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Article de méthode

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

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DOI :

10.3791/58441

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10 décembre 2018

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1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Résumé

Le chloroplaste est un organite indispensable qui est responsable de divers processus cellulaires chez les plantes, comme la photosynthèse et la production de nombreux métabolites secondaires et les lipides. Chloroplastes nécessitent un grand nombre de protéines pour ces différents processus physiologiques. Plus de 95 % de protéines de chloroplastes sont noyau codé et importés dans des chloroplastes du cytosol après traduction sur des ribosomes cytosoliques. Ainsi, l’importation appropriée ou le ciblage de ces protéines chloroplastiques noyau codé aux chloroplastes est essentiel au bon fonctionnement des chloroplastes ainsi que la cellule végétale. Chloroplaste noyau codé protéines contiennent des séquences signal pour un ciblage spécifique aux chloroplastes. Les machines moléculaires localisé dans les chloroplastes ou cytosol reconnaître ces signaux et mener le processus d’importation. Afin d’étudier les mécanismes d’importation de protéines ou de ciblage aux chloroplastes in vivo, nous avons développé une méthode rapide et efficace axée sur les protoplastes pour analyser l’import des protéines dans des chloroplastes d’Arabidopsis. Dans cette méthode, nous utilisons des protoplastes isolés de tissus foliaires d’Arabidopsis. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier le mécanisme par lequel les protéines sont importés dans des chloroplastes.

Introduction

Le chloroplaste est l’un des principaux organites chez les plantes. Une des fonctions principales des chloroplastes est de réaliser la photosynthèse1. Chloroplastes accomplissent également de nombreuses autres réactions biochimiques pour la production d’acides gras, acides aminés, nucléotides et de nombreux métabolites secondaires1,2. Pour toutes ces réactions, les chloroplastes nécessitent un grand nombre de différents types de protéines. Toutefois, le génome chloroplastique contient seulement environ 100 gènes3,4. Par conséquent, les chloroplastes doivent importer la majorité de leurs protéines du cytosol. En fait, la plupart des protéines de chloroplastes ont été montrés à être importé du cytosol après traduction4,5,6. Les cellules végétales nécessitent des mécanismes spécifiques pour importer les protéines du cytosol vers chloroplastes. Cependant, bien que ces mécanismes d’importation de protéines ont été étudiées pour les dernières décennies, nous ne comprends toujours pas pleinement leur au niveau moléculaire. Ici, nous fournissons une méthode détaillée pour la préparation des protoplastes et exogène exprimant des gènes dans des protoplastes. Cette méthode pourrait être utile pour élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents import des protéines dans des chloroplastes en détail.

Import des protéines peut être étudié à l’aide de différentes approches. Une de ces méthodes implique l’utilisation d’un in vitro protéine importation système7,8. En utilisant cette approche, en vitro-précurseurs de protéines traduites sont incubés avec chloroplastes purifiée in vitro, et import des protéines est analysée par SDS-PAGE, suivie par l’analyse par western blot. L’avantage de cette approche est que chaque étape de l’import des protéines dans des chloroplastes peut être étudié en détail. Ainsi, cette méthode a été largement utilisée pour définir les composants de la machinerie moléculaire de protéine importation et disséquer les informations de séquence pour les peptides de transit. Plus récemment, une autre approche impliquant l’utilisation de protoplastes de tissus foliaires a été développée et il a devenu employé couramment pour étudier l’importation de protéines dans les chloroplastes9,10. L’avantage de cette approche est que les protoplastes fournissent un environnement cellulaire qui est plus proche de celle des cellules intactes que le système in vitro . Ainsi, le système de protoplaste nous permet d’aborder de nombreux autres aspects de ce processus, tels que les événements cytosoliques associés et comment la spécificité du ciblage des signaux est déterminé. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier l’import des protéines dans des chloroplastes.

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Protocole

1. la croissance des plantes Arabidopsis

  1. Préparer 1 L Gamborg B5 (B5) moyen en ajoutant 3,2 g de milieu B5 y compris les vitamines, 20 g de saccharose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) éthane sulfonique (MES) à environ 800 mL d’eau désionisée et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter plus désionisée eau porter le volume total de 1 L. ajouter 8 g de phytoagar et stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C.
  2. Laisser le milieu à refroidir à 55 ° C et verser 20 à 25 mL de milieu B5 dans une boîte de pétri (9 cm de diamètre, 1,5 cm de hauteur) à un banc propre. Plaques sèches pour 2 – 3 jours, les emballer avec emballage propre et garder au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.
  3. Arabidopsis thaliana de stériliser les graines avec 1 mL d’éthanol à 70 % (v/v) dans un tube à centrifuger (e-tube) en agitant continuellement pendant 2 à 3 min. retirer le surnageant, ajouter 1 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 1 % (v/v) et agiter continuellement pendant 2 à 3 min. préparer 100 – 150 graines par boîte de pétri.
    1. Enlevez les surnageants et lavez les graines avec 1 mL d’eau distillée. Répétez cette étape 4 x. Placez les graines stérilisées à 4 ° C pendant 3 jours pour synchroniser la germination des graines.
  4. Semer les graines de 100 à 150 sur des plaques de B5 à l’aide d’une micropipette et sceller la plaque avec ruban chirurgical.
  5. Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance avec un cycle lumière/obscurité de 16 h/8 h à 100 µmol·m ·s-1 -2l’intensité lumineuse, de 70 % d’humidité relative et de température de 20 ° C pendant 2 semaines.

2. préparation du plasmide

Remarque : Les plasmides de haute pureté doivent être utilisés pour la transformation ; l’utilisation d’un kit de purification de plasmide commercial est recommandée.

  1. Purifier le plasmide (globules rouges-nt:GFP) à l’aide d’un kit d’isolation de l’ADN. Pour concentrer l’ADN, effectuer la précipitation d’éthanol dans un tube de 1,5 mL et dissoudre le culot d’ADN dans 100 µL d’eau distillée. Déterminer la concentration du plasmide à l’aide d’un spectrophotomètre à 260 nm. Diluer le plasmide à une concentration finale de ~ 2 µg / µL. conserver le plasmide à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. isolement de protoplastes

  1. Préparer les solutions suivantes.
    1. Préparer la solution d’enzyme pour contenir 0,25 % (p/v) macerozyme, cellulase de 1,0 % (p/v), 400 mM D-mannitol, chlorure de calcium 8 mM (CaCl2), 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) et MES de 5 mM. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH.
      1. Filtrer la solution enzymatique à l’aide d’une unité de filtration d’acétate de cellulose avec une taille de pores de 0,45 µm. Aliquote 25 mL de la solution d’enzyme dans les tubes coniques de 50 mL et conserver à-20 ° C. Décongeler la solution enzymatique à température ambiante (RT) et mélanger bien juste avant utilisation.
    2. Préparer une solution de saccharose de 21 % (p/v) en dissolvant 21 g de saccharose dans 100 mL d’eau désionisée et stériliser la solution.
    3. Préparer la solution W5 contiennent du chlorure de sodium (NaCl) 154 mM, 125 mM CaCl2, 5 mM chlorure de potassium (KCl), glucose 5 mM et 1,5 mM MES. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH et stériliser la solution.
    4. Préparer la solution de MaMg pour contenir 400 mM D-mannitol, le chlorure de magnésium (MgCl2), 15 mM et 5 mM MES. Ajuster le pH à 5,6 avec KOH et stériliser la solution.
    5. Préparer 1 M D-mannitol et 1 M de nitrate de calcium solutions pour rendre la solution de PEG. Autoclave ces solutions.
  2. Récolter des tissus foliaires intacts de 2 plantes semaines de ~ 1 à 2 plaques de B5 à l’aide d’un bistouri et place les feuilles récoltées dans une 50 mL conique tube contenant 25 mL de solution d’enzyme. Placer le tube conique contenant des tissus de solution et de feuilles d’enzyme horizontalement sur un agitateur rotatif avec agitation modérée dans l’obscurité. Il faut compter 8 à 12 h pour la digestion complète des tissus foliaires.
  3. 8 à 12 heures après l’incubation, verser la solution enzymatique (contenant des protoplastes libérés des tissus foliaires) frais pétri au travers d’une maille avec 140 µm de porosité. Soigneusement la solution enzymatique protoplaste contenant 15 mL de solution de saccharose de 21 % (p/v) sur le dessus de la couche et il centrifuger à 98 g pendant 10 min avec les plus petits paramètres d’accélération et de décélération dans un rotor oscillant-seau.
  4. À l’aide d’une pipette Pasteur, transvaser avec soin les protoplastes de la couche supérieure (solution enzymatique) et à l’interface entre la solution enzymatique et une solution de saccharose à un tube conique de 50 mL contenant 30 mL de solution de W5. Centrifuger à ce tube à 51 x g pendant 6 min. À ce stade, les protoplastes sera dans le culot en bas du tube conique.
  5. Jeter le surnageant soigneusement à l’aide d’une pipette sans déranger le culot de protoplastes. Ajouter 25 mL de solution de W5 et resuspendre doucement les protoplastes. Incuber la solution de protoplastes dans un réfrigérateur de 4 ° C pendant au moins 1 h pour la stabilisation.

4. protoplaste Transformation à l’aide de polyéthylène Glycol

  1. Préparer un 40 % PEG solution en ajoutant 4 g de PEG 8000, 4 mL de solution de mannitol de 1 M, 1 mL de 1 M Ca (NO3)2et 1,8 mL d’eau distillée dans un tube conique de 50 mL et bien mélanger. Dissoudre le PEG en chauffant dans un four à micro-ondes pendant 20 à 30 s. Place les 40 % solution PEG à RT pour refroidir.
    Remarque : Les 40 % PEG solution doit être fraîchement préparée chaque fois. Si les protoplastes sont granulées pas complètement pendant l’incubation de 4 ° C dans le réfrigérateur, centrifuger le matériau à 46 x g pendant 2 min.
  2. Retirez le surnageant délicatement mais complètement et ajoutez MaMg solution au culot protoplaste pour obtenir la concentration de 5 x 106/ml.
    Remarque : Le nombre de protoplaste peut être déterminé par un hémocytomètre examiné sous un microscope.
  3. Placer 10 µg de l’ADN de plasmide chaque vide 13 mL tube fond rond et ajouter 300 µL de solution de protoplaste à l’aide d’une pipette.
    Remarque : L’extrémité de l’embout de la pipette doit être coupée. Chaque fois que les protoplastes sont échantillonnés, la solution contenant du protoplaste devrait être remis en suspension juste avant le pipetage afin que le même nombre de protoplastes est ajouté dans chaque tube.
  4. Mélanger l’ADN de plasmide avec des protoplastes en tournant doucement les tubes et immédiatement ajouter 300 µL de 40 % PEG solution à l’aide d’une pipette. Mélanger doucement mais complètement en faisant tourner les tubes et les incuber 30 min à température ambiante ; incliner le tube presque horizontalement et tournez-le plusieurs fois.
  5. Ajouter 1 mL de solution de W5 et mélanger doucement mais complètement en tournant le tube à la main de manière similaire. Incuber l’échantillon pendant 10 min à température ambiante.
  6. Répétez cette étape deux fois plus à l’aide de 1,5 mL et 2 mL de solution de W5, respectivement. Incuber 30 min après l’addition finale de solution W5.
  7. Centrifuger à 46 x g pendant 4 min. jeter le surnageant et ajouter 2 mL de solution de W5. Mélanger doucement mais complètement. Incuber à 22 ° C dans une chambre noire.

5. analyse de l’importation de protéines dans les chloroplastes

Remarque : Après transformation PEG-négociée des protoplastes, temps d’incubation varie de 8 à 24 h.

  1. Microscopie en fluorescence
    1. Déposer 10 µL de la solution de protoplaste sur un verre de diapositive à l’aide d’une pipette avec une pointe taillée et soigneusement couvrir avec un lamelle couvre-objet pour éviter d’endommager les protoplastes.
    2. Place du chariot sur la scène d’un microscope à fluorescence équipé de filtre d’excitation/émission définit pour l’observation de la protéine fluorescente verte (GFP) et auto-fluorescence de la chlorophylle.
    3. Capturer des images avec un refroidi à dispositif à couplage de charge (CCD) caméra et processus images à l’aide d’un logiciel de retouche d’image pour produire des images de pseudo-couleur.
  2. Immunobuvardage et Extraction des protéines totales
    1. Préparer le tampon de dénaturation contenant 2,5 % (p/v) le dodécylsulfate de sodium (SDS) et 2 % (v/v) 2-mercaptoéthanol.
      NOTE : Import des protéines dans des chloroplastes peut être quantifié en mesurant le degré de peptide de traitement par immunoblot analyse à l’aide d’anticorps anti-GFP.
    2. Transférer les protoplastes dans un tube à centrifuger et centrifuger à 46 x g pendant 4 min.
    3. Retirez le surnageant et ajouter 80 µL de tampon de dénaturation. Vigoureusement vortexer pendant 5 s puis ajoutez 5 x tampon SDS (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, SDS de 10 % (p/v), bleu de bromophénol 0,05 % (p/v) et 50 % (v/v) de glycérol). Bien mélanger et faire bouillir pendant 10 min.
    4. Sous réserve cet échantillon de protéine standard SDS-PAGE et immunoblotting avec anticorps anti-GFP.

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Résultats

L’importation de protéines dans les chloroplastes peut être examinée à l’aide de deux approches : analyse de microscopie et immuno fluorescence après séparation véhiculée par SDS-PAGE. Ici, nous avons utilisé des globules rouges-nt:GFP, une fusion construire codant les 79 résidus d’acides aminés N-terminaux de globules rouges contenant le peptide de transit fusionné à la GFP. Lorsque les protéines sont importés dans des chloroplastes, fluorescence verte des signaux de la protéine cible Rb...

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Discussion

Nous avons fourni un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d' Arabidopsis pour étudier l’import des protéines dans des chloroplastes. Cette méthode est puissante pour étudier le processus d’importation de protéines. Cette technique simple et versatile est utile pour examiner le ciblage des protéines cargo destiné aux chloroplastes. En utilisant cette méthode, protoplastes sont préparés à partir des tissus foliaires de Arabidopsis11,12...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été réalisée avec le soutien du programme de recherche coopérative pour les sciences de l’Agriculture et le développement technologique (projet No PJ010953012018), Administration du développement Rural et la subvention de la National Research Foundation (Corée) financé par le ministère de la Science et de la TIC (no 2016R1E1A1A02922014), République de Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GAMBORG B5 MEDIUM AVEC VITAMINESDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, poudreJUNSEI24440S1201
Micropore Ruban chirurgical3M1530-0
Lame chirurgicale acier inoxydable No.10FEATHERIndisponible
Tube conique, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Indisponible
Cellulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Indisponible
ALBUMINE BOVINE (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CHLORURE DE CALCIUM, DIHYDRATÉMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Coupelle d’écran pour CD-1SIGMAS1145
Écrans pour CD-1SIGMAS3895
Boîte de PétriSPL LIFE SCIENCES10090
Pipette PasteurHILGENBERG3150102
CENTRIFUGEUSE DE LABORATOIRE / BENCH-TOPVISION SCIENTIFICVS-5500N
Chlorure de sodiumJUNSEI19015S0350
Chlorure de potassiumSIGMAP3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDRUSBIO BASICGB0219
Hydroxyde de potassiumDUKSAN40
Nitrate de calcium tétrahydratéSIGMAC2786-500G
Poly(éthylène glycol)SIGMAP2139-2KG
Chlorure de magnésium hexahydratéSIGMAM2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Lames de microscopeMARIENFELD1000412
Lunettes de protection de microscopeMARIENFELD101030
Chambre de comptageMARIENFELD650030
Axioplan 2 Microscope d’imagerieCarl ZeissIndisponible
Microtube 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2- MercaptoéthanolSIGMAM3148-250ML
Dodécylsulfate de sodium (SDS), qualité protéomiqueVWRM107-500G
TRIS, qualité ultra pureVWR0497-5KG
TNT (DL-Dithiothreitol), qualité biotechnologieVWR0281-25G
Sel de sodium bleu de bromophénol ACSVWR 0312-50G
GlycérolJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Anticorps monoclonal (JL-8)TAKARA632381

Références

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