In Vivo Imagerie des espèces réactives de l’oxygène dans un murin plaie modèle

Résumé

Nous décrivons une non invasif en vivo imagerie protocole c’est facile et économique, utilisant L-012, un analogue de luminol chimiluminescence, de visualiser et de quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générés dans un modèle murin excisionnelle enroulé.

Résumé

La génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) est une caractéristique des processus inflammatoires, mais en excès, stress oxydatif est largement impliqué dans diverses pathologies comme le cancer, l’athérosclérose et le diabète. Nous avons déjà montré que la dysfonction du facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes)-comme 2 (Nrf2) / érythroïdes Kelch-comme culture cellulaire protéines 1 (Keap1) signalisation voie conduit à extrême déséquilibre ROS lors cutanée la cicatrisation chez les diabétiques. Étant donné que les niveaux ROS sont un indicateur important de la progression de la cicatrisation des plaies, des techniques de quantification précises et exactes sont précieux. Plusieurs essais in vitro pour mesurer des ROS dans les cellules et les tissus ont été décrites ; Toutefois, ils fournissent uniquement une seule mesure cumulative par échantillon. Plus récemment, ont permis le développement d’indicateurs de base de protéines et de modalités d’imagerie unique analyse spatio-temporelle. L-012 (C₁₃H₈ClN₄NaO₂) est un dérivé de luminol qui peut servir à la fois in vivo et in vitro par chimiluminescence détection de ROS générées par l’oxydase de NADPH. L-012 émet un signal plus fort que les autres sondes fluorescentes et s’est avéré être sensible et fiable pour la détection de ROS. L’applicabilité de laps de temps de L-012-facilité d’imagerie fournit des renseignements précieux sur les processus inflammatoires tout en réduisant la nécessité pour le sacrifice et dans l’ensemble le nombre d’animaux de l’étude. Nous décrivons ici un protocole utilisant L-012-facilité in vivo d’imagerie afin de quantifier le stress oxydatif dans un modèle de cicatrisation excisionnelle utilisant des souris diabétiques avec localement dysfonctionnel Nrf2/Keap1.

Introduction

Métabolites d’oxygène générés par le biais de processus inflammatoires contribuent à différentes cascades de signalisation ainsi qu’altération destructive des composants cellulaires¹. Utilisant des techniques sensibles et spécifiques pour mesurer le ROS est essentiel pour l’étude des processus inflammatoires et de caractériser les effets du stress oxydatif. L’imagerie in vivo est précieux en raison de sa capacité à fournir des données dynamiques spatiales et temporelles dans les tissus vivants. L-012 est une sonde chimioluminescente synthétique qui est hautement sensible pour les anions superoxydes et produit une intensité lumineuse pl....

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de New York University School of Medicine. Toutes les souris sont logés derrière une barrière et tout le personnel de porte un équipement de protection individuelle approprié.

1. jour 0 : La préparation d’un modèle murin de cicatrisation excisionnelle

1. Anesthésier les souris diabétiques de (Lepr^db/db), âgés de 8 à 12 semaines, à l’inhalation isoflurane de 2 %. Confirmer que chaque souris a été correctement anesthésiés en utilisant le test du pincement pad pied. Appliquer un lubrifiant oculaire stérile à chaque œil pour....

Résultats

Trois jours après la création des plaies bilatéraux selon un modèle établi plaie excisionnelle (Figure 1 a), les souris diabétiques sont placés dans la salle d’imagerie. Une photographie initiale et une mesure de bioluminescence sont prises avant l’injection de L-012 pour tenir compte des signaux de fond (Figure 1 b). Suite à une injection intrapéritonéale avec la solution de L-012, les souris sont repositionnés dans la chambre e.......

Discussion

Les techniques courantes de mesure de ROS ont été limités par des protocoles complexes nécessitant une extraction de tissu ou de la même façon des techniques invasives. Ces dernières années, les mesures du stress oxydatif ont été signalés sur la base de modalités d’imagerie innovantes, permettant ainsi à des évaluations spatio-temporelles^9,10,11. L-012 présente plusieurs avantages comme une sonde chimioluminescente par rapport a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bks. Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J souris	Jackson Laboratories	000642
13 cm x 18 cm Feuille de silicone (0,6 mm)	Sigma Aldrich  ;
3M Tegaderm Pansements en film transparent	3M	88-1626W
Lipofectamine 2000 Transfection	Reagent Life Technologies  ;
Keap1 Stealth siRNA	Thermofisher Scientific	1299001
Silencieux à contrôle négatif  ;	Thermofisher Scientific  ;	AM4635
Opti-MEM Sérum réduit	ThermoFisher Scientific	11058021
DPBS	ThermoFisher Scientific	14040133
Méthylcellulose  ;	Sigma Aldrich	9004-67-5
L-012	Wako Chemicals	120-04891
IVIS Lumina III XR Système d’imagerie in vivo  ;	PerkinElmer

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