Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Résumé

Un protocole pour l’élucidation de l’usine de thylakoïdes organisation complexe de protéines et la composition avec bleu natif polyacrylamide gel électrophorèse (BN-PAGE) et 2D-SDS-PAGE est décrite. Le protocole est optimisé pour l' Arabidopsis thaliana, , mais peut être utilisé pour d’autres espèces de plantes avec des modifications mineures.

Résumé

Chaîne de transfert d’électrons photosynthétiques (etc.) convertit l’énergie solaire en énergie chimique sous forme d’ATP et de NADPH. Quatre complexes de grandes protéines incorporées dans le thylakoïdes membrane récolte l’énergie solaire pour conduire des électrons de l’eau à NADP⁺ via deux photosystèmes, utilisez le gradient de protons créé pour la production d’ATP. Photosystème PSII, PSI, cytochrome b₆f (Cyt b₆f) et ATPase sont tous des complexes multiprotéiques avec orientation distincte et dynamique dans la membrane des thylakoïdes. On trouvera des informations précieuses sur la composition et les interactions entre les complexes de protéine dans la membrane des thylakoïdes par solubilisation des complexes de l’intégrité de la membrane par des détergents doux, suivies de la séparation par électrophorèse de gel natif du complexes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode d’analyse utilisée pour la séparation des complexes protéiques sous leur forme native et fonctionnelle. La méthode peut être utilisée pour la purification des protéines complexes pour l’analyse structurale plus détaillée, mais il fournit également un outil pour disséquer les interactions dynamiques entre les complexes de protéine. La méthode a été développée pour l’analyse des complexes de protéine respiratoire mitochondriale, mais depuis a été optimisée et améliorée pour la dissection des complexes protéine thylakoïdes. Ici, nous fournissons un protocole à jour détaillé pour l’analyse des complexes de protéine photosynthétique labile et leurs interactions chez Arabidopsis thaliana.

Introduction

Grandes sous-unités protéiques complexes photosystème PSI et PSII, Cyt b₆f et ATPase coordonnent la production de NADPH et d’ATP dans les réactions photosynthétiques de lumière. Dans les chloroplastes de plantes supérieures, les complexes sont situés dans la membrane des thylakoïdes, qui est une structure de membrane structurellement hétérogène, composée de grana accollées et non accolées stroma thylakoïdes. Électrophorèse en gel de polyacrylamide native bleu (BN-PAGE) est une méthode largement utilisée dans l’analyse des grandes sous-unités protéiques complexes dans leur forme native et biologiquement active. La méthode a été établie pour la dissection de la membrane mitochondriale protéine complexes¹, mais plus tard a été personnalisée pour la séparation des complexes protéiques de la membrane thylakoïde réseau³. La méthode est appropriée (i) pour la purification de complexes protéiques thylakoïdes individuels pour l’analyse structurale, (ii) pour determiner natives interactions complexes protéiques et (iii) l’analyse de l’ensemble de l’Organisation des complexes protéiques sur l’évolution des signaux environnementaux.

Avant la séparation, complexes protéiques sont isolées de la membrane avec des détergents non ioniques soigneusement choisis, qui sont généralement bénins et de préserver la structure native des complexes protéiques. Détergents contiennent hydrophobes et hydrophiles sites et micelles stable forme au-dessus d’une certaine concentration, appelée une concentration micellaire critique (CMC). Augmentation de la concentration de détergent au-dessus des résultats de CMC dans la perturbation des interactions lipides-lipides et la solubilisation des complexes protéiques. Le choix du détergent dépend la stabilité de la protéine complexe d’intérêt et les capacités de solubilisation du détergent. Les détergents utilisés couramment sont α/β-dodécyl-maltoside et digitonine. Suite à la solubilisation des complexes de protéines dans leur état natif, matériel insoluble est enlevé par centrifugation. Chez les plantes supérieures, la membrane thylakoïde est hautement hétérogènes dans la structure et certains détergents (p. ex., la digitonine) solubilisent sélectivement seulement une fraction spécifique de la membrane³. Par conséquent, afin de caractériser l’organisation complexe de la protéine ou les interactions entre les complexes de protéine, il est essentiel de toujours déterminer les capacités de solubilisation du détergent choisi par la détermination de la teneur en chlorophylle et la chlorophylle a/b ratio de surnageant pour évaluer le rendement et le domaine représenté thylakoïdes (void), respectivement, de la fraction solubilisée. Le ratio de la chlorophylle a/b dans les thylakoïdes intacts des plantes acclimatées croissance-lumière est généralement autour de 3, alors que la chl un / valeur b des thylakoïdes fractions enrichies en grana ou stroma thylakoïdes inférieure (~ 2,5) ou est supérieure à la valeur du total (~ 4,5) les thylakoïdes, respectivement.

Pour fournir une charge négative pour les complexes de protéine, colorant (CBB) bleu brillant de Coomassie est ajoutée à l’échantillon solubilisé. En raison de l’évolution de la charge, des complexes de protéines migrent vers l’anode et sont séparés sur un gradient d’acrylamide (AA) selon leur masse moléculaire et de la forme. La séparation efficace et à haute résolution est obtenue en utilisant un gradient de concentration d’acrylamide linéaire. Lors de l’électrophorèse, les complexes de protéines migrent vers l’anode jusqu'à ce qu’ils atteignent leur limite de taille de pore dépendant de la taille. Dépend de la taille des pores du gel de polyacrylamide (i) l’acrylamide total / concentration debis- acrylamide (T) et (ii) sur la réticulant bis- acrylamide monomère concentration (C) par rapport à des monomères total⁴. Après la séparation avec BN-PAGE, les complexes de protéine peuvent être subdivisés en leurs sous-unités de protéine individuelle par seconde dimension (2D) - SDS - PAGE. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’analyse des complexes de protéine de membrane de thylakoid de BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

Protocole

1. préparer le BN Gel^1,2,3

1. Mettre en place le lanceur de sorts de gel avec des plaques de 8 x 10 cm (verre rectangulaire et plaque d’alumine cranté) selon les instructions du fabricant à l’aide de cales d’espacement 0,75 mm.
2. Placer une table de mixage dégradé sur une plaque de remuer et raccorder avec la pompe péristaltique par un tube. Attacher une aiguille de seringue à l’autre extrémité du tuyau et placez l’aiguille entre la plaque de verre et d’aluminium. Agitateur magnétique de place pour le « heavy » (H)-chambre.
3. Préparer les 3,5 % (v/v) et 12,5 % (v/v) des solutions d’acrylamide (AA) dans des tubes à centrifuger coniques 15 mL pour le gradient de gel de séparation (voir la recette dans le tableau 1). Pour empêcher la polymérisation prématurée, garder les tubes à centrifuger sur glace tout en préparant les solutions.
   ATTENTION : L’Acrylamide est neurotoxique et cancérigène, portez des vêtements protecteurs et gants.
4. Ajouter 5 % APS et TEMED droit avant de pipetage les solutions à la table de mixage dégradé. Pipette de la solution de 12,5 % à la chambre d’H.
   1. Enlever les bulles d’air du canal reliant la « lumière » (L) et H-chambre en ouvrant la vanne reliant les deux chambres permettant la solution entrer à la chambre de L. Fermer la vanne et la pipette que les traces de solution retour à H-chambre.
   2. Enfin, la solution de 3,5 % à la chambre de L pipette.
5. Basculez sur l’agitateur magnétique (la vitesse de l’agitation n’est pas critique, mais il doit obtenir un bon mélange des solutions lourdes et légères), ouvrir les vannes et de mettre en marche la pompe péristaltique. Permettre les solutions gel de s’écouler entre la plaque de verre et l’aluminium, le débit devrait être à peu près 0,5 mL/min. L’aiguille doit être au-dessus du liquide tout le temps, il peut être attaché à la partie supérieure de la plaque de verre avec un ruban.
6. Lorsque le H - et L-chambres sont vides, les remplir avec de l’eau ultrapure et laissez l’eau à superposer délicatement la surface du gel. La polymérisation du gel prend environ 1 à 2 heures à température ambiante.
7. Préparer la solution à 3 % d’acrylamide (voir la recette dans le tableau 1) pour l’empilage de gel à RT. pipette le gel de concentration sur le dessus du gel de séparation polymérisé (avant de lancer le gel de concentration, retirez l’eau recouvrant la surface du gel) et placez un échantillon gel peigne entre les verre et l’aluminium plaque éviter bulles d’air.
   1. Laisser pour polymériser 30-60 min à RT. Remove le peigne doucement sous l’eau ultrapure. Stocker le gel à + 4 ° c.
      Point de pause. Le gel peut être conservé à + 4 ° c pendant quelques jours. Le gel doit être conservé dans des conditions humides pour éviter l’assèchement des puits et la surface du gel.

2. thylakoïdes solubilisation^1,2,3

Remarque : Toutes les étapes devraient être effectuées sous très faible éclairage. Conserver les échantillons et les tampons sur la glace.

1. Diluer les thylakoïdes isolés avec tampon 25BTH20G glacée à une concentration de chlorophylle finale de 1 mg/mL. Pour l’analyse 2D-BN-SDS-PAGE à peu près 4-8 µg de chlorophylle / échantillon est approprié.
   Remarque : Les thylakoïdes utilisés dans les expériences doivent être isolés à partir des feuilles fraîches (pour protocole d’isolement de thylakoïdes, voir³)
2. Ajouter un volume égal de détergent tampon, c'est-à-dire 2 % β-DM (p/v) ou 2 % digitonine (p/v). Mélanger le détergent à l’échantillon de thylakoïdes doucement avec le bout de la pipette et éviter de faire des bulles d’air. La concentration finale du détergent est de 1 % et celle des thylakoïdes 0,5 mg Chl/mL.
   1. Solubiliser les thylakoïdes pendant 2 min sur glace (β-DM) ou 10 minutes à RT avec un mélange doux continu sur un rocker/shaker (digitonine).
      Remarque : La digitonine et β-SM sont généralement utilisés pour la solubilisation des complexes protéiques thylakoïdes. Si autres détergents non ioniques sont utilisés, la concentration du détergent et l’heure de solubilisation doivent être tout d’abord optimisés. Habituellement la plage de concentration de détergent de 0,5 à 5 % (v/v).
      ATTENTION : La digitonine est toxique, portez des vêtements protecteurs et gants
3. Retirez le matériau insolubilized par centrifugation à 18 000 x g pendant 20 min, à + 4 ° c.
4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et ajouter 1/10 (v/v) de tampon de CBB à l’échantillon.
   Remarque : Quand on examine la composition globale des complexes de protéine membrane thylakoïde, déterminer le rendement et le domaine de thylakoïdes représenté de fraction solubilisée est recommandé. Pour déterminer le rendement du matériel solubilisé, prendre 5 µL de surnageant dans un nouveau tube (avant d’ajouter le CBB) et mesurer la teneur en Chl et Chl a / b ratio⁵.

3. BN-PAGE^1,2,3

1. Mettre en place le gel pour un système d’électrophorèse verticale (par exemple, 250 SE Hoefer). Remplir la chambre de mémoire tampon supérieure avec un tampon bleu cathode (voir tableau 1) et versez le tampon de l’anode à la chambre basse de la mémoire tampon.
2. Charger l’échantillon de thylakoïdes (p. ex., 5 µg de chlorophylle) dans les puits.
3. Commencez l’électrophorèse et augmentez graduellement la tension : 75 V pendant 30 min, 100 V pendant 30 min, 125 V pendant 30 min, 150 V pendant 1 h et 175 V jusqu'à ce que les complexes ont été complètement séparés. Exécutez le gel à + 4 ° c, soit à l’aide d’une chambre froide ou réglage de la température de gel avec un système de refroidissement.
   Remarque : Changer le tampon bleu cathode dans un buffer de cathode clair lorsque le front de l’échantillon a migré à environ un tiers du gel.
4. Après la manche électrophorétique, scannez le gel avec un photoscanner pour l’archivage des images.

4. 2D-SDS-PAGE

1. Assembler le système d’électrophorèse verticale (gel dimensions 16 cm x 20 cm). Utiliser des cales d’espacement 1 mm.
2. Préparer standard gel SDS (12 % d’acrylamide, 6 M urée, voir recette dans le tableau 2) avec un peigne-2D (single grand bien pour la bande et un puits standard pour marqueur de poids moléculaire).
3. Couper la voie de BN-gel et le placer dans un tube (5 mL). Ajouter 2 mL de tampon de Laemmli (contenant 5 % de β-mercaptoéthanol) et incuber la bande pendant 45 min avec agitant doucement à température ambiante.
4. Placez la voie, avec l’aide de par ex., une entretoise, surface du gel en évitant les bulles d’air.
5. Pipette 5 µL de marqueur de poids moléculaire sur une pièce de papier filtre et place le document à la norme bien étroite.
6. Pour sceller la bande BN-gel et le papier de marqueur, verser 0,5 % d’agarose (dans la mémoire tampon en cours d’exécution) sur le dessus de la bande de gel et laisser pour solidifier.
7. Effectuer l’électrophorèse conformément aux protocoles standards. Après exécution de l’électrophorèse, visualiser les protéines avec par exemple, tache Sypro Ruby ou coloration selon⁶à l’argent.

Résultats

Un système représentatif de 2D-BN/SDS-PAGE à la Figure 1 illustre la séparation de la digitonine et complexes de protéine β-DM-solubilisée thylakoïdes et leur composition de sous-unité protéique détaillée. Le profil complexe protéique de thylakoïdes (gel horizontal en haut sur le dessus de la Figure 1 a) de la digitonine solubilisée contient la mégastructure PSII-LHCII-PSI, deux grandes supercomplexes de PSII-LHCII (sc), supercom...

Discussion

Les machines de conversion d’énergie photosynthétique sont composé de complexes de grandes sous-unités protéiques, qui sont incorporées dans la membrane des thylakoïdes. Ce protocole décrit une méthode de base pour l’analyse des complexes de protéine thylakoïdes plante Arabidopsis thaliana avec BN-PAGE combiné avec 2D-SDS-PAGE. Le protocole est également adapté pour l’analyse des complexes protéiques thylakoïdes des thylakoïdes du tabac et les épinards, mais pourrait nécessiter des petits ajustements.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 6-aminocaproïque (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Attention : Neurotoxique !
n-dodecyl-&beta ;-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urée	VWR	28877.292
Glycérol	J.T. Baker	7044
Fluorure de sodium (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA sel disodique	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Attention :Toxique !
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
&beta ;-mercaptoéthanol	Bio-Rad	1610710
APS (persulfate d’ammonium)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (tétraméthyléthylènediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-méthylène)-bis-acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Marqueur protéique précoloré, large gamme (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, tubes à centrifuger coniques 15 ml	Corning	352093
Roulette de gel double avec plaques de 10 x 8 cm	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0,75 mm Entretoises en T	Hoefer	SE2119T-2-.75
Peigne gel d’échantillons, 0,75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 Système d’électrophorèse verticale	Hoefer	SE250
Pompe IPC	Ismatec
Alimentation, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifugeuse	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813