Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte

Résumé

Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser le ciblage axonale avec une protéine fluorescente dans jambes adultes de la drosophile par fixation, montage, imagerie et imageries après étapes.

Résumé

La majorité du travail sur la spécification neuronale a été effectuée dans des modèles génétiquement et physiologiquement docile comme C. elegans, des larves de drosophile et poisson, qui tous s’engager dans des mouvements ondulatoires (comme ramper ou natation) comme leur principal mode de locomotion. Toutefois, un plus sophistiqué de compréhension de la spécification individuelle des motoneurones (MN) — au moins en ce qui concerne l’informant des thérapies pour les maladies — exige un système tout aussi docile qui modélise mieux les schémas complexes de locomotion axée sur l’appendice de vertébrés. Système locomoteur drosophile adult responsable marche répond à tous ces critères avec facilité, étant donné que dans ce modèle, il est possible d’étudier la spécification d’un petit nombre de jambe se distingue facilement MNs (environ 50 MNs par jambe) fois en utilisant un vaste Tableau de puissants outils génétiques et dans le contexte physiologique d’un système de locomotion axée sur les appendices. Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser l’innervation musculaire de la jambe dans une mouche adulte.

Introduction

Comme la branche de vertébrés, les jambes chez l’adulte de drosophile est organisée en segments. Chaque jambe mouche contient 14 muscles, dont chacun est composé de plusieurs fibres musculaires^1,2. Les corps cellulaires de la MNs de jambes chez l’adulte se trouvent dans le T1 (prothoracique), T2 (mésothoracique) et T3 (métathoraciques) ganglions sur chaque côté du cordon nerveux ventral (VNC), une structure analogue à la moelle épinière vertébrée (Figure 1). Il y a environ 50 MNs dans chaque ganglions, qui ciblent les muscles en quatre segments de la jambe homolatérale (c....

Protocole

1. Dissection et la Fixation des jambes

1. Prenez un verre plaque multipuits et le nombre approprié de remplissage des puits avec l’éthanol à 70 %. Ajouter 15 à 20 CO₂-mouches anesthésiés (de sexe et de tout âge) pour chaque bien et à l’aide d’un pinceau, Tamponner doucement les mouches dans la solution d’éthanol jusqu'à ce que les mouches sont complètement submergées.
   Remarque : Cette étape consiste à enlever de l’hydrophobie de la cuticule. Ne pas laver pendant plus de 1 min, parce que cela augmente auto-fluorescence de la cuticule.
2. Rincer les mouches 3 fois avec la solution détergente de 0,3 % tensioactifs non ioniques en 1 x en solut....

Résultats

Comme illustré à la Figure 4, cette procédure permet l’imagerie excellent des axones GFP-étiqueté dans les jambes drosophile adultes, ainsi que de leurs axes terminales. Ce qui est important, un signal propre de la GFP est obtenu sans toute contamination de la fluorescence émise par la cuticule de la jambe. Le signal de la cuticule est cumulable ensuite avec le signal GFP pour identifier le positionnement des axones dans les jambes (

Discussion

La cuticule de drosophile adulte et des autres arthropodes, qui contient de nombreux pigments sombres, constitue un obstacle majeur pour la visualisation des structures à l’intérieur de leur corps. En outre, il est fortement fluorescent auto qui est aggravée par la fixation. Ces deux caractéristiques sont très problématiques pour les observations des colorants fluorescents ou des molécules à l’intérieur de l’organisme des animaux avec un exosquelette.

La procédure que nous avons décrit et que .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol absolu	Fisher	E/6550DF/17	Réactif analytique absolu
détergent tensioactif non ionique	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, pour la biologie moléculaire
Pince fine	Sigma-Aldrich	F6521	Pince de bijoutier, Dumont n° 5
Plaque multipuits en verre	Microscopie électronique Sciences	71563-01	9 cavité Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16 % Formaldéhyde (p/v), sans méthanol
Glycérol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycérol (biologie moléculaire)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, quatre puits, environ 12 &mu ; L volume de travail par puits, 7 mm de diamètre, 0,18 mm de profondeur
Carré 22 mm x 22 mm lamelles Fisher	Scientific	FIS#12-541-B	n° 1,5-0,16 à 0,19 mm d’épaisseur
Montage Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Montage
Microscope confocal	moyen Carl Zeiss		LSM780 ; objectif utilisé LD LCI Plan-Apochromat 25X/0.8 Imm Korr DIC M27 (huile/ silicium/glycérol/eau immersion) (420852-9871-000)
logiciel d’imagerie	Carl Zeiss		ZEN 2011
Logiciel d’image 3D ThermoFisher	Scientific		Amira 6.4
ImageJ	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	ImageJ/FIJI