Article de méthode

Hippo, activité de voie à l’aide d’un biocapteur de suppresseur (LATS) axée sur la luciférase grande tumeur de signalisation de surveillance

DOI :

10.3791/58416

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13 septembre 2018

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1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Nous présentons ici un biocapteur axée sur la luciférase afin de quantifier l’activité kinasique de suppresseur de tumeur grande (LAT)-une centrale kinase dans l’hippopotame voie de signalisation. Ce biocapteur a diverses applications en recherche fondamentale et translationnelle vise à déterminer l’Hippo voie régulateurs in vitro et in vivo.

Résumé

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L’hippopotame, voie de signalisation est un régulateur conservé de la taille de l’organe et a un rôle important dans la biologie du développement et cancer. En raison de difficultés techniques, il reste difficile d’évaluer l’activité de cette voie de signalisation et de l’interpréter dans un contexte biologique. La littérature existante sur le suppresseur de tumeur grande (LATS) repose sur des méthodes qualitatives et ne peuvent pas facilement être mise à l’échelle en place pour le dépistage. Récemment, nous avons développé un biocapteur axée sur la bioluminescence pour surveiller l’activité de la kinase de la composante de LATS-a base de la cascade de kinase de Hippo. Nous décrivons ici les procédures pour comment ce biocapteur LATS (LATS-BS) peut être utilisé pour caractériser les régulateurs voie Hippo. Tout d’abord, nous fournissons un protocole détaillé pour étudier l’effet d’une protéine surexprimée candidate (par exemple, VEGFR2) sur l’activité LATS utilisant le LATS-BS. Ensuite, nous montrons comment le LATS-BS peut être utilisé pour un écran d’inhibiteur de la kinase à petite échelle. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle en place pour effectuer des écrans plus grands, sans aucun doute déceler les nouveaux régulateurs de la voie de l’hippopotame.

Introduction

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L’hippopotame signalisation voie a été identifié chez la drosophile comme un nouveau régulateur de croissance cellulaire et animale taille1,2. Depuis sa découverte initiale, montage des éléments de preuve convaincante démontre que la voie Hippo joue un rôle crucial dans le développement (p. ex., développement embryonnaire précoce, contrôle orgue de la taille et la morphologie tridimensionnelle [3D]), () tumorigenèse par exemple, le développement de tumeurs, métastases, angiogenèse, évasion immunitaire, instabilité génomique, réponse au stress et la résistance aux médicaments) et l’ho....

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Protocole

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1. enquête d’un organisme de réglementation putatif de Hippo signalisation utilisant le LATS-BS

  1. Placage et transfection de cellules
    1. Préparation de culture cellulaire
      1. Chauffer 1 x PBS, DMEM contenant 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine et 0,25 % de trypsine-EDTA à 37 ° C au bain-marie pendant environ 30 min.
      2. Nettoyer à fond un meuble de biosécurité avec l’éthanol à 70 %.
      3. Placez les plats de culture tissulaire, pipettes Pasteur, pipettes sérologiques et pointes de pipette dans la hotte de culture de tissus selon les besoins.
      4. Retirez 1 x PBS, les médias et la trypsine-EDTA du ba....

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Résultats

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Le LATS-BS a été cotransfecté avec différents gènes afin d’évaluer leur effet sur l’activité de LATS (Figure 3). Dans cette expérience, Renilla a été utilisée comme témoin interne. L’expression transitoire de YAP-5SA, une forme constitutive active de YAP, causes d’augmentation des niveaux de YAP transcriptionnelles cibles et une augmentation activité kinase LATS par une rétroaction établies voie25. MST, l’activateur en amont d.......

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Discussion

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Alors que la voie Hippo joue un rôle important dans divers processus biologiques, et le dérèglement de la voie Hippo mène au cancer6, comment la voie Hippo est régulée en réponse à divers stimuli n’est pas complètement compris. En outre, il n’y a eu aucun système en temps réel et quantitative pour évaluer l’activité des éléments de base Hippo. Récemment, nous avons développé et validé un biocapteur roman pour mesurer l’activité kinase LATS dans la voie de Hippo24. Ce biocap.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC #119325, 148629) et la Fondation canadienne de Cancer du sein (FCCS) de XY. TA est pris en charge par la bourse d’études supérieures du Canada Vanier et les bourses d’études supérieures du International (Ontario). HJJVR est pris en charge par une reine Elizabeth II bourses d’études supérieures en sciences et en technologie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trypsine-EDTA  ; Life Technologies25200560,25 %
sérum de veau fœtal (FBS)SigmaF1051
DMEMSigmaD6429-500mlDMEM à haute teneur en glucose  ;
Penicillin StreptomycinLife Technologies15140122
PolyJet In Vitro Réactif de transfection d’ADN ; SignagenSL100688.5
5x Tampon de lyse passivePromegaE194A30 ml
Dual-Glo® ; Luciferase Assay SystemPromegaE2940Kit 100 ml
20/20 luminomètreTurner Biosystems998-2036Lecteur de tube unique
GloMax® ; Navigateur avec double injecteurPromegaGM2010Luminomètre à lecteur de plaques 96 puits

Références

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  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W.

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Mots-clés

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