enregistrement vidéo en appuyant sur le bouton arrêter au milieu du bord inférieur de l’écran dans le programme d’enregistrement. Appuyez sur « fichier | Enregistrer sous » pour enregistrer la vidéo.

6. lunette Digital video suivi et analyse des données

  1. Utiliser le FlySteps dépistant le logiciel (vidéo 2) pour suivre les vidéos.
    1. Ouvrez le « fichier_configuration.ini » dans le dossier « FlyTracker ».
    2. Définir l’emplacement des vidéos en « video_folder » et les noms des vidéos en « video_files ».
    3. Spécifier les frontières de l’arène de voler en « arena_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de plusieurs points au bord de l’arène.
    4. Spécifier l’emplacement des LEDs rouges indicatives dans « led_settings », basé sur (x, y) coordonnées en pixels de l’emplacement du centre de la LED.
    5. Vérifiez l’emplacement des frontières de l’arène de voler en définissant « debug » à « true » dans « arena_settings », en cliquant sur « Enregistrer » et exécuter le script dans le terminal. Une capture d’écran de la vidéo s’affiche avec un carré bleu formé par les coordonnées saisies dans « arena_settings ».
      Remarque : Cette place entoure la zone à être l’objet d’un suivi.
    6. Changer « debug » dans « arena_settings » à « false », cliquez sur « Enregistrer » et exécutez l’écran dans le terminal une fois de plus.
      NOTE : Ceci va commencer le processus de suivi.
      Remarque : Les mouches peuvent marcher hors de la zone de suivi sur l’anneau en aluminium chauffée. Cela se produit pendant les premières secondes d’une expérience, après quoi les mouches cesser de toucher l’anneau chauffée et restent à l’intérieur de la zone de suivi.
      Remarque : Les vidéos peuvent être suivis avec d’autres logiciels de suivi selon les préférences de l’expérimentateur.
  2. Utilisation (x, y) emplacement de chaque volée fournie par le logiciel de suivi pour calculer la mesure de l’intérêt pour l’exécution de la température. Scripts personnalisés (par exemple., FlyStepsAnalysis en supplémentaires) peut être utilisé.
  3. Comparer les courbes de performances de température des différents groupes de voler à l’aide de mesures répétées (RM) analyse de la variance (ANOVA) et post-hoc des comparaisons multiples à l’aide de logiciels statistiques (voir Table des matières).

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Résultats

L’arène à température contrôlée (Figure 1 a) se compose de trois tuiles de cuivre dont la température peut être contrôlée individuellement grâce à un circuit programmable. Chaque tuile cuivre possède un capteur de température qui donne une rétroaction au circuit programmable. Le circuit déclenche une alimentation pour augmenter la température de chaque tuile. Des éléments thermo-électriques passives agissent comme des éléments de chauffage constante pour main...

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Discussion

Ici, nous avons présenté une automatisé thermorégulées arène (Figure 1) qui produit des changements de température précis dans le temps et l’espace. Cette méthode permet d’exposition individuelle drosophile non seulement préprogrammé augmentation progressive de la température (Figure 2 et Figure 3), mais aussi aux défis de température dynamique où chaque carreau de l’arène de mouche a été chauffé indépendamment, à une tempé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par une bourse d’études du comportement et des programme de neurosciences cognitives de l’Université de Groningue et une bourse d’études supérieures de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) du Mexique, accordée à Andrea Soto-Padilla et une subvention de la Fondation John Templeton pour l’étude du temps attribué à Hedderik van Rijn et Jean-Christophe Billeter. Nous sommes également reconnaissants à Peter Gerrit Bosma pour sa participation à l’élaboration du Traqueur de FlySteps .

Les scripts TemperaturePhases, FlySteps et FlyStepAnalysis se trouve comme information supplémentaire et dans le lien temporaire et rendu publics suivant :
https://dataverse.nl/privateurl.XHTML?Token=c70159ad-4D92-443D-8946-974140d2cb78

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Arduino DueArduinoA000062Software RUG
Electronics BoardRuijsink Dynamic EngineeringFF-Main-02-2014
Alimentation BoostXP-Power 48. V 65 WECS65US48réglé sur 53 volts
Alimentation Chauffage des carreauxXP-Power 15. V 80 WVFT80US15
Alimentation RefroidissementXP-Power 15. V 130 WECS130U515
Eléments PeltierMarlow IndustriesRC12-42 éléments, alimentation DC contrôlée
Dissipateur thermiqueFisher TechnikLA 9/150-230VDécouplé pour vibration
Capteurs de températureSpécialités de mesureMCD_10K3MCD1Micro Thermistance
Sonde Bloc/tuile en cuivreRuijsink Dynamic EngineeringFF-CB-01-2014
Bague AuminumRuijsink Dynamic EngineeringFF-RoF-02-2015
Tesa 4104 ruban blanc 25 x 66 mmRS Components111-2300  ;Ruban conducteur blanc
LED rougesLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daLongueur d’onde entre 625 nm, 20 mAmp et 6 V
Bande LED blanc chaudLedstripkoningHQ-3528-SMD60 LEDs par mètre
Alimentation de commutationGénériqueT-36-12
Logitech c920Logitech Europe S.APN960-001055
QuickTime PlayerEnregistrement sur ordinateur programme
Logiciel d’analyse de suiviRPackages : pacman
Logiciel d’analyse de suiviMATLAB
Imagerie thermiqueFLIR T400sc
Graphs and Statisticts SoftwareGraph Pad Prism
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100MLAgent de siliconation
Flacons d’élevage de mouchesFlystuff32-1306oz Bouteille de stock de drosophile
FlypadFlystuff59-114
Flacons d’élevage de mouchesDominique Dutscher789008Tubes de drosophile étroit 25x95 mm
IncubateurSanyoMIR-154
Plaque chauffante magnétiqueHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ingrédients B.V.010001.26.0
Gézon de glucose& wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseSucre cristallisé
Semoule de maïsFlystuff62-100
Germe de bléGezond& wel1017683
Farine de sojaFlystuff62-115
MélasseFlystuff62-117
Levure sèche activeRed Star
TegoseptFlystuff20-258100 %
Apple

Références

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Mots-clés

R ponse thermique de DrosophilaAr ne temp rature contr l eSuivi automatis des mouchesCourbes de performance thermiqueEssai de pr f rence thermiqueComparaison du fond g n tiqueContr le spatial de la temp ratureChangements temporels de temp ratureAnalyse comportementale des mouchesFonction des r cepteurs thermiques

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