Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

Résumé

Est présenté ici, un protocole d’analyse moyen - à haut-débit des événements de phosphorylation de la protéine au niveau cellulaire. Phospho cytométrie en flux est une approche puissante pour caractériser des aberrations signalisation, identifier et valider des biomarqueurs et évaluer pharmacodynamique.

Résumé

Signalisation cellulaire aberrante joue un rôle central dans le développement du cancer et de la progression. Plus de nouvelles thérapies ciblées visent en effet les protéines et les fonctions des protéines et des aberrations signalisation cellulaire peuvent donc servir de biomarqueurs pour indiquer les options de traitement personnalisé. Par opposition à des analyses d’ADN et d’ARN, changements dans l’activité de la protéine peuvent évaluer plus efficacement les mécanismes qui sous-tendent la résistance et sensibilité aux médicaments. Phospho cytométrie en flux est une technique puissante qui mesure les événements de phosphorylation de la protéine au niveau cellulaire, une caractéristique importante qui distingue cette méthode d’autres approches axées sur les anticorps. La méthode permet l’analyse simultanée de plusieurs protéines de signalisation. En combinaison avec cellule fluorescente barcoding, grands ensembles de données moyen - à haut-débit peuvent être acquis par matériel standard cytomètre en peu de temps. Phospho-cytométrie a des applications aussi bien dans des études de biologie fondamentale et en recherche clinique, y compris l’analyse, découverte de biomarqueurs et l’évaluation de la pharmacodynamique de signalisation. Ici, un plan expérimental détaillé est fourni pour l’analyse de flux de phospho de cellules mononucléaires de sang périphérique purifiée, utilisant des cellules de la leucémie lymphoïde chronique à titre d’exemple.

Introduction

Phospho cytométrie en flux est utilisé pour analyser le taux de phosphorylation de protéines à cellule unique résolution. L’objectif global de la méthode consiste à mapper les modèles de signalisation cellulaires dans des conditions spécifiées. En exploitant la capacité multiparamétrique de cytométrie en flux, plusieurs voies de signalisation peuvent être analysés simultanément dans différents sous-ensembles d’une population de cellules hétérogènes tels que du sang périphérique. Ces traits de caractère offrent des avantages par rapport aux autres technologies axées sur les anticorps comme immunohistochimie, immuno enzymatique (ELISA), alignement de protéine et inversion de phase protéine tableau (RPPA)¹. Cytométrie en flux phospho est cumulable avec cellule fluorescente barcoding (FCB), ce qui signifie que les échantillons de cellules individuelles sont étiquetés avec des signatures uniques de colorants fluorescents afin qu’ils peuvent être mélangés entre eux, colorées et analysés comme un seul échantillon². Cela réduit la consommation d’anticorps, augmente la robustesse des données grâce à la combinaison du contrôle et des échantillons traités et améliore la vitesse d’acquisition. La population combinée de FCB soient divisée en plus petits échantillons et colorée avec jusqu'à 35 anticorps phospho-spécifiques distincts, selon la quantité de matière première. Grandes expériences de profilage peuvent, ainsi, être exécutés avec le matériel standard cytomètre. Phospho écoulement cytometry a été appliqué au profil de signalisation dans les échantillons des patients de plusieurs cancers hématologiques, y compris la leucémie lymphoïde chronique (LLC)^3,4,5, leucémie myéloïde aiguë (LMA) de lymphomes non hodgkiniens et ^{6 7}. Phospho cytométrie en flux est donc une approche puissante pour caractériser des aberrations signalisation, identifier et valider des biomarqueurs et évaluer pharmacodynamique.

Ici, le protocole optimisé pour l’analyse des échantillons de patients de CLL par cytométrie en flux phospho est fourni (Figure 1 a). Exemples de caractérisation de signalisation basale, stimulation des récepteurs cellulaires anti-IgM/B et perturbation de la drogue sont indiqués. Une description détaillée d’une matrice FCB est fournie. Le protocole peut facilement être adapté à d’autres types de cellules de suspension.

Protocole

Des échantillons de sang ont été reçues après consentement éclairé de tous les donateurs. L’étude a été approuvée par le Comité régional à usage médical et de santé recherche éthique de la Norvège au sud-est et la recherche sur le sang humain a été effectuée conformément à la déclaration d’Helsinki⁸.

Remarque : Étapes 1-3 devraient être effectuées dans des conditions stériles sous une hotte de culture de tissus.

1. isolement de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des échantillons de sang de patients de CLL

ATTENTION : Le sang humain doit être manipulé conformément aux règlements de niveau de biosécurité 2.

1. Diluer le sang de 1:1 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS : 136,9 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10,1 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) et le transfert aux tubes de 50 mL (tube de 30 mL).
2. Soigneusement la couche 10 mL d’un milieu de gradient de densité (par exemple, Lymphoprep) au fond du tube à l’aide d’une pipette 10 mL.
3. Centrifuger à 800 x g pendant 20 min à 4 ° C. Les PBMC sont maintenant visibles sur le dessus de la couche moyenne gradient de densité.
4. Utiliser une pipette Pasteur pour transférer les cellules dans deux nouveaux tubes de 50 mL. Laver deux fois avec du PBS (remplir les tubes).
5. Centrifuger à 350 x g pendant 15 min. jeter le surnageant et remettre en suspension dans 3 mL de PBS.
6. Compter les cellules à l’aide d’une méthode de choix.
7. Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min. jeter le surnageant. Remarque : Étapes de 1,8 à 3,2 sont facultatives. Il est possible de passer directement à l’étape 3.3.
8. Remettre en suspension les cellules en sérum fœtal (SVF) additionné de 10 % le diméthylsulfoxyde (DMSO) et gèle vers le bas en aliquotes appropriés à l’aide de cryo tubes.
   Remarque : DMSO est toxique pour les cellules. Travail rapide une fois que les cellules sont mélangées avec FBS/DMSO. Les cellules peuvent être stockées à long terme dans l’azote liquide.

2. la décongélation des cellules

1. Rapidement décongeler les cellules dans un bain-marie à 37 ° C.
   Remarque : DMSO est toxique pour les cellules. Travailler vite pour limiter l’exposition au DMSO.
2. Laver les cellules une fois avec 10 mL de froid milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640 avec GlutaMAX supplémentaire, voir Table des matières).
3. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
4. Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI 1640 additionné de pyruvate de sodium, des acides aminés non essentiels MEM et pénicilline/streptomycine (ajouté à une dilution 1 x conformément aux instructions) et 10 % FBS. Transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire petit et laisser dans un incubateur à 5 % CO₂, 37 ° C pendant 1 heure pour permettre les cellules à calibrer.

3. préparation des cellules

1. Compter les cellules viables à l’aide d’une méthode de choix.
2. Transférer les cellules dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
3. Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI 1640 (étape 2.2) additionnés de 1 % FBS à pas plus de 50 x 10⁶ cellules/mL.
4. Transférer le montant requis de suspension cellulaire à Herbert George wells dans une plaque de fond V 96 puits.
   Remarque : Nombre de puits correspond au nombre des conditions à tester. Échantillons pour un temps de stimulation sont tirés d’un puits unique. Calculer 50 µL d’échantillon par point dans le temps + 50 µL de volume mort. Enregistrer les échantillons pour les contrôles de compensation (un échantillon non coloré + un échantillon par codes à barres colorant).
5. Transférer la plaque 96 puits dans un bain d’eau préchauffée 37 ° C. Reposer les cellules pendant 10 min.

4. la stimulation et la Fixation des cellules

Remarque : Effectuez les étapes 4-8 sur le banc de laboratoire (c.-à-d., non stérile).

ATTENTION : L’ingrédient principal du tampon Difficulté j’ai est paraformaldéhyde, qui est toxique (contact peau et inhalation). Manipuler avec précaution.

1. Préparer une plaque de fond en V puits 96 60 µl de tampon de Difficulté j’ai / puits par échantillon. Laisser dans le bain-marie à 37 ° C.
   Remarque : Cellules : Solution tampon devrait être de 1:1. Pour permettre l’évaporation à 37 ° C, le tampon de Fix est initialement dans l’abondance.
2. Vous pouvez également traiter les cellules avec des médicaments avant la stimulation.
3. Transférer un échantillon témoin de 50 µL dans la plaque de fix. La composition de pipetage de haut en bas.
4. Éventuellement, commencer la stimulation temporelle en ajoutant 10 µg/mL anti-IgM aux cellules. La composition de pipetage de haut en bas.
5. Transférer un 50 µL d’échantillon à la plaque de fix à chaque instant. La composition de pipetage de haut en bas.
   Remarque : IgM anti-induite est généralement initié au début de la signalisation (minutes).
6. Laisser la plaque de fix à 37 ° C pendant 10 min après que le dernier échantillon a été ajouté.

5. fluorescent cellule Barcoding (FCB)

Remarque : Voir le tableau 1 pour une liste de codes à barres réactifs.

1. Laver les cellules fixes 3 x avec du PBS (remplir les puits).
2. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
3. Préparer une plaque de fond en V puits 96 avec des réactifs de codes à barres. Pipette 5 µL de chaque réactif de codes à barres / puits dans le nombre de combinaisons pour colorer tous les échantillons après la matrice de coloration, par exemple, dans la Figure 1 b. Chaque échantillon aura une combinaison unique des concentrations de différents codes à barres.
4. Remettre en suspension les cellules en 190 µL de PBS et transfert sur la plaque de code à barres. Mélanger soigneusement.
   Remarque : Détachant un échantillon de compensation la plus forte concentration finale utilisée pour chaque réactif de codes à barres et enregistrer un échantillon non coloré.
5. Laissez les cellules pendant 20 min à température ambiante, dans l’obscurité.
6. Laver les cellules colorées 2 x avec lavage de flux (PBS, 1 % FBS, 0,09 % d’azide de sodium) (remplir les puits).
7. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
8. Ajouter 190 µL de lavage de flux dans les cellules et combiner les échantillons avec code à barres dans un tube de 15 mL. Transférer chaque commande de compensation dans un tube séparé de 1,7 mL.
9. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.

6. cellule perméabilisation pour la coloration des antigènes intracellulaires

ATTENTION : L’ingrédient principal de Perm tampon III est de méthanol qui est toxique (contact par inhalation et la peau) et inflammable. Manipuler avec précaution.

1. Transférer 2 mL de Perm tampon III dans un tube de 15 mL. Laissez à-20 ° C n’est glacée après utilisation.
   Remarque : On peut laisser le tampon de Perm à-20 ° C dès le début de l’expérience.
2. Ajouter 1,5 mL de tampon de Perm glacé à la population de cellules avec code à barres (dans un tube de 15 mL) et 100 µL à chaque commande de compensation (dans des tubes de 1,7 mL) titration en vortex pour éviter que les cellules s’agglutiner ensemble.
3. Les cellules de transfert directement à-80 ° C. Laissez pendant au moins 30 min.
   Remarque : Il est naturel de mettre en pause l’expérience à ce stade. Les cellules dans un tampon Perm peuvent être stockées à long terme à-80 ° C.

7. anticorps

Remarque : Voir Table des matières pour obtenir une liste des déclarés anticorps phospho-spécifiques.

1. Les cellules de transfert de-80 ° C à une boîte de glace.
2. Laver 3 x avec lavage de flux.
   Remarque : Il est important d’ajouter le flux lavage en excès pour voir le culot cellulaire, par exemple, ajouter 3 mL de lavage de flux à la population de cellules avec code à barres et 1 mL pour chaque commande de compensation.
3. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
4. Resuspendre la population de cellules avec code à barres dans un volume de lavage de flux, qui permet à 25 µL de suspension cellulaire par coloration phospho-anticorps. Resuspendre les commandes de compensation dans 200 µL de lavage de flux.
5. Préparer des anticorps pour la coloration dans une plaque de fond V 96 puits. Le volume final sera 50 µL/puits. Par puits, ajoutez l’anticorps phospho-spécifiques dilué dans le débit de lavage pour un volume final de 10 µL, marqueur de surface dilué dans le débit de lavage pour un volume final de 15 µL et 25 µL de suspension cellulaire.
   Remarque : Les dilutions anticorps devraient être réglées avant l’expérience. Inclure le contrôle de l’isotype.
6. Laissez les cellules pendant 30 min à température ambiante, dans l’obscurité.
7. Laver les cellules colorées 2 x avec lavage de flux (remplir les puits).
8. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant.
9. Remettre en suspension les cellules de 150 µL de lavage de flux.

8. préparation des commandes de Compensation

1. Préparer les contrôles de compensation pour les anticorps conjugués fluorochromes en parallèle avec la souillure d’anticorps. Utilisez des perles de compensation conformément aux instructions du fournisseur.

9. analyse en cytométrie en flux

Remarque : L’expérience peut être exécutée sur un cytomètre de flux avec un Sampler élevée de débit (HTS).

1. Optimiser la tension du tube (PMT) photomultiplicateur avec le contrôle sans coloration.
2. Exécuter les contrôles de compensation et de calculer la matrice de compensation.
3. Exécuter les exemples. Le taux d’événements devrait être selon les spécifications de l’appareil.

10. blocage stratégie et analyse des données

1. Importer les fichiers de FCS de l’expérience d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux comme FlowJo ou Cytobank (https://cellmass.cytobank.org).
2. Stratégie de blocage
   1. Sélectionnez des lymphocytes en traçant SSC-A contre FSC-a dans une parcelle de dot de densité.
   2. Affichez les lymphocytes et sélectionnez les maillots en traçant SSC-A contre FSC - W.
   3. Afficher les cellules individuelles et porte de la cellule type de traçage SSC-A contre le marqueur de surface.
   4. Afficher la population type de cellule dans un bleu Pacifique contre terrain de densité SSC-A, puis sélectionnez les différentes populations de FCB fondées sur leur intensité de coloration de Pacific Blue (voir la Figure 1 a).
   5. Tracer le canal d’anticorps phospho contre la chaîne FCB, ou comme un heatmap (voir Figure 1 a) pour afficher les événements de phosphorylation.
3. Calculer phospho-signaux à l’aide de l’arcsinus hyperbolique (arcsinh) de l’IFM (intensité de fluorescence médiane) de phospho-signal versus isotype contrôle (taux de phosphorylation basale, voir Figure 1), ou de stimulée par rapport populations de cellules non stimulées (voir Figure 1E).

Résultats

Les principales étapes du protocole phospho écoulement cytometry sont illustrées dans la Figure 1 a. Dans l’exemple présenté, cellules CLL ont été colorées avec le réactif de barcoding Pacific Blue à quatre dilutions. Code à barres en trois dimensions peut être effectuée en combinant trois colorants de codes à barres, comme illustré dans la Figure 1 b. Les échantillons individuels sont ensuite déconvolutés par blocage subséquent ...

Discussion

Phospho cytométrie en flux est une technique puissante pour mesurer le taux de phosphorylation de protéines dans des cellules individuelles. Étant donné que la méthode s’appuie sur la coloration avec des anticorps, phospho cytométrie en flux est limitée par la disponibilité des anticorps. En outre, afin d’obtenir des résultats fiables, les anticorps devraient être titrés et vérifiés avant toute utilisation. Un protocole détaillé pour le titrage d’anticorps phospho-spécifiques ont été décrits ailleurs^12<...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RPMI 1640 GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	61870-010	Milieu de culture cellulaire
Sérum de veau fœtal	ThermoFisher Scientific	10270169	Additif au milieu de culture cellulaire
Pyruvate de sodium	ThermoFisher Scientific	11360-039	Additif au milieu de culture cellulaire
MEM acides aminés non essentiels	ThermoFisher Scientific	11140-035	Additif au milieu de culture cellulaire
Lymphoprep	Alere Technologies AS	1114547	Milieu de gradient de densité
Anti-IgM	Southern Biotech	2022-01	Pour la stimulation du récepteur des cellules B
BD Phosflow Fix Buffer I	BD	557870	Tampon de fixation
BD Phosflow Perm Buffer III	BD	558050	Tampon de perméabilisation
Alexa Fluor 488 5-TFP	ThermoFisher Scientific	A30005	Réactif de codage
à barres Pacific Blue Succinimidyl Ester	ThermoFisher Scientific	P10163	Réactif de codage
à barres Pacific Orange Succinimidyl Ester, sel de triéthylammonium	ThermoFisher Scientific	P30253	Réactif de codage à barres
Perles de compensation	Defined by user		Correct species réactivité
Tubes Falcon	Défini par l’utilisateur
Tubes Eppendorf	Défini par l’utilisateur
Plaques à fond en V à 96 puits	Défini par l’utilisateur		Compatible avec le cytomètre
en flux Centrifugeuses	Défini par l’utilisateur		Pour les tubes Eppendorf, les tubes Falcon et les plaques
Bain-marie	Défini par l’utilisateur		Cytomètre en flux régulé
	en températureDéfini par l’utilisateur		Avec échantillonneur à haut débit (HTS)
Nom	Entreprise	>Numéro de catalogue	Comments
< strong>Antigen
AKT (pS473)	Cell Signaling Technologies	4075	Clone : D9E Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62 Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans les cellules normales et transformées&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9
ATF-2 (pT71)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8398	Clone : F-1 Référence : Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55
BLNK (pY84)	Beckton Dickinson Pharmingen	558443	Clone : J117-1278 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Les inhibiteurs de la tyrosine kinase de la rate réduisent&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale chez normal et transformé&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Myklebust et al., 2017, Modèles distincts de signalisation des récepteurs des cellules B&hellip ;, Blood, 129(6) : 759-770
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Btk (pY551)	Beckton Dickinson Pharmingen	558129	Clone : 24a/BTK (Y551)  ; Référence : Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale chez normal and transformed&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9
Btk (pY551)/Itk (pY511)	Beckton Dickinson Pharmingen	558134	Clone : 24a/BTK (Y551)  ; Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Parente-Ribes et al., 2016, Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce&hellip ;, Haematologica, 101(2) :e59-62
CD3&zeta ; (pY142)	Beckton Dickinson Pharmingen	558489	Clone : K25-407.69 Référence : Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410
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LAT (pY171)	Beckton Dickinson Pharmingen	558518	Clone : I58-1169 Référence : Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410
Lck (pY505)	Beckton Dickinson Pharmingen	558577	Clone : 4/LCK-Y505  ; Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284
MEK1 (pS298)	Beckton Dickinson Pharmingen	560043	Clone : J114-64 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410
NF-&kappa ; B p65 (pS529)	Beckton Dickinson Pharmingen	558422	Clone : K10-895.12.50 Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans le normal et transformé&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55
NF-&kappa ; B p65 (pS536)	Cell Signaling Technologies	4887	Clone : 93H1 Référence : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le CD2 et le CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Kalland et al., 2012, Modulation de la signalisation proximale dans les cellules normales et transformées&hellip ;, Exp Cell Res, 318(14) :1611-9
p38 MAPK (pT180/Y182)	Cell Signaling Technologies	4552	Clone : 28B10 Référence : Myhrvold et al., 2018, Profilage unicellulaire des niveaux de phospho-protéine dans.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284 Skå ; nland et al., 2014, Co-stimulation des lymphocytes T par le biais du CD2 et du CD28&hellip ;, Biochem J, 460(3) :399-410 Pollheimer et al., 2013, L’interleukine-33 entraîne un endothélial pro-inflammatoire&hellip ;, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33(2) :e47-55
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S6-Ribos. Prot. (pS235/236)	Cell Signaling Technologies	4851	Clone : D57.2.2E Reference : Myhrvold et al., 2018, Single cell profiling of phospho-protein levels in.., Oncotarget, 9(10) :9273-9284
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