Nous présentons notre protocole pour produire induit progéniteurs érythroïdes (PFE) de fibroblastes adultes de souris à l’aide axée sur le facteur de transcription directement lignée reprogrammation (DLR).
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Article de méthode
Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Différenciation et l’engagement de cellules érythroïdes procèdent grâce à l’activation d’un réseau transcriptionnel restreints lignée orchestrée par un groupe du sort de la cellule déterminant et facteurs de maturation. Nous avons précédemment énoncés pour définir l’ensemble minimal des facteurs nécessaires pour instruire les globules rouges de développement à l’aide de lignée directe reprogrammation des fibroblastes en progéniteurs/précurseurs érythroïdes induite (PFE). Nous avons montré que la surexpression de Gata1, Tal1 Lmo2et c-Myc (GTLM) peuvent rapidement convertir murins et humains fibroblastes directement aux PFE qui ressemblent à des cellules érythroïdes bona fide en termes de morphologie, phénotype, et l’expression des gènes. Nous avons l’intention que les PEI fournira un outil précieux pour étudier l’érythropoïèse et cellule de régulation sort. Nous décrivons ici le processus progressif de transformer les fibroblastes pointe queue murine PEI via transcription axés sur le facteur lignée directe reprogrammation (DLR). Dans cet exemple, nous effectuons la reprogrammation dans les fibroblastes de souris de traçage lignée érythroïde qui expriment la protéine fluorescente jaune (YFP) sous le contrôle du promoteur du gène (EpoR) érythropoïétine récepteur, permettant la visualisation des cellules érythroïdes induction de sort à la reprogrammation. Suite à ce protocole, les fibroblastes peuvent être reprogrammées en PEI dans les cinq à huit jours.
Tandis que les améliorations peuvent encore être apportées au processus, nous montrons qu’induite par le GTLM reprogrammation est un processus rapid et direct, ce qui donne des cellules avec des propriétés de bona fide cellules progénitrices et précurseurs érythroïdes.
Introduction
Globules rouges (hématies) sont essentiels chez tous les vertébrés et représentent 84 % de toutes les cellules du corps humain1. D’embryonnaire à l’âge adulte, notre santé est fortement tributaire de réglage exact de l’homéostasie de la RBC. La production continue des hématies matures au cours du développement à l’âge adulte est connue comme l’érythropoïèse. Un défi majeur dans la recherche de l’érythropoïèse est de définir les régulateurs maîtres qu’orchestrent le développement de RBC et le commutateur entre érythropoïèse primitive et définitive. Reprogrammation de la lignée directe des progéniteurs érythroïdes présente une opportunité de mieux comprendre érythroïdes développement in vivo.
Lignée directe reprogrammation (DLR), aussi appelé transdifférenciation, est le processus de reprogrammation d’un type de cellule directement dans une autre, contournant pluripotentes et stades de souches multipotentes. DLR a jusqu'à présent été utilisé pour produire de nombreux types de cellules, y compris les neurones2, hématopoïétiques3,4,5, hépatique6 et néphrotique7, cellules progénitrices. Pour les biologistes du développement, DLR est devenu un outil important pour les aspects interrogation d’engagement de la lignée et les processus de différenciation terminale8,9. DLR peut compléter et remplacer partiellement les études in vivo pour la compréhension des mécanismes du destin cellulaire durant le développement des facteurs déterminants. Le protocole DLR de reprogrammation de progéniteurs érythroïdes décrites dans le présent document fournit le champ une méthode gratuite pour les études sur le développement de l’érythropoïèse.
Nous avons démontré précédemment que la surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux progéniteurs érythroïdes induite (PFE) 10. les cellules érythroïdes le GTLM-reprogrammé grandement ressemblent à des progéniteurs érythroïdes primitives bona fide en termes de morphologie, phénotype et gene expression10. Ainsi les PEI ont limité la capacité de prolifération et mature aux érythrocytes nucléés semblables à ceux produits transitoirement dans l’embryon précoce avant l’apparition de l’érythropoïèse définitif. Par des changements dans les conditions de reprogrammation (p. ex., les mutations ponctuelles dans la reprogrammation des facteurs ou l’ajout d’autres facteurs), on peut comprendre comment ceci mène aux changements érythroïdes développement et différenciation. Nous avons montré par exemple qu’Ajout de Klf1 ou Myb au cocktail GTLM passe au modèle d’expression globine de principalement embryonnaire (primitive) à principalement adulte (définitif). Cette constatation confirme la validité de l’utilisation de DLR comme un outil pour définir les facteurs du développement de l’érythropoïèse.
Ici, nous décrivons le processus de génération de PFE de fibroblastes de souris queue astuce (TTF). Dans nos résultats représentatifs, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor- Cre R26- eYFP) qui expriment la protéine fluorescente jaune (eYFP) du locus Rosa26 dans toutes les cellules qui ont exprimé le récepteur de l’érythropoïétine, ce qui permet de faciliter la visualisation de l’engagement à la lignée érythroïde. En utilisant cette méthode, les cellules positives (EpoR +) YFP sont présents dès que cinq jours après la transduction. Ce protocole, par conséquent, propose une technique rapide et robuste pour la génération de progéniteurs érythroïdes in vitro.
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Protocole
1. la création et l’entretien de queue de souris primaire astuce Cultures de fibroblastes
- Préparer des plats enduit de gélatine (recommande un plat de 10 cm pour une queue) en recouvrant la surface avec de la gélatine de 0,1 % et en incubant les plats pendant environ 20 min à 37 ° C. Aspirer la solution de gélatine du plat et laisser sécher pendant au moins 2 h.
- Euthanasier les souris par dislocation cervicale. Enlever la queue avec des ciseaux, coupant à la base de la queue. Mettre la queue dans une solution saline de Dulbecco tamponnée au phosphate (SPD) avec 2 % sérum fœtal (SVF) jusqu'à utilisation.
Remarque : Pour des résultats optimaux, queues doit être prélevé souris environ 6 à 8 semaines d’âge. Queue peut être pris des souris âgées de 8 semaines d’âge, cependant, comme l’âge de la souris, la capacité de prolifération des fibroblastes et l’efficacité de la reprogrammation diminution11. - Effectuez toutes les étapes subséquentes du présent protocole dans une hotte de culture de tissus dans des conditions stériles. Préparer une solution de trypsine dilué de 0,02 % trypsine-EDTA au SPD et ajouter 5 mL dans un plat non revêtus de 10 cm.
- Laver la queue, tout d’abord dans l’éthanol à 70 %, puis au SPD. Dans un plat, placer la queue plate et utiliser des pinces pour maintenir en place. Faites une incision sur la queue le long de son axe longitudinal de la base jusqu'à la pointe.
- Saisir la queue avec une paire de pinces et maintenez-le verticalement. En utilisant une deuxième paire de pinces, saisissez la peau à côté de l’incision à la base de la queue et il peler. Pour ce faire sur les deux côtés de l’incision jusqu'à ce que la peau peut être décollée en tirant vers le bas vers l’extrémité de la queue.
- Maintenez la queue Pelée avec une pince sur le plat contenant la solution de trypsine et couper la queue en morceaux d’environ 1 cm de long. Avec les morceaux de queue dans la solution de trypsine, utiliser des ciseaux à fragmenter les morceaux en petits morceaux. Incuber les morceaux de queue dans la solution de trypsine à 37 ° C pendant 10 min.
NOTE : Plus les morceaux sont préférables afin de fournir à chaque pièce une surface importante au rapport de volume. - Étancher la trypsine à l’aide de 2 volumes de fibroblastes expansion (FEX) milieu (milieu de la Eagle modifié d’haute-glucose Dulbecco (DMEM) avec 15 % FBS, 2 mM de L-glutamine, des acides aminés Non essentiels (NEAA) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine).
- Recueillir l’intégralité du contenu de la capsule dans un tube de 50 mL et centrifuger à 350 × g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les fragments de queue dans 10 mL de milieu frais de FEX.
- Transférer des fragments de queue en moyenne dans un plat enduit de gélatine et laisser incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 et 4 % O2, ajout d’un milieu FEX frais tous les 2 jours.
Remarque : Après cinq à sept jours, des fragments de queue ont attaché au fond du plat et fibroblastes peuvent être vus à l’éloigne d’eux. - Une fois que les grappes de fibroblastes sont repérés, agiter doucement le plat pour déloger les morceaux de queue et aspirer le milieu et tous les fragments d’OS laissant les fibroblastes fixés à la plaque. Ajouter nouveau média FEX et culture de fibroblastes jusqu’au confluent.
- Pour ne garantir aucune contamination des fibroblastes de progéniteurs hématopoïétiques, dissocier les cellules de la plaque à l’aide de 1 x trypsine-EDTA pendant 5 minutes et prélever des cellules. Appauvrissent pour les cellules expriment des marqueurs hématopoïétiques (CD117, CD5, CD45R (B220), CD11b, Anti-Gr-1 (Ly-6G/C), 7-4 et Ter-119) à l’aide d’un système de séparation magnétique10.
2. rétrovirus Production
- Cellules d’emballage retroviral à environ 2,5 × 104 cellules/cm2 (2,0 × 106 cellules pour un plat de 10 cm) sur un plat de culture de tissus traités (par vide-gaz plasma) et de la culture pendant la nuit en haute-glucose DMEM avec 10 % de graines FBS, 10 mM de Sodium Le pyruvate et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Le lendemain matin, remplacez le milieu DMEM sans additif à l’aide de la moitié du volume utilisé pour la culture du jour au lendemain (5 mL pour un plat de 10 cm). Dans l’après-midi, vérifiez que les cellules sont de 70 à 80 % anastomosé et commencent la transfection.
- Pour chaque facteur de reprogrammation, Gata1, Tal1, Lmo2et c-Myc, préparer un mélange de 2:1 du vecteur d’expression (pMX) et vecteur d’assistance (contenant des gènes gag et pol). Pour un plat de 10 cm des fibroblastes, utilisez 6 µg de vecteur d’expression et 3 µg de vecteur d’assistance dans un volume final de 100 µL de milieu DMEM.
- Pour chaque facteur de reprogrammation, préparer 300 µL de la température ambiante (RT) DMEM dans un tube stérile de polystyrène et ajouter avec précaution 27 µL de réactif de transfection commerciale.
Remarque : Le réactif de transfection devrait être ramené à RT avant utilisation et doit être ajouté directement dans le milieu, comme les propriétés électrostatiques du composé peuvent faire collent à la paroi en plastique du tube. - Ajouter le mélange de plasmide dans le tube contenant du réactif de transfection, vortex brièvement et incuber le mélange réactif-ADN de transfection à RT. brièvement vortex le mélange pendant 15 minutes et ajouter goutte à goutte aux cellules emballage retroviral afin que la transfection mélange réactif-ADN est uniformément répartie sur la culture et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- 24h après la transfection, modifier le milieu DMEM avec 20 % FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine. 48 h après la transfection, recueillir le surnageant et filtrer à travers un filtre de seringue de pores de 0,22 µm.
Remarque : Les surnageants virales peuvent être congelés à-80 ° C et gardés jusqu'à leur utilisation, bien que la transduction est plus efficace si frais surnageant viral est utilisé.
3. GTLM transduction et récolte de l’iEP
- Graine de la queue astuce fibroblastes à 1 × 104 cellules/cm2 sur 0,1 % de gélatine préalablement enduit la vaisselle dans un milieu FEX et incuber à 37 ° C pendant 24 h.
- Le lendemain, préparer un mélange de transduction comme suit.
- Ajouter 1 volume de surnageant viral pour chaque facteur reprogrammation additionné de 4 µg/mL de réactif de l’infection rétrovirale (40 %) à 6 volumes de FEX milieu (60 %).
- Pour un plat de 10 cm des fibroblastes, ajouter 1 mL de chaque surnageant viral (4 × virus = 4 mL) additionné de 4 µg/mL de réactif de l’infection rétrovirale à 6 mL de milieu FEX, donnant un total de 10 mL d’un mélange transduction.
- Aspirer le milieu FEX de la culture de fibroblastes et remplacez-le par le mélange de transduction. Incuber la transduction de 4 h à 37 ° C dans des conditions d’hypoxie (5 % de CO2 et 4 % O2).
- Aspirer le mélange de transduction et remplacez-le par un milieu frais reprogrammation (milieu sans sérum Expansion (SFEM), 100 U/Mldepénicilline/streptomycine, 100 ng/mL murine Stem Cell Factor (mSCF), 10 ng/mL murine interleukine-3 (IL3), recombinant humain de 2 U/mL Érythropoïétine (hrEPO) et 100 nM dexaméthasone).
- Incuber pendant 8 daysat 37 ° C dans des conditions d’hypoxie, ajoutant un milieu reprogrammation frais tous les 2 jours. Après cinq à huit jours, reprogrammation réussie donnera l’amas de cellules qui ont détaché de la plaque.
- Pour prélever des cellules reprogrammés pour analyse, pipetez doucement monter et descendre pour leur récolte directement à partir de la capsule. Pour récolter des fibroblastes untransduced à titre de comparaison, dissocier les cellules de la plaque à l’aide de 1 x trypsine-EDTA et de percevoir.
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Résultats
Nous présentons ici un protocole reproductible pour la production de PFE de fibroblastes adultes à l’aide de DLR pilotée par facteur de transcription. Nous évaluons la reprogrammation de cellules à l’aide de la cytométrie en flux, formatrices dosages et gène analyse de l’expression. Afin d’aider à la visualisation de la conversion au destin des cellules érythroïdes, nous avons effectué la reprogrammation sur les fibroblastes des souris de lignée-traçage érythroïdes (Epor- Cre
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Discussion
La surexpression d’un cocktail de quatre facteurs, GATA1, TAL1, LMO2 et c-MYC (GTLM), est suffisante pour reprogrammer les fibroblastes murins et humains directement aux PFÉ10. Les cellules érythroïdes reprogrammé ressemblait beaucoup aux progéniteurs érythroïdes bona fide en ce qui concerne la morphologie, phénotype, expression génique et capacité de formatrices. Cette constatation co...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts au rapport.
Remerciements
Nous remercions Evelyn Wang et Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge (Massachusetts) pour le clonage et Harvey Lodish (Whitehead Institute) fournissant plusieurs des plasmides utilisés pour générer la bibliothèque rétrovirale. Nous remercions Kavitha Siva et Sofie Singbrant (département de médecine moléculaire et Gene Therapy, Université de Lund), Göran Karlsson et Shamit Soneji (département d’hématologie moléculaire, Université de Lund) pour leur rôle dans la description de la production de l’iEP. Nous tenons également à remercier Julian Pulecio (Centre de la médecine régénératrice, Barcelone Biomedical Research Park), Violeta rayonne-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (Institut de recherche médicale de St. Vincent et Département de médecine, hôpital St Vincent, Université de Melbourne), Ángel Raya (Institution catalane pour la recherche et des études supérieures, Barcelone) et Vijay G. Sankaran (Broad Institute de la Massachusetts Institute of Technology et Harvard, Cambridge ) pour leurs contributions antérieures à ce travail. Ce travail a été soutenu par la fondation de Söderberg de Ragnar (à J.F.) ; les Suédois Research Council (à J.F.) ; Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (à J.F.) ; la fondation suédoise pour la recherche stratégique (à J.F.) ; Fondation de Åke Wiberg (à J.F.) ; une subvention de l’intégration de Marie Curie (à J.F.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM sans pyruvate de sodium | GE Life Sciences | SH30022.01 | Milieux de culture pour cellules PhGP |
| DMEM avec pyruvate de sodium | GE Life Sciences | SH30243.01 | Milieux de culture pour fibroblastes de l’extrémité de la queue |
| StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM) | Stem Cell Technologies | 9650 | Milieux de reprogrammation ; |
| Sérum fœtal bovin HyClone | GE Life Sciences | SH30071.03HI | Facteur de croissance |
| Pénicilline/Streptomycine HyClone (100x) | Ge Life Sciences | SV30010 | Acides aminés non essentiels antiboiotiques |
| (100x) | Le milieu Thermo Fisher | 11140050 | SNL est complété par ce |
| Trypsin HyClone (1x) | GE Life Sciences | SH30042.01 | Agent de dissociation cellulaire |
| Facteur de cellules souches murines (mSCF) | Peprotech | 250-03 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| Souris recombinante Il-3 | Peprotech | 213-13 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| érythropoïétine recombinante humaine (hrEPO) | Peprotech | 100-64 | Ajouté au milieu de reprogrammation |
| Dexaméthasone | Sigma | 50-02-2 ; ; | Ajouté aux supports de reprogrammation |
| Gélatine de peau de porc | Sigma | 9000-70-8 | Dissovaqué en dH2O et utilisé pour le revêtement des plaques. Assurez-vous de la stérilité avant utilisation. |
| Chlorhydrate de blasticidine S | Sigma 3 | /9/3513 | Antibiotique de sélection. Affecte à la fois les cellules pro- et eucaryotes |
| Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) | Ge Life Sciences | SH30850.03 | Utilisé pour les étapes de lavage |
| Polybrène | Merck | TR-1003-G | Infection / Transfection ; Réactif |
| FuGENE HD Réactif de transfection | Promega | E2311 | Réactif de transfection pour lignée cellulaire PhGP |
| Millex-GP Unité de filtre à seringue 0,22 & micro ; m | Merck | SLGP033RS | Utilisé pour filtrer le surnageant de virus |
| BD Seringue hypodermique émeraude Becton | Dickinson | SKU : 307736 | Utilisé pour filtrer le surnageant de virus |
| 100 mm Plat de culture | Corning | 430167 | Culture cellulaire |
| Plaque à 6 puits | Falcon | 10799541 | Culture cellulaire |
| Pince de bijoutier #5 | Sklar | 66-7642 | Utilisé pour manipulation de petits fragments de queue |
| Sklarlite Iris Ciseaux | Sklar | 23-1149 | Utilisé pour couper la queue en petits morceaux |
| Kit de déplétion cellulaire de lignée, souris | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | Pour l’appauvrissement des cellules hématopoïétiques dans les cultures de fibroblastes |
| CD117 Microbilles, souris | Miltenyi Biotec | 130-091-224 | Pour l’appauvrissement des cellules hématopoïétiques dans les cultures de fibroblastes |
| Cellules PheonixGP | ATCC | CRL-3215 | Lignée cellulaire d’emballage rétroviral |
| Vecteur EcoPAC (pCL-Eco) ; | Novus Biologicals | NBP2-29540 | Vecteur auxiliaire rétroviral contenant les gènes gag et pol |
| pMX-Gata1 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-Tal1 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-Lmo2 | Cloné en laboratoire | ||
| pMX-cMyc | Cloné en laboratoire | ||
| Logiciel CellSens Standard 1.6 ; | Logiciel d’analyse Cytospin |
Références
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Réimpressions et autorisations
