Article de méthode

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

DOI :

10.3791/58441

⸱

10 décembre 2018

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1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons ici un protocole pour exprimer les protéines dans des protoplastes à l’aide de la méthode de transformation par PEG. La méthode fournit une expression simple de protéines d’intérêt et un examen efficace de la localisation de la protéine et le processus d’importation pour diverses conditions expérimentales in vivo.

Résumé

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Le chloroplaste est un organite indispensable qui est responsable de divers processus cellulaires chez les plantes, comme la photosynthèse et la production de nombreux métabolites secondaires et les lipides. Chloroplastes nécessitent un grand nombre de protéines pour ces différents processus physiologiques. Plus de 95 % de protéines de chloroplastes sont noyau codé et importés dans des chloroplastes du cytosol après traduction sur des ribosomes cytosoliques. Ainsi, l’importation appropriée ou le ciblage de ces protéines chloroplastiques noyau codé aux chloroplastes est essentiel au bon fonctionnement des chloroplastes ainsi que la cellule végétale. Chloroplaste noyau codé protéines contiennent des séquences signal pour un ciblage spécifique aux chloroplastes. Les machines moléculaires localisé dans les chloroplastes ou cytosol reconnaître ces signaux et mener le processus d’importation. Afin d’étudier les mécanismes d’importation de protéines ou de ciblage aux chloroplastes in vivo, nous avons développé une méthode rapide et efficace axée sur les protoplastes pour analyser l’import des protéines dans des chloroplastes d’Arabidopsis. Dans cette méthode, nous utilisons des protoplastes isolés de tissus foliaires d’Arabidopsis. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d’étudier le mécanisme par lequel les protéines sont importés dans des chloroplastes.

Introduction

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Le chloroplaste est l’un des principaux organites chez les plantes. Une des fonctions principales des chloroplastes est de réaliser la photosynthèse1. Chloroplastes accomplissent également de nombreuses autres réactions biochimiques pour la production d’acides gras, acides aminés, nucléotides et de nombreux métabolites secondaires1,2. Pour toutes ces réactions, les chloroplastes nécessitent un grand nombre de différents types de protéines. Toutefois, le génome chloroplastique contient seulement environ 100 gènes3,4. Par conséque....

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Protocole

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1. la croissance des plantes Arabidopsis

  1. Préparer 1 L Gamborg B5 (B5) moyen en ajoutant 3,2 g de milieu B5 y compris les vitamines, 20 g de saccharose, 0,5 g de 2-(N-morpholino) éthane sulfonique (MES) à environ 800 mL d’eau désionisée et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter plus désionisée eau porter le volume total de 1 L. ajouter 8 g de phytoagar et stériliser pendant 15 minutes à 121 ° C.
  2. Laisser le milieu à refroidir à 55 ° C et verser 20 à 25 mL de milieu B5 dans une boîte de pétri (9 cm de diamètre, 1,5 cm de hauteur) à un banc propre. Plaques sèches pour 2 – 3 jours, les emballer avec emballage propre et garder a....

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Résultats

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L’importation de protéines dans les chloroplastes peut être examinée à l’aide de deux approches : analyse de microscopie et immuno fluorescence après séparation véhiculée par SDS-PAGE. Ici, nous avons utilisé des globules rouges-nt:GFP, une fusion construire codant les 79 résidus d’acides aminés N-terminaux de globules rouges contenant le peptide de transit fusionné à la GFP. Lorsque les protéines sont importés dans des chloroplastes, fluorescence verte des signaux de la protéine cible Rb.......

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Discussion

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Nous avons fourni un protocole détaillé pour l’utilisation des protoplastes d' Arabidopsis pour étudier l’import des protéines dans des chloroplastes. Cette méthode est puissante pour étudier le processus d’importation de protéines. Cette technique simple et versatile est utile pour examiner le ciblage des protéines cargo destiné aux chloroplastes. En utilisant cette méthode, protoplastes sont préparés à partir des tissus foliaires de Arabidopsis11,12.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été réalisée avec le soutien du programme de recherche coopérative pour les sciences de l’Agriculture et le développement technologique (projet No PJ010953012018), Administration du développement Rural et la subvention de la National Research Foundation (Corée) financé par le ministère de la Science et de la TIC (no 2016R1E1A1A02922014), République de Corée.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
GAMBORG B5 MEDIUM AVEC VITAMINESDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, poudreJUNSEI24440S1201
Micropore Ruban chirurgical3M1530-0
Lame chirurgicale acier inoxydable No.10FEATHERIndisponible
Tube conique, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Indisponible
Cellulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Indisponible
ALBUMINE BOVINE (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CHLORURE DE CALCIUM, DIHYDRATÉMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Coupelle d’écran pour CD-1SIGMAS1145
Écrans pour CD-1SIGMAS3895
Boîte de PétriSPL LIFE SCIENCES10090
Pipette PasteurHILGENBERG3150102
CENTRIFUGEUSE DE LABORATOIRE / BENCH-TOPVISION SCIENTIFICVS-5500N
Chlorure de sodiumJUNSEI19015S0350
Chlorure de potassiumSIGMAP3911-1KG
D-GLUCOSE, ANHYDRUSBIO BASICGB0219
Hydroxyde de potassiumDUKSAN40
Nitrate de calcium tétrahydratéSIGMAC2786-500G
Poly(éthylène glycol)SIGMAP2139-2KG
Chlorure de magnésium hexahydratéSIGMAM2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
Lames de microscopeMARIENFELD1000412
Lunettes de protection de microscopeMARIENFELD101030
Chambre de comptageMARIENFELD650030
Axioplan 2 Microscope d’imagerieCarl ZeissIndisponible
Microtube 1.5mlSARSTEDT72.690.001
2- MercaptoéthanolSIGMAM3148-250ML
Dodécylsulfate de sodium (SDS), qualité protéomiqueVWRM107-500G
TRIS, qualité ultra pureVWR0497-5KG
TNT (DL-Dithiothreitol), qualité biotechnologieVWR0281-25G
Sel de sodium bleu de bromophénol ACSVWR 0312-50G
GlycérolJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Anticorps monoclonal (JL-8)TAKARA632381

Références

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  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

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Mots-clés

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

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