Ce protocole décrit une technique de différenciation endothéliale de cellules progénitrices cardiaque. Il se concentre particulièrement sur comment la concentration sérique et la densité cellulaire-ensemencement affectent le potentiel de différenciation endothéliale.
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Article de méthode
Induction de la différenciation endothéliale dans les cellules progénitrices cardiaque dans des Conditions de faible taux sérique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Progéniteurs cardiaques (CPCs) peuvent avoir un potentiel thérapeutique pour la régénération cardiaque après une blessure. Dans le cœur des mammifères adult, CPCs intrinsèques sont extrêmement rares, mais élargis CPC pourraient être utiles pour la thérapie cellulaire. Une condition préalable à leur utilisation est leur capacité à se différencier de manière contrôlée dans les diverses lignées cardiaques à l’aide de protocoles définis et efficaces. En outre, lors de l’expansion in vitro , CPCs isolement de patients ou modèles précliniques de maladies peuvent offrir des outils de recherche fructueux pour l’étude des mécanismes des maladies.
Les études en cours permet d’identifier les CPCs différents marqueurs. Cependant, tous ne sont exprimés chez les humains, qui limite l’impact translationnelle de certaines études précliniques. Protocoles de différenciation qui s’appliquent quelle que soit l’expression technique et marqueur d’isolation permettra l’expansion normalisée et l’amorçage des SCD fins de thérapie cellulaire. Nous décrivons ici que l’amorçage des SCD dans des conditions de densité faible et une concentration faible sérum fœtal (SVF) facilite la différenciation endothéliale de CPCs. à l’aide de deux différentes sous-populations de souris et rat CPCs, nous montrons que la laminine est un plus substrat approprié que la fibronectine, à cet effet sous le protocole suivant : après mise en culture pour 2 ou 3 jours en moyenne, y compris les suppléments qui maintenir multipotentialité et avec 3,5 % FBS, SCD sont ensemencées sur laminin à < 60 % confluence et cultivées dans milieu sans supplément avec de faibles concentrations de FBS (0,1 %) pendant 20 à 24 heures avant la différenciation dans le milieu de la différenciation endothéliale. CPCs étant une population hétérogène, les concentrations sériques et temps d’incubation devrez peut-être être ajustée en fonction des propriétés de la sous-population de CPC respectif. Compte tenu de cela, la technique peut être appliquée à d’autres types de CPCs ainsi et fournit une méthode utile pour étudier le potentiel et les mécanismes de différenciation et comment ils sont touchés par la maladie lors de l’utilisation de CPCs isolées de modèles de maladies respectives.
Introduction
Des études récentes soutiennent l’existence de progéniteurs cardiaques résidents (CPCs) dans le cœur des mammifères adultes1,2,3, et CPC pourraient constituer une source utile pour la thérapie cellulaire après lésion cardiaque4, 5. en outre, CPCs élargis peuvent fournir un modèle fructueux pour le dépistage des drogues et l’étude des mécanismes de la maladie quand isolées de patients atteints de cardiomyopathie rare, ou contre les maladies modèles6,7.
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Protocole
L’utilisation de souris aux fins de l’isolement cellulaire a été conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec la loi de Protection animale Suisse et a été approuvée par les autorités cantonales suisses.
Remarque : L’isolement de Sca-1+/CD31– SP-CPC du coeur de souris se faisait essentiellement comme décrit précédemment34 avec quelques modifications. Pour le matériel et les réactifs utilisés, consultez la Table des matières. Pour toutes les expériences, SP-CPCs cardiaques isolés de souris ont été amplifiés, repiquées et utilisées de maniè....
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Résultats
Isolement de souris de SP-CPC :
Dans cette étude, nous avons utilisé des souris CPCs isolés selon le phénotype de la SP, considérant que les résultats de rat CPC sont modifiés et ajoutés dans un rapport antérieur avec permission (Figure 8),33.
Prolifération cellulaire sous haute et basse densité et avec différents taux sé.......
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Discussion
Avantages du présent protocole :
Ce protocole prévoit une technique de différenciation endothéliale des SCD. Nous avons constaté qu’une concentration sérique et la densité cellulaire faible pourraient améliorer l’efficacité de la différenciation endothéliale, auquel cas LN s’est avéré pour être un substrat plus adapté que le FN dans ces conditions. Nous avons utilisé deux types distincts de CPCs : rat CPC, qui ont été utilisés dans une manière ligne cellulaire et souris SP-CPC, qui ont été isolés.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Vera Lorenz pour son soutien utile pendant les expériences et le personnel de l’installation de cytométrie en flux du département de biomédecine (DBM), l’université et hôpital de l’Université Bâle. Ce travail a été soutenu par le séjour-sur piste programme de l’Université de Bâle (Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster est soutenu par une subvention de la Swiss National Science Foundation (subvention numéro 310030_156953).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu de culture | |||
| Milieu modifié Dulbecco’s (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Milieu modifié Eagle’s Dulbecco (DMEM)/Mélange de nutriments F12 Jambon | Merck | #D8437 | |
| Pénicilline-Streptomycine (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Bovin fœtal Sérum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3,5 % (0,1 % pour l’induction de la lignée) |
| L-Glutamine ; | ThermoFisher | #25030 | Concentration finale 2 mM |
| Glutathion | Merck | #G6013 | |
| Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Facteur de croissance des fibroblastes de base recombinant (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplément | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophine 1 ; | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Suisse | #100-125 | |
| saline équilibrée de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0,05 % Trypsine-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| Fiole T75 | Sarstedt | #83.3911 | |
| Différenciation endothéliale ; ; | |||
| Milieu de croissance des cellules endothéliales (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham’s F-12K (Kaighn’s) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin ; | Merck | #L2020 | |
| Fibronectine ; | Merck | #F4759 | Dilué dans ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Solution de formaldéhyde | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 dans PBS (concentration finale de 3,7 %) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0,1 % dans ddH2O |
| Sérum de chèvre normal (10 %) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anticorps anti-von Willebrand Factor | Abcam | #ab6994 | 1:100 dans 10 % de sérum de chèvre |
| IgG anti-lapin de chèvre, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 dans 10 % de sérum de chèvre |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 dans ddH2O ; |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 microscope grand champ | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Tube à fond rond avec capuchon de crépine | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Facteur de croissance réduit | Corning | #354230 | |
| IX50 microscope grand champ | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- isolement de la population côté cardiaque34 ; | |||
| réactifs | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | pharmacie hospitalière interne | #9077862 | Solution de travail : 200 mg/kg |
| de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), rouge de phénol (-) | ThermoFisher | #14175 | Préparez HBSS 500 mL + 2 % FBS ; pour éteindre l’activité de la collagénase B ; |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) 1g/L de D-glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10 % FBS ; + 25 mM HEPES+ P/S pour Hoechst stanining |
| Pénicilline-Streptomycine ; (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Concentration finale 25 mM |
| Sérum fœtal de bovin (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Diluer à 1X dans ddH2O et filtrer à travers un 0,2 µ ; m filtre |
| Collagénase B | Merck | #11088807001 | Concentration finale 1 mg/mL dans HBSS, filtré à travers un 0,2 µ ; m filtre |
| bisBenzimide H33342 Trichlorhydrate (Hoechst) | Merck | #B2261 | Préparer 1 mg/mL dans ddH2O |
| Verapamil-chlorhydrate ; | Merck | #V4629 | Concentration finale 83,3 & micro ; M ; |
| APC Rat Anti-Souris CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µ ; g/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µ ; g/107cells |
| 7-aminoactinomycine D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0,15 µ ; g/106cells |
| APC rat IgG2a k Contrôle des isotypes | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µ ; g/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Contrôle des isotypes | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µ ; g/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Aiguilles 18G | Terumo | #NN-1838S Seringues | |
| à usage unique 1 mL stérile | CODAN | #62.1640 | |
| Pipette de transfert 3,5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Passoire 40 & micro ; m bleu | BD Biosciences ; | #352340 | |
| Filtre à cellules 100 & micro ; m jaune | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Plats de culture P100 | Corning | #353003 | |
| Plats de culture P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / mâle | 12 semaines | en maison | |
| Product Name | Company | N° de catalogue | |
| Reagents | |||
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Milieu d’aigle modifié (DMEM)/Mélange de nutriments F12 Jambon Merck | #D8437 | ||
| Pénicilline-Streptomycine ; (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine ; | ThermoFisher | #25030 | |
| Supplément de glutathion | Merck | #G6013 | |
| B27 | ThermoFisher | #17504044 | |
| Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Facteur de croissance des fibroblastes basiques recombinants (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophine 1 ; | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Suisse ; | #100-125 | |
| Milieu de croissance cellulaire endothéliale (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Vue d’ensemble des compositions de médiums. Certaines de ces informations sont identiques à celles fournies ci-dessus, mais classées selon la composition des médias 1 à 3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Induction de la lignée | Endothelial diff. |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | 35% | 35 % | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/Mélange nutritif F12 Ham | 65% | 65 % | |
| Pénicilline-Streptomycine ; (P/S) | 1% | 1 % | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | 3,5 % | &le ; 0,1 % | |
| L-glutamine ; | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathion | 0,2 nM | 0,2 nM | |
| Supplément de B27 | 1,3 % | ||
| Facteur de croissance épidermique humain recombinant (EGF) | 6,5 ng/mL | ||
| Facteur de croissance des fibroblastes basiques recombinants (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophine 1 ; | 0,65 ng/mL | ||
| Thrombine | 0,0005 U/mL | Tous les composants nécessaires inclus dans le kit | |
| Milieu de croissance des cellules endothéliales (EGM)-2 BulletKit | Tous les composants nécessaires inclus dans le kit |
Références
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
