Le Peptide de40 MUB destinés à détecter l’Inflammation induite par le neutrophile événements

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à détecter la présence de neutrophiles dans les sections fixes/perméabilisées histologie et évaluer l’état d’activation des neutrophiles purifiées direct. En particulier, le peptide de₄₀ MUB lie la lactoferrine présente dans les granules spécifiques neutrophile et tertiaires. Exposition du contenu par perméabilisation ou activation neutrophile granule permet le marquage des neutrophiles.

Résumé

Ici, nous fournissons un protocole impliquant l’utilisation de MUB₄₀, un peptide synthétisé avec le pouvoir de lier la lactoferrine glycosylée stockée à des concentrations élevées dans les granules spécifiques et tertiaires des neutrophiles. Ce détails du protocole comment MUB₄₀ conjugué directement à un fluorophore peuvent être utilisé pour colorer les neutrophiles en fixe/perméabilisées tissus ainsi que la façon dont ceci peut être utilisé dans l’imagerie de cellules vivantes à analyser pour la granulation et activation de neutrophile. Méthodes de détection neutrophiles sont limités à des anticorps monoclonaux spécifiques à l’espèce, qui ne sont pas toujours adaptés pour certaines applications. MUB₄₀ ne pénètre pas la membrane cellulaire et est donc exclu de la lactoferrine stockée dans les neutrophiles non-activé/non-perméabilisées. MUB₄₀ a l’avantage de reconnaître la lactoferrine d’une vaste gamme d’hôtes, ce qui en fait surtout utile pour comparer les résultats dans les études impliquant des modèles de recherche multiple, réduisant le nombre de réactifs en double et en simplifiant les protocoles par la seule étape souillure.

Introduction

Neutrophiles sont une des branches principales du système immunitaire inné et sont systématiquement recrutés aux sites d’inflammation autour du corps. L’étude des neutrophiles a été grandement altérée par leur courte durée de vie in vitro (moins de 8 h) et par les outils de détection limitée dans des conditions basales ou après l’activation. Nous présentons ici un protocole éprouvé pour la détection large et spécifique des neutrophiles mammifères dans les échantillons fixe/perméabilisées. Nous fournissons également un protocole détaillé pour la coloration des neutrophiles direct avec MUB₄₀. En utilisant le protocole de coloration neutrophil direct,....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été examinées et approuvées par les organismes Français CoRC (Comité de Recherche Clinique), CPP (Comité de Protection des Personnes) et CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).

1. coloration des neutrophiles dans le tissu d’histopathologie avec fluorescent étiquetés MUB₄₀

1. Pour obtenir le tissu pour l’histopathologie, difficulté sections/biopsie de tissu dans un volume adéquat de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 30 min à 4 h selon l’épaisseur de l’échantillon. Placer les échantillons dans un réfrigérateur à 4 ° C durant la fixation.
   Remarque : Méthodes de fixation ....

Résultats

Résultats de MUB₄₀-tissus tachés de diapositives d’histopathologie révèlent en général des cellules individuelles, dispersés à travers le tissu. MUB₄₀ taches lactoferrine, qui est présente dans les granules neutrophiles et compartimentée. Ainsi, généralement vu sont ponctuée de taches ou de plusieurs grandes surfaces séparées du signal en provenance des neutrophiles (Figure 1). Il est utile d’ajouter un deuxième marqueur de cellules comm.......

Discussion

Ici, deux essais sont décrits dans lequel le peptide de₄₀ MUB est utilisé pour étudier l’activation et l’inflammation neutrophile. Nous montrons comment MUB₄₀ peut révéler des neutrophiles présent dans les sections de l’histopathologie ou montrent leur état d’activation à l’aide de direct neutrophiles purifiées. Les étapes critiques d’utilisation MUB₄₀ comme réactif de coloration sont les mêmes qu’avec n’importe quelle autre méthode de détection par fluorescence. Il faut pour assurer la c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Peptide fluorescent MUB40 (disponible avec d’autres fluorophores conjugués)
RI-MUB40-Cy5	Benoit Marteyn	benoit.marteyn@pasteur.fr	Peptide MUB40 fluorescent rétro-inverso. Synthétisé avec des acides aminés D et résistant aux protéases (disponible avec d’autres fluorophores conjugués)
Parformaldéhyde	Sigma-Aldrich	16005	Fixateur pour l’histologie
Saccharose	Sigma-Aldrich	S7903	Solution utilisée pour éliminer l’excès de PFA
Composé à température de coupe optimale (OCT)	Sakura Finetek USA	4583	Utilisé pour congeler les tissus avant la coupe du
2-Méthylbutane	Sigma-Aldrich	M32631	Utilisé pour congeler les tissus avant la section du cryostat
Éthanol	Sigma-Aldrich	1.00974	Utilisé pour le bain de glace carbonique pour congeler les tissus
Leica Cryostat	Leica Biosystems	CM1520	Utilisé pour sectionner les tissus
Lames de microscopie en verre	Fisher Scientific	12-518-101
Couvertures	Thor Labs	CG15CH	Couvre-lame de haute précision
Dako pen  ;	Sigma-Aldrich	Z377821	Utilisé pour prévenir la perte de liquide lors de la coloration des tissus
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Utilisé pour perméabiliser les cellules pour la coloration IF
DAPI	Sigma-Aldrich	10236276001	Colore l’ADN  ;
Alexa fluor 488 Phalloïdine  ;	Fisher Scientific	A12379	Lie l’actine
Prolonger l’or anti-effacement Mountant	Fisher Scientific	P36930	Prolonge le signal IF et la résistance au photoblanchiment
Microscope fluorescent	Divers	Divers	Utilisé pour l’imagerie des lames IF Cabinet
anoxique	Divers	Divers	Utilisé pour la purification des neutrophiles inactivés vivants
Chlorure de sodium NaCL	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	Composant de tampon de lavage
Tampon MACS BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	Composant de tampon de lavage
Percoll	Sigma-Aldrich	P4937	Gradient pour la purification des neutrophiles
CD235a microbilles magnétiques de glycophorine	Miltenyi Biotec	130-050-501	Utilisé pour éliminer les globules rouges contaminants
Colonnes LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	Utilisé pour l’élimination des globules rouges des neutrophiles
RPMI-1640 sans rouge de phénol	Sigma-Aldrich	R8755	Utilisé pour les dosages des neutrophiles

cryostat