Nous décrivons ici les étapes essentielles pour des enregistrements de patch-clamp de la cellule entière faites de neurones substantia gelatinosa (SG) dans la tranche de la moelle épinière en vitro . Cette méthode permet les propriétés membranaires intrinsèques, la transmission synaptique et la caractérisation morphologique des neurones de la SG à étudier.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Préparation de tranches médullaires aiguës pour l’enregistrement de Patch-clamp de la cellule entière dans les neurones de Substantia Gelatinosa
Dans cet article
Résumé
Résumé
Des études récentes de patch-clamp de la cellule entière de neurones substantia gelatinosa (SG) ont fourni un grand nombre d’informations sur les mécanismes de la colonne vertébrale qui sous-tendent la transmission sensorielle nociceptive règlement et développement de douleur ou de démangeaisons chronique. Implémentations des enregistrements électrophysiologiques ainsi que des études morphologiques basées sur l’utilité des tranches médullaires aiguës ont encore amélioré notre compréhension des propriétés neuronales et la composition des circuits locaux au journal officiel. Nous présentons ici un guide détaillé et pratique pour la préparation de tranches de moelle épinière et d’enregistrement de germes entiers représentant spectacle et résultats morphologiques. Ce protocole permet la préservation neuronale idéale et peut imiter des conditions in vivo dans une certaine mesure. En résumé, la possibilité d’obtenir une préparation in vitro de tranches de moelle épinière permet aux enregistrements de courant et tension-bride stable et pourrait donc faciliter des enquêtes détaillées sur les propriétés membranaires intrinsèques, des circuits locaux et structure neuronale à l’aide de diverses approches expérimentales.
Introduction
La substantia gelatinosa (SG, limbe II de la corne dorsale de la colonne vertébrale) est un centre d’indiscutablement important relais de transmission et de régulation de l’information sensorielle. Il est composé des interneurones excitateurs et inhibiteurs, qui reçoivent des entrées des fibres afférentes primaires et le système inhibiteur descendant endogène1interneurones les. Ces dernières décennies, le développement de la préparation de tranches médullaires aiguës et l’avènement de l’enregistrement de patch-clamp de la cellule entière ont permis à diverses études sur les propriétés intrinsèques d’électrophysiologiques et morphologiques des S....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Tous les protocoles expérimentaux décrits ont été approuvées par l’Animal Ethics Committee de Nanchang University (Nanchang, Chine, éthiques No.2017-010). Tous les efforts ont été faits pour minimiser le stress et la douleur des animaux expérimentaux. Les enregistrements électrophysiologiques interprétés ici ont été réalisées à température ambiante (RT, 22 – 25 ° C).
1. les animaux
- Utiliser des rats Sprague-Dawley (âgés de 3 à 5 semaines) des deux sexes. Loger les animaux sous un cycle lumière-obscurité de 12 h et de leur donner accès ad libitum à l’eau et de nourriture suffisante.
2. prépa....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Tranches de médullaires aiguës ont été préparés selon le schéma indiqué à la Figure 1. Après le tranchage et la récupération, une tranche de la moelle épinière a été transférée à la chambre d’enregistrement. Les neurones en bonne santé ont été identifiés basé sur l’apparence de soma à l’aide de la microscopie IR-DIC. Ensuite, les potentiels d’action des neurones SG ont été provoquées par une série de dépolarisation des impulsions de courant (durée de 1 s) qua.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Ce protocole détaille les étapes pour la préparation de tranches de moelle épinière, que nous avons utilisée avec succès lors d’expériences de patch-clamp de la cellule entière sur SG neurones18,19,20,21. En appliquant cette méthode, nous avons récemment rapporté que la minocycline, une deuxième génération de tétracycline, pourraient améliorer sensiblement la transmission synaptique inhibitrice.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 81560198, 31660289).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S7653 | Utilisé pour la préparation d’ACSF et de PBS |
| KCl | Sigma | 60130 | Utilisé pour la préparation d’ACSF, de saccharose-ACSF et de K+ solution intracellulaire à base de |
| NaH2PO4· ; 2H2O | Sigma | 71500 | Utilisé pour la préparation d’ACSF, de saccharose-ACSF et de PBS |
| CaCl2· ; 2H2O | Sigma | C5080 | Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF |
| MgCl2· ; 6H2O | Sigma | M2670 | Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Utilisé pour la préparation de l’ACSF |
| Acide ascorbique | Sigma | P5280 | Utilisé pour la préparation de l’ACSF et du saccharose-ACSF |
| Pyruvate de sodium | Sigma | A7631 | Utilisé pour la préparation d’ACSF et de saccharose-ACSF |
| Saccharose | Sigma | S7903 | Utilisé pour la préparation de saccharose-ACSF |
| K-gluconate | Wako | 169-11835 | Utilisé pour la préparation de solution intracellulaire à base de K+ |
| Na2-Phosphocréatine | Sigma | P1937 | Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire |
| EGTA | Sigma | E3889 | Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire |
| HEPES | Sigma | H4034 | Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | Utilisé pour la préparation de la solution intracellulaire |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | Utilisé pour la préparation de solution intracellulaire |
| CsMeSO4 | Sigma | C1426 | Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+ |
| CsCl | Sigma | C3011 | Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+ |
| TEA-Cl | Sigma | T2265 | Utilisée pour la préparation de solutions intracellulaires à base de Cs+ solution |
| Neurobiotine 488 | Vecteur | SP-1145 | 0,05 % de neurobiotine 488 pourrait être utilisé pour des études morphologiques |
| Agar | Sigma | A7002 | bloc de gélose à 3 % a été utilisé dans notre protocole |
| Paraformaldéhyde | Sigma | P6148 | paraformaldéhyde à 4 % a été utilisé pour le traitement immunohistochimique |
| Na2HPO4 | Hengxing Chemical Réactifs | utilisés pour la préparation du | |
| milieu de lamelle de montage | Polyscience | 18606 | |
| Urethan | National Institute for Food and Drug Control | 30191228 | 1,5 g/kg, i.p. |
| Capillaires en verre borosilicaté | World Precision Instruments | TW150F-4 | 1,5 mm OD, 1,12 mm ID |
| Extracteur de micropipettes | Sutter Instrument | P-97 | Utilisé pour la préparation de micropipettes |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Table d’isolation des vibrations | Technical Manufacturing Corporation | 63544 | |
| Caméra | CCD infrarougeDage-MIT | IR-1000 | |
| Amplificateur patch-clamp | HEKA | EPC-10 | |
| Micromanipulateur | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Platine X-Y | Burleigh | GIBRALTAR X-Y | |
| Microscope vertical | Olympus | BX51WI | |
| Osmomètre | Advanced | FISKE 210 | |
| PH mètre | Mettler Microscope Toledo | FE20 | |
| Confocol | Zeiss | LSM 700 |
Références
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Yoshimura, M., Nishi, S. Blind patch-clamp recordings from substantia gela....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
