Article de méthode

Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique

DOI :

10.3791/58370

⸱

7 janvier 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, University Hospital and University of Basel, 2Division of Cardiology, University Hospital Basel

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progéniteurs cardiaques (CPCs) peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour la régénération cardiaque après une blessure. Dans le cœur des mammifères adult, CPCs intrinsèques sont extrêmement rares, mais élargis CPC pourraient être utiles pour la thérapie cellulaire. Une condition préalable à leur utilisation est leur capacité à se différencier de manière contrôlée dans les diverses lignées cardiaques à l’aide de protocoles définis et efficaces. En outre, lors de l’expansion in vitro , CPCs isolement de patients ou modèles précliniques de maladies peuvent offrir des outils de recherche fructueux pour l’étude des mécanismes des maladies.

Les études en cours permet d’identifier les CPCs différents marqueurs. Cependant, tous ne sont exprimés chez les humains, qui limite l’impact translationnelle de certaines études précliniques. Protocoles de différenciation qui s’appliquent quelle que soit l’expression technique et marqueur d’isolation permettra l’expansion normalisée et l’amorçage des SCD fins de thérapie cellulaire. Nous décrivons ici que l’amorçage des SCD dans des conditions de densité faible et une concentration faible sérum fœtal (SVF) facilite la différenciation endothéliale de CPCs. à l’aide de deux différentes sous-populations de souris et rat CPCs, nous montrons que la laminine est un plus substrat approprié que la fibronectine, à cet effet sous le protocole suivant : après mise en culture pour 2 ou 3 jours en moyenne, y compris les suppléments qui maintenir multipotentialité et avec 3,5 % FBS, SCD sont ensemencées sur laminin à < 60 % confluence et cultivées dans milieu sans supplément avec de faibles concentrations de FBS (0,1 %) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. CPCs étant une population hétérogène, les concentrations sériques et temps d’incubation devrez peut-être être ajustée en fonction des propriétés de la sous-population de CPC respectif. Compte tenu de cela, la technique peut être appliquée à d’autres types de CPCs ainsi et fournit une méthode utile pour étudier le potentiel et les mécanismes de différenciation et comment ils sont touchés par la maladie lors de l’utilisation de CPCs isolées de modèles de maladies respectives.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des études récentes soutiennent l’existence de progéniteurs cardiaques résidents (CPCs) dans le cœur des mammifères adultes1,2,3, et CPC pourraient constituer une source utile pour la thérapie cellulaire après lésion cardiaque4, 5. en outre, CPCs élargis peuvent fournir un modèle fructueux pour le dépistage des drogues et l’étude des mécanismes de la maladie quand isolées de patients atteints de cardiomyopathie rare, ou contre les maladies modèles6,7.

SCD isolé du cœur adultes possède des souches/progénitrices cellule caractéristiques1,2,3,8 car ils sont multipotentes, clonogéniques, et ont la capacité d’auto-renouvellement. Cependant, il y a beaucoup de populations différentes (void) des SCD présentant des profils de différents marqueurs de surface, y compris, par exemple, c-kit, Sca-1 et autres, ou récupérée par les techniques d’isolation différents (tableau 1). Plusieurs protocoles de culture et de la différenciation ont été établies1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. Ces protocoles varient principalement en ce qui concerne le facteur de croissance et de la teneur en sérum, qui sont ajustés selon le dessein de la culture et qui peut conduire à des différences dans les résultats, y compris l’efficacité de la différenciation.

Techniques d’isolement basé sur le marqueur :

Les CPC peuvent être isolés basé sur un marqueur de surface spécifique expression1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. Des études antérieures suggèrent que le c-kit et Sca-1 peuvent être les meilleurs marqueurs pour isoler les résidents SCD1,11,14,19,20. Car aucun de ces marqueurs est vraiment spécifique pour les CPC, combinaisons de différents marqueurs sont généralement appliqués. Par exemple, tandis que la SCD expriment des niveaux faibles de c-kit21, c-kit s’exprime également par d’autres types de cellules, y compris les mastocytes22, cellules endothéliales23et de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques24. Un autre problème est le fait que pas tous les marqueurs sont exprimés dans l’ensemble de toutes les espèces. C’est le cas pour Sca-1, qui se déclare chez la souris mais pas chez les humains25. Par conséquent, en utilisant les protocoles qui sont indépendants des marqueurs de l’isolement peut être avantageuse au vu des essais cliniques et études à l’aide d’échantillons humains.

Techniques d’isolement indépendant du marqueur :

Il y a plusieurs techniques majeurs d’isolement de la CPC, qui dépendent principalement de l’expression du marqueur de surface, mais qui peut être affinée par la sélection consécutive des sous-fractions de marqueurs positifs spécifiques si nécessaire (voir également tableau 1). (1) la technique de population (SP) de côté a initialement été caractérisée chez une population primitive de cellules souches hématopoïétiques, basé sur la capacité d’efflux de la teinture d’ADN Hoechst 3334226 par ATP-binding cassette (ABC) transporteurs27. Les cellules cardiaques de SP ont été isolés par différents groupes et signalés d’exprimer une variété de marqueurs avec quelques différences mineures entre les rapports2,8,13,14. (2) cellules de fibroblaste unité formant colonie (UFC-Fs) ont été définis initialement basé sur une cellule stromale mésenchymateuse (CSM)-comme le phénotype. MSCs isolés sont cultivées sur la vaisselle pour induire la formation de colonies. Tel formatrices MSC-comme UFC-Fs peut être isolé du cœur adult et sont capables de se différencier en lignées cardiaque15. (3) Cardiosphere-dérivés des cellules (CDC) sont de simples cellules provenant d’amas de cellules issues de biopsies tissulaires ou explants28,29,30,31. Il a été démontré récemment que pour la plupart la CD105+/CD90 fraction de cellules /c-kit– –pièces cardiomyogénique et potentiel régénératif32.

Ici, à l’aide de SP-CPCs isolés de souris, nous fournissons un protocole pour l’induction efficace de lignée endothéliale basée sur une étude antérieure au SCD de rat et souris SP-SCD33. Le protocole contient des adaptations spécifiques à la culture et technique de l’expansion en ce qui concerne la densité de la cellule, le contenu du sérum du milieu et le substrat. Il peut être appliqué non seulement aux souris SP-SCD, mais aux différents types de CPC dans le but d’induire un commutateur sort d’une amplification à un CPC endothéliales-commis, que ce soit en vue de la transplantation de ces cellules ou leur utilisation pour des études mécanistiques in vitro .

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’utilisation de souris aux fins de l’isolement cellulaire a été conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec la loi de Protection animale Suisse et a été approuvée par les autorités cantonales suisses.

Remarque : L’isolement de Sca-1+/CD31– SP-CPC du coeur de souris se faisait essentiellement comme décrit précédemment34 avec quelques modifications. Pour le matériel et les réactifs utilisés, consultez la Table des matières. Pour toutes les expériences, SP-CPCs cardiaques isolés de souris ont été amplifiés, repiquées et utilisées de manière semblable ligne cellulaire. Passages 7-20 ont été utilisées pour cette étude.

1. préparation du tissu

Remarque : Toutes les expériences à l’aide de la souris doivent effectuer selon les lignes directrices et les règlements. Ce protocole utilise quatre souris. Plaques de culture qui sont de 100 mm de diamètre sont décrits comme P100 et plaques de culture qui sont de 60 mm de diamètre sont décrits comme P60 pour les parties suivantes du protocole.

  1. Injecter chaque souris avec 200 mg/kg de pentobarbital par voie intrapéritonéale (i.p.) et attendez qu’il est complètement anesthésié en vérifiant sa réponse aux pieds de pincement.
  2. Essuyer la poitrine avec l’éthanol à 70 %. Couper la peau et la paroi thoracique avec des ciseaux pour exposer la cavité thoracique.
  3. Soulever le cœur avec une pince et le couper à la base à l’aide de ciseaux. Mettre le coeur dans un P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de froide saline tamponnée au phosphate (PBS) (trois à cinq cœurs par P100) ou un ou deux cœurs par P60.
  4. Pomper le cœur avec une pince à éjecter le sang hors des cavités (Figure 1 a).
  5. Mettre le coeur dans un P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de PBS froid pour le lavage. Supprimer les oreillettes à l’aide de petits ciseaux. Couper le coeur en deux pièces longitudinales et les laver à nouveau dans du PBS glacee (25 mL/P100, 5 mL/P60).
  6. Transférer les morceaux dans un nouveau P100 avec 25 mL (5 mL pour P60) de PBS froid. Couper les morceaux en petits morceaux à l’aide de petits ciseaux (Figure 1 b). Ajouter une goutte de collagénase de 1 mg/mL B dilué dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et émincer les petits morceaux soigneusement avec une lame de rasoir stérile (Figure 1).

2. la digestion

  1. Ajouter 10 mL (2,5 mL pour P60) de la solution de B de collagénase de 1 mg/mL dans le plat à partir de l’étape 1.6.
  2. Mettre la solution de collagènase B contenant les morceaux de cœur hachées dans un incliné (30° environ) P100 (ou P60) dans un incubateur à 37 ° C (Figure 1).
  3. Incuber les morceaux de cœur hachée pour un maximum de 30 min ; homogénéiser en les passant à plusieurs reprises grâce à une pipette Pasteur toutes les 10 min pendant l’incubation (Figure 1E).
    Remarque : Il est important pour ne pas dépasser 30 min d’incubation au total pour l’étape 1.3.

3. filtration

  1. Ajouter 10 mL (5 mL pour P60) de HBSS froide additionné de 2 % BF pour les morceaux de coeur émincé et homogénéisé.
    NOTE : HBSS additionné de 2 % FBS désaltère collagénase activité B.
  2. Filtrer les morceaux de cœur sur 100 µm filtre pour enlever les tissus non digérés et centrifuger à 470 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) (Figure 1F, filtres jaunes).
  3. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL (3 mL pour P60) de tampon de lyse des globules rouges et incuber le granule pendant 5 min avec agitation occasionnels sur la glace.
  4. Ajouter 10 mL (5 mL pour P60) de PBS (pour arrêter la réaction de lyse) et filtrer l’échantillon à travers un filtre de 40 µm à exclure des cellules plus grandes, y compris des cardiomyocytes résiduelles (Figure 1F, filtres bleu).
  5. Centrifuger le tube à 470 x g pendant 5 min à RT (sans frein). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de DMEM dont 10 % FBS.
  6. Compter les cellules dans une partie aliquote avec un hémocytomètre. Remettre en suspension les cellules avec DMEM dont 10 % FBS, visant à une concentration finale de cellule de 1 x 106 cellules/mL.
    NOTE : Environ 5 x 106 cellules de cardiomyocyte et érythrocytes-appauvri peuvent être estimées par la souris.
  7. Distribuer les cellules dans les deux tubes (Figure 2) : dans le tube A, ajouter 1,5 mL pour Hoechst 33342 souiller avec vérapamil ; dans le tube B, ajouter 18,5 mL pour la coloration de Hoechst 33342 et procéder à la tache et trier des cellules cardiaques de SP (mesures 4.1 et 4.2) par cytométrie en flux.

4. le tri des cellules cardiaques SP par cytométrie en flux

NOTE : Vérapamil inhibe l’efflux de Hoechst en bloquant la multirésistance activité de transporteur ABC (MDR). Hoechst 33342 est un colorant de liaison à l’ADN qui permet de détecter le cycle cellulaire, tel qu’il est en corrélation avec le contenu en ADN dans les cellules vivantes. Hoechst 33342-extrusion de cellules s’affichent dans la partie basse de Hoechst sur les deux canaux d’émission (450 nm, Hoechst bleu ; 650 nm, rouge de Hoechst), c'est-à-dire annuler le Hoechst rétention d’eau « population principale », ce qui leur donne leur nom « côté la population ». SP, les cellules sont plus riches en cellules ayant des propriétés de progéniteurs et montrent une forte expression de pharmaco-résistante transporteurs ABC (comme MDR1 et ABCG2). Hoechst 33342 est écrit comme Hoechst pour les parties suivantes du protocole. Il est important de protéger les matériaux sensibles à la lumière des résultats idéaux.

  1. Coloration avec Hoechst en présence et en absence du vérapamil
    1. Ajouter le vérapamil (avec une concentration finale de 83,3 µM) et Hoechst (avec une concentration finale de 5 µg/106 cellules) à la solution de la cellule. Pour tube A, utilisez vérapamil et Hoechst ; pour tube B, réservée aux Hoechst. Incuber dans un bain d’eau (à 37 ° C) pendant 90 min et change les tubes toutes les 20 min (Figure 1).
    2. Centrifuger les tubes à 470 x g pendant 5 min à RT. jeter le surnageant et remettre chaque culot en suspension dans HBSS (1 x 106 cellules/mL).
    3. Prendre un 1.5 mL aliquote pour salissures unique et le contrôle négatif du tube B (Figure 2) : (i) l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-conjugué anti-Sca-1 ; (ii) allophycocyanin (APC)-conjugué anti-CD31 ; (iii) nonstained des cellules (témoin négatif).
      Remarque : Isotype contrôles sont utilisés ici pour mettre en place le protocole d’isolement.
    4. Tubes de centrifugation A et B et les aliquotes de coloration unique et négatif de contrôle à 470 x g pendant 5 min à RT pour le lavage de Hoechst et de vérapamil.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les boulettes du tube A et (iii) le témoin négatif dans 250 µL de HBSS et conservez-les sur la glace dans l’obscurité jusqu’au tri.
    6. Resuspendre le culot du tube B dans 200 µL de HBSS et le culot (i, ii) les aliquotes de coloration unique dans 100 µL de HBSS. Ajouter conjugué FITC anti-Sca-1 (0,6 µg/107 cellules) et APC conjugué anti-CD31 (0,25 µg/107 cellules). Incuber les boulettes pendant 30 minutes sur la glace et les secouer de temps en temps dans l’obscurité.
    7. Ajouter 2 mL de HBSS aux tubes. Centrifuger les tubes à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
    8. Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules tous les 1 ml de HBSS et centrifuger comme ci-dessus. Jeter le surnageant. Resuspendre le culot des aliquotes de coloration unique dans 200 µL de HBSS. Resuspendre le culot du tube B dans HBSS (20 x 106 cellules/mL).
    9. Conserver les échantillons sur la glace et l’abri de la lumière jusqu’au tri.
  2. Tri par cytométrie en flux
    1. Préparer stérile de 1,5 mL tubes avec 500 µL de HBSS dont 2 % de tri FBS.
    2. Colorer les cellules avec 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (0,15 µg/106 cellules) sur la glace pendant 10 min pour exclure les cellules mortes.
    3. Trier le SP cardiaque en utilisant les paramètres suivants : exciter Hoechst à l’aide d’une excitation de 350 nm (UV), émission de fluorescence avec un filtre passe-bande à 450/50 nm (Hoechst bleu) et un filtre passe-bande à 670/30 nm (Hoechst rouge) de percevoir et utiliser une taille de gicleur de 100 µm et la pression de 15 lb/po2.
    4. Pour analyse, inscrivez 5 x 105 événements pour les tri des échantillons et 1 x 105 événements pour le contrôle négatif, contrôle de vérapamil et single-coloration des échantillons.
      Remarque : Le cardiaque SP est d’environ 0,5 % - 2 % (Figure 1 H) mais peut varier entre les laboratoires et les isolats. La Sca-1+/CD31– fraction est d’environ 1 % à 11 % du total PS cardiaque (Figure 1I) mais peut varier entre les laboratoires et les isolats. SCA-1+/CD31– SP-SCD est écrites comme SP-CPC pour les parties suivantes du protocole.

5. primaire Culture des isolés SP-SCD

NOTE : Les trois différents types de médias ont été utilisés dans le présent protocole. Ils sont dénommés moyen 1 (selon Noseda et al.) 8, moyen 2 et 3 moyennes et sont décrits dans la Table des matières au sujet de leur composition.

  1. Réchauffer en moyenne 1 à 37 ° C avant utilisation et refroidir le centrifuger à 4 ° C. Centrifuger les tubes tris à 4 ° C et 470 x g pendant 6 min et remettre en suspension les cellules en moyen 1.
  2. Mettre les cellules sur un plat de P60 perméable au gaz avec 4 mL de milieu 1. Changer le support tous les 3 jours jusqu'à ce que les cellules ont atteint 70 % - 80 % confluence.
    NOTE : Étape 5.2 peut prendre environ 2-3 semaines.

6. l’expansion et la différenciation des SP-SCD

  1. Culture cellulaire
    1. Culture 3 x 105 SP-SCD dans 8 mL de milieu 1 dans une fiole de T75.
    2. Incuber SP-SCD à 37 ° C, avec 5 % de CO2 jusqu’au confluent de 70 à 80 %, changeant le milieu chaque 2-3 jours.
      Remarque : Le nombre de cellules doit être modifié selon le type de CPCs utilisé, le temps de doublement et la taille des cellules.
  2. SP-CPC croissance et la viabilité sous différents taux sériques
    1. La culture SP-CPCs pendant 2-3 jours dans des flacons de T75 avec 8 mL de milieu 1. Aspirer le support avec précaution et rincer doucement avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS.
    2. Traiter les cellules avec 5 mL d’EDTA-trypsine pendant 5 min dans un incubateur à cellules, ajouter 5 mL de milieu 1 d’arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à température ambiante.
    4. Remettre en suspension les cellules moyen 1 ou 2 Medium (milieu d’induction de lignée) et plaque 2,5 x 105 SP-SCD sur P60 plats avec 3 mL de milieu contenant des concentrations sériques différents.
    5. Recueillir le milieu du plat de marche 6.2.4 pour la collection de cellules mortes dans un tube de 15 mL après 2 jours de culture en moyenne 1 ou 2 moyennes.
    6. Trypsinize des cellules adhérentes comme au point 6.2.2 et récupérer la suspension cellulaire dans le tube de 15 mL d’étape 6.2.5. Centrifuger les cellules à 840 x g pendant 5 min à température ambiante.
    7. Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de moyen 1 ou 2 de moyenne pour le comptage des cellules. Détachant SP-SCD avec le bleu trypan (0,4 %) et le comte trypan blue positifs (morts) et trypan blue négatif (viable) cellules.
      Remarque : La viabilité de cellules (étape 6.2.7) est administrée par le nombre de bleu trypan cellule négative par rapport au nombre total de cellules.
  3. Induction de la différenciation endothéliale
    1. Précouche une plaque de culture (6 puits) 10 µg/ml de laminine (LN) ou la fibronectine (FN).
      1. Préparer une solution de substrat contenant 10 µg/mL de LN ou FN avec F12 medium (ou PBS). Ajouter 2 mL de solution de substrat dans chaque puits. Maintenir la plaque pendant 30 min à 37 ° C.
      2. Aspirer la solution de la plaque et ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits jusqu'à l’utiliser.
    2. Aspirez le milieu des cellules de l’étape 6.1.2, rincez-les délicatement avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS, traitez-les avec 5 mL d’EDTA-trypsine pendant 5 min dans un incubateur à cellules, ajouter 5 mL de milieu 1 d’arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à RT. aspirer le surnageant et ajouter 2 Medium pour le comptage des cellules.
    4. Cellules4 graines 8 x 10 / bien sur la plaque de revêtement avec 3 mL de milieu 2 et le maintenir à 37 ° C pendant 20 à 24 h. changement du milieu à 3 mL de milieu 3.
      Remarque : Nous recommandons d’utiliser un milieu contenant une concentration sérique — et sans suppléments — pour la premier 20 à 24 heures. Nous avons recommandé à l’aide de < confluence de cellule de 60 % (c.-à-d., le nombre de cellules de l’étape 6.3.4 doit être adaptée en fonction du taux de taille et la croissance cellulaire).
    5. La culture des cellules pendant 21 jours et changer le support tous les 3 jours.
    6. Vérifier la nature endothéliale de cellules différenciées par leur coloration avec un marqueur endothélial tels que von Willebrand Factor (vWF) et performante la microscopie de fluorescence.
      1. Laver les cellules avec 1 mL de PBS et fixer les cellules en formaldéhyde de 3,7 % pendant 2 min à température ambiante.
      2. Permeabilize les cellules avec 0,1 % Triton X FD2O (ou PBS) pendant 30 min et bloquez-le avec 10 % de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
      3. Incuber les cellules avec l’anticorps d’anti-von Willebrand factor (1/100) pendant 48 h à 4 ° C
      4. Laver les cellules 3 x 1 ml de PBS, pendant 10 minutes chaque fois. Incuber les avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 546 chèvre anti-lapin (1/500) pendant 1 heure à ta dans l’obscurité.
      5. Lavez à nouveau 3 x, pour 10 min chacun, avec 1 mL de PBS. Tacher les noyaux cellulaires avec 4'6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI ; 1/500) pendant 5 min à la RT dans l’obscurité.
      6. Laver les cellules 3 x, de 5 min chacun, avec 1 mL de PBS. Monter les cellules et les stocker à 4 ° C
        Remarque : Les conditions de culture (substrat, milieu, réactifs complémentaires et concentration de FBS) des étapes 6.1 et 6.3 sont décrits à la Figure 3.
  4. Test de formation de tube
    1. Préparer une matrice de la membrane basale (p. ex., Matrigel, désormais dénommé matrice) plaque.
      1. Dégelez la matrice à 4 ° C durant la nuit.
      2. Recouvrir une plaque à 96 puits avec 100µl de la matrice sur la glace.
        Remarque : Il est important d’éviter les bulles dans la matrice. Les plaques doivent être couché sur la glace pour éviter la gélification de la matrice.
      3. Maintenir la plaque à 37 ° C pendant 30 min.
    2. Aspirer le milieu des cellules (à l’issue de l’étape 6.3.5), délicatement rincer les cellules avec 5 mL de tiède (37 ° C) HBSS et traitez-les avec la trypsine-EDTA pendant 5 min dans l’incubateur de la cellule. Ajouter 3 moyen pour arrêter l’activité de la trypsine et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.
    3. Centrifuger les cellules à 470 x g pendant 5 min à RT. aspirer le surnageant, ajouter 1 mL de milieu 3 et pipette doucement.
    4. Les cellules du filtre avec une passoire de cellule 35 µm, si les cellules sont regroupées.
    5. Compter les cellules et 2 x 103 à 4 x 103 cellules dans 100 µL de milieu 3 dans chaque matrice revêtu bien des graines. Maintenir la plaque à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 16 h.
    6. Prenez une photo avec un microscope en champ lumineux à un grossissement de X 2.
      Remarque : Dans le cas d’une trypsinisation incomplète, prolonger le temps d’exposition à la trypsine-EDTA à un maximum de 7-8 min.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolement de souris de SP-CPC :

Dans cette étude, nous avons utilisé des souris CPCs isolés selon le phénotype de la SP, considérant que les résultats de rat CPC sont modifiés et ajoutés dans un rapport antérieur avec permission (Figure 8),33.

Prolifération cellulaire sous haute et basse densité et avec différents taux sé...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Avantages du présent protocole :

Ce protocole prévoit une technique de différenciation endothéliale des SCD. Nous avons constaté qu’une concentration sérique et la densité cellulaire faible pourraient améliorer l’efficacité de la différenciation endothéliale, auquel cas LN s’est avéré pour être un substrat plus adapté que le FN dans ces conditions. Nous avons utilisé deux types distincts de CPCs : rat CPC, qui ont été utilisés dans une manière ligne cellulaire et souris SP-CPC, qui ont été isolés...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Vera Lorenz pour son soutien utile pendant les expériences et le personnel de l’installation de cytométrie en flux du département de biomédecine (DBM), l’université et hôpital de l’Université Bâle. Ce travail a été soutenu par le séjour-sur piste programme de l’Université de Bâle (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster est soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention numéro 310030_156953).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Milieu de culture
Milieu modifié Dulbecco’s (IMDM)ThermoFisher#12440
Milieu modifié Eagle’s Dulbecco (DMEM)/Mélange de nutriments F12 JambonMerck#D8437
Pénicilline-Streptomycine (P/S)ThermoFisher#15140122
Bovin fœtal Sérum (FBS)Hyclone#SH300713,5 % (0,1 % pour l’induction de la lignée)
L-Glutamine  ;ThermoFisher#25030Concentration finale 2 mM
GlutathionMerck#G6013
Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF)Peprotech#AF-100-15
Facteur de croissance des fibroblastes de base recombinant (FGF)Peprotech#AF-100-18B
B27 SupplémentThermoFisher#17504044
Cardiotrophine 1  ;Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Suisse#100-125
saline équilibrée de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#14170
0,05 % Trypsine-EDTAThermoFisher#25300
Fiole T75Sarstedt#83.3911
Différenciation endothéliale  ;   ;
Milieu de croissance des cellules endothéliales (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Ham’s F-12K (Kaighn’s) MediumThermoFisher#21127
Laminin  ;Merck#L2020
Fibronectine  ;Merck#F4759Dilué dans ddH2O
6 Well PlateFalcon#353046
Solution de formaldéhydeMerck#F1635Diluite 1:10 dans PBS (concentration finale de 3,7 %)
Triton X-100Merck#934200,1 % dans ddH2O
Sérum de chèvre normal (10 %)ThermoFisher#50062Z
Anticorps anti-von Willebrand FactorAbcam#ab69941:100 dans 10 % de sérum de chèvre
IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 546ThermoFisher#A110101:500 dans 10 % de sérum de chèvre
4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI)ThermoFisher#622471:500 dans ddH2O  ;
SlowFade Antifade KitThermoFisher#S2828
BX63 microscope grand champOlympus
Tube formation
96 Well PlateFalcon#353072
5 ml Tube à fond rond avec capuchon de crépineFalcon#352235
Matrigel Facteur de croissance réduitCorning#354230
IX50 microscope grand champOlympus
Sca-1+/CD31- isolement de la population côté cardiaque34  ;
réactifs
Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet.pharmacie hospitalière interne#9077862Solution de travail : 200 mg/kg
de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)ThermoFisher#20012
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), rouge de phénol (-)ThermoFisher#14175Préparez HBSS 500 mL + 2 % FBS  ; pour éteindre l’activité de la collagénase B  ;
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 1g/L de D-glucose, L-Glutamine, PyruvateThermoFisher#331885Prepare DMEM + 10 % FBS  ; + 25 mM HEPES+ P/S pour Hoechst stanining
Pénicilline-Streptomycine  ; (P/S)ThermoFisher#15140122
HEPES 1 MThermoFisher#15630080Concentration finale 25 mM
Sérum fœtal de bovin (FBS)Hyclone#SH30071
RBC LysisBuffer (10X)BioLegend#420301/100mLDiluer à 1X dans ddH2O et filtrer à travers un 0,2 µ ; m filtre
Collagénase BMerck#11088807001Concentration finale 1 mg/mL dans HBSS, filtré à travers un 0,2 µ ; m filtre
bisBenzimide H33342 Trichlorhydrate (Hoechst)Merck#B2261Préparer 1 mg/mL dans ddH2O
Verapamil-chlorhydrate  ;Merck#V4629Concentration finale 83,3 & micro ; M  ;
APC Rat Anti-Souris CD31BD Biosciences#5512620.25 µ ; g/107cells
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)BD Biosciences#5574050.6 µ ; g/107cells
7-aminoactinomycine D (7-ADD)ThermoFisher#A13100,15 µ ; g/106cells
APC rat IgG2a k Contrôle des isotypesBD Biosciences#5539320.25 µ ; g/107cells
FITC Rat IgG2a k Contrôle des isotypesBD Biosciences#5546880.6 µ ; g/107cells
Material
Needles 27GTerumo#NN-2719R
Aiguilles 18GTerumo#NN-1838S Seringues
à usage unique 1 mL stérileCODAN#62.1640
Pipette de transfert 3,5 mLSarstedt#86.1171.001
Cell Passoire 40 & micro ; m bleuBD Biosciences  ;#352340
Filtre à cellules 100 & micro ; m jauneBD Biosciences#352360
Lumox Dish 50Sarstedt#94.6077.305
Plats de culture P100Corning#353003
Plats de culture P60Corning#353004
Mouse
LineAgeBreeding
C57BL/6NRj / mâle12 semainesen maison
Product NameCompanyN° de catalogue
Reagents
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)ThermoFisher#12440
Milieu d’aigle modifié (DMEM)/Mélange de nutriments F12 Jambon Merck#D8437
Pénicilline-Streptomycine  ; (P/S)ThermoFisher#15140122
Sérum fœtal bovin (FBS)Hyclone#SH30071
L-Glutamine  ;ThermoFisher#25030
Supplément de glutathionMerck#G6013
B27ThermoFisher#17504044
Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF)Peprotech#AF-100-15
Facteur de croissance des fibroblastes basiques recombinants (FGF)Peprotech#AF-100-18B
Cardiotrophine 1  ;Peprotech#250-25
ThrombinDiagontech AG, Suisse  ;#100-125
Milieu de croissance cellulaire endothéliale (EGM)-2 BulletKitLonza#CC-3162
Vue d’ensemble des compositions de médiums. Certaines de ces informations sont identiques à celles fournies ci-dessus, mais classées selon la composition des médias 1 à 3.
Product NameMedium 18Medium 2Medium 3
ReagentsCultureInduction de la lignéeEndothelial diff.
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)35%35 %
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/Mélange nutritif F12 Ham65%65 %
Pénicilline-Streptomycine  ; (P/S)1%1 %
Sérum fœtal bovin (FBS)3,5 %&le ; 0,1 %
L-glutamine  ;2 mM2 mM
Glutathion0,2 nM0,2 nM
Supplément de B271,3 %
Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF)6,5 ng/mL
Facteur de croissance des fibroblastes basiques recombinants (FGF)13 ng/mL
Cardiotrophine 1  ;0,65 ng/mL
Thrombine0,0005 U/mLTous les composants nécessaires inclus dans le kit
Milieu de croissance des cellules endothéliales (EGM)-2 BulletKitTous les composants nécessaires inclus dans le kit
Solution

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
  2. Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
  3. Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).
  4. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  5. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
  6. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
  7. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
  8. Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930(2015).
  9. Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
  10. El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
  11. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
  12. Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
  13. Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
  14. Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
  15. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
  16. Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
  17. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  18. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
  19. Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
  20. Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
  21. Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
  22. Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
  23. Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
  24. Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
  25. Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  27. Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
  28. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
  29. Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195(2009).
  30. Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669(2011).
  31. Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
  32. Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).
  33. Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
  34. Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
  35. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  36. Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Th rapie cellulaireengagement de lign esubstrat de laminineformation de tubesmicroscopie fluorescencedensit cellulairedigestion la collag nase

Articles connexes