Nouvelles méthodes pour l’Administration intranasale sous anesthésie par Inhalation pour évaluer des nez-de-Brain Drug Delivery

Résumé

Nous décrivons ici deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation avec le stress physique minimale pour les animaux de laboratoire. On décrit également une méthode pour l’évaluation quantitative des niveaux de distribution de drogues dans le cerveau via la voie de nez-à-cerveau à l’aide de radioactif [¹⁴C]-inuline comme substrat modèle de macromolécules soluble dans l’eau.

Résumé

Administration par voie nasale a été signalée à être une voie potentielle pour les livraison de nez-à-cerveau d’agents thérapeutiques qui contourne la barrière hémato - encéphalique. Toutefois, on a peu de rapports en ce qui concerne non seulement l’analyse quantitative, mais aussi des conditions optimales d’administration et de schémas pour les enquêtes de nez-à-cerveau livraison de dosage. Des progrès limités dans la recherche sur les mécanismes de voie nez-à-cérébrale utilisant des rongeurs représentant un obstacle important en termes de conception de systèmes de livraison du nez-à-cerveau de médicaments candidats.

Pour obtenir des progrès à cet égard, nous avons développé et évalué deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation pour les animaux de laboratoire. On décrit également une méthode pour l’évaluation des niveaux de distribution de drogues dans le cerveau via la voie de nez-à-cerveau à l’aide de radio-marquées [¹⁴C]-inuline (poids moléculaire : 5 000) comme substrat modèle de macromolécules soluble dans l’eau.

Au départ, nous avons développé un protocole d’administration intranasale axée sur la pipette à l’aide de masques temporairement ouvrantes, qui nous a permis d’effectuer une administration fiable aux animaux sous anesthésie stable. Grâce à ce système, [¹⁴C]-inuline pouvait être envoyé au cerveau avec peu d’erreurs expérimentales.

Par la suite, nous avons développé un protocole d’administration intranasale entraînant une canulation inverse du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage, ce qui a été développé pour minimiser les effets de la clairance mucociliaire (MC). Cette technique a conduit à des taux significativement plus élevés [¹⁴C]-inuline, qui détecta quantitativement dans le bulbe olfactif, cerveau et bulbe rachidien, que la méthode de la pipette. Cela semble être parce que la rétention de la solution médicamenteuse dans la cavité nasale a été considérablement augmentée par l’administration active à l’aide d’une pompe à seringue dans la direction opposée du MC dans la cavité nasale.

En conclusion, les deux méthodes d’administration intranasale développée dans cette étude peuvent s’attendre à être des techniques extrêmement utiles pour l’évaluation pharmacocinétique chez les rongeurs. La méthode inverse de canulation, en particulier, pourrait être utile pour évaluer le potentiel de nez-à-cerveau livraison de candidats-médicaments.

Introduction

Biomédicaments tels que les anticorps, les oligonucléotides et les peptides sont considérés comme ayant des applications potentielles comme de nouveaux agents thérapeutiques pour les troubles du système nerveux central réfractaires qui n’ont actuellement aucun traitement curatif. Toutefois, étant donné que la plupart des biomédicaments sont des macromolécules soluble dans l’eau, livraison du sang dans le cerveau via l’administration par voie intraveineuse ou orale est extrêmement difficile en raison de l’impédance de la barrière sang - encéphalique (BHE).

Ces dernières années, l’administration intranasale a été signalée à être une voie potentielle pour les livraison de nez-à-cerveau d’agents thérapeutiques qui évite le BBB^1,2,3,4,5. Toutefois, on a relativement peu de rapports au sujet de l’analyse quantitative des nez-à-cerveau voie livraison⁶. En outre, il n’y a eu pratiquement aucun rapport sur les conditions d’administration optimale mis en place et les schémas posologiques, tels que volume, fois, périodes de temps et la vitesse, des enquêtes de la livraison de nez-à-cerveau. Les lacunes susmentionnées peuvent être attribuées pour les raisons suivantes : (i) une méthode optimale d’administration intranasale pour souris doit être établi, et (ii) par voie nasale administration en pipettant également, qui est généralement utilisée, est généralement caractérisée par variation interindividuelle chez les animaux en raison de la clairance mucociliaire (MC), menant ainsi souvent à sous-estimer le potentiel de la livraison effective de nez-à-cerveau d’un médicament particulier.

Anesthésie par inhalation, l’isoflurane (initiation : 4 %, entretien : 2 %) avec une inhalation masque pour rongeurs a gagné l’utilisation répandue, dans le but de réduire ou d’éliminer la douleur associée à la chirurgie effectuée sur des animaux de laboratoire. L’utilisation de masques rend relativement simple à exécuter typique de médicaments chez les animaux expérimentaux sous anesthésie par inhalation par voies intraveineuse et sous-cutanée, intrapéritonéales. Toutefois, dans le cas de l’administration intranasale, le masque doit être retiré temporairement des animaux pour l’administration de médicaments. Avec moins de 2 % d’entretien isoflurane, animaux typiquement réveille rapidement de l’anesthésie par inhalation. Lorsque le volume d’administration par dose est important, cela pourrait provoquer la solution médicamenteuse s’écouler de la cavité nasale dans le œsophage, et donc une grande dose peut devoir être décomposé en plusieurs plus petites doses pour l’administration intranasale de petites animaux. Comme l’administration intranasale nécessite le retrait du masque pour une administration répétée et suffisamment de temps pour la livraison de la cavité nasale soutenue, il est fort probable que souris éveillerait de l’anesthésie au cours de la procédure d’administration. Cela rend très difficile d’effectuer l’administration intranasale sous un état stable d’anesthésique et contribue probablement à la variation inter-individuelle de nez-à-cerveau livraison chez les rongeurs.

Dans cette étude, nous avons donc mis au point deux nouvelles méthodes d’administration intranasale stable sous anesthésie par inhalation, qui imposent des contraintes physiques minimes sur les animaux de laboratoire. La première méthode, nous avons utilisé un masque temporairement ouvrant qui permet l’administration intranasale pendant l’anesthésie par inhalation. La partie ouvrante du masque intègre une fiche de silicone qui peut être utilisée conformément au calendrier d’administration pour faciliter l’administration intranasale stable à l’aide d’une pipette. Pour la seconde méthode, une canule a été chirurgicalement insérée pour passer de le œsophage dans la cavité nasale et une pompe à seringue a ensuite été attachée à cela afin que la solution de drogue pourrait être distribuée directement et de manière fiable dans la cavité nasale sous inhalation stable anesthésie. Cette méthode peut améliorer la livraison de médicaments dans le cerveau via la route de nez-à-cerveau, parce qu’en considérablement réduisant au minimum les effets de la MC, médicament mémorisable dans la cavité nasale s’améliorerait. En outre, les auteurs décrivent une méthode d’évaluation quantitative des niveaux de distribution de drogue (% pour le cerveau de la dose injectée/g) dans le cerveau à l’aide de radio-marquées [¹⁴C]-inuline [masse moléculaire (mm) : 5 000] comme substrat modèle de soluble dans l’eau macromolécules.

Protocole

Cette étude animale (#AP17P004) a été effectuée conformément aux directives approuvées par le Comité de l’urbanisme (Tokyo, Japon) et de la Nihon University animalier. Cette étude (#17-0001) a été approuvée par le centre de radio-isotopes de l’école de pharmacie, Université Nihon.

1. les animaux utilisés pour l’Administration intranasale sous anesthésie par Inhalation

1. Maison les souris expérimentales dans des cages en acier inoxydable suivant un cycle lumière/obscurité de 12 h (lumière sur 08:00 – 20:00), avec une température contrôlée maintenue à 23 ± 1 ° C, humidité de 50 % ± 10 % et l’accès à la nourriture et l’eau ad libitum .
2. Avant expérimentation, anesthésier les souris par inhalation de 2 % isoflurane, initiation suivante à une concentration de 4 %. Confirmer le niveau requis d’anesthetization en vérifiant la disparition de la surface de redressement.

2. préparation de la Solution d’Administration

1. Préparer une solution d’administration [¹⁴C]-inuline (50 μM, 0,5 μCi/mL par souris) en diluant dans une solution saline tamponnée au phosphate et conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.

3. par voie nasale Administrations pour souris

1. Méthode de micropipette à l’aide d’un masque d’inhalation temporairement ouvrante (Figure 1)
   Remarque : Cette technique est une modification du protocole administration intranasale à l’aide d’une micropipette établie par Frey et al. ³
   1. Difficulté des souris en décubitus dorsal sur un tableau de visages en enregistrant leurs branches sous anesthésie par inhalation avec 2 % isoflurane (Figure 1 a).
   2. Administrer un volume total de solution d’administration 25 μL de chaque souris à intervalles de 30 s, via 1-2 μl de doses administrées alternativement dans les narines droite et gauche, tandis que les souris sont fixés sous anesthésie par inhalation (Figure 1 b et C).
   3. Remarque : Les déchets gaz anesthésique est piégé par des moyens actifs (fumées hotte, armoire de biosécurité dur-Gainables, vide, etc.) lorsque le masque est ouvert et par des moyens passifs (gaz anesthésique canister) lorsque fermé
2. Inverser la canulation m odes du côté des voies respiratoires par le biais de le œsophage (Figure 2)
   Remarque : Cette technique est une modification du protocole d’absorption par voie nasale chez les rats établis par Hirai et al. ⁷
   1. Difficulté des souris en décubitus dorsal sur un tableau de visages en enregistrant leurs branches sous anesthésie par inhalation avec 2 % isoflurane.
   2. Cheveux dans le cou est rasé et préparée par application de Bétadine ou chlorhexidine suivie d’un rinçage à l’alcool.
   3. Exposer la trachée et l’oesophage en élargissant la peau sous la gorge avec une pince, après avoir fait une petite incision (1,5 cm) avec des ciseaux.
   4. Faites une incision (1 mm) dans la trachée à l’aide de ciseaux.
   5. Insérer une canule (diamètre intérieur : 0,58 mm, diamètre extérieur : 0,965 mm) pour une longueur de 1,2 cm et fixez l’autre extrémité de la canule à l’intérieur du masque respiratoire.
   6. Faire une incision (1 mm) dans le œsophage à l’aide de ciseaux, insérer une canule (diamètre intérieur : 0,28 mm, diamètre extérieur : 0,61 mm) pour une longueur de 1,4 cm vers la partie postérieure de la cavité nasale et ligaturer (Figure 2 a et B).
      Remarque : Les procédures 3.2.2 à 3.2.4 ont été réalisées sous un microscope stéréoscopique à un grossissement × 10.
   7. Fixer une aiguille (27 × 1/2) à une seringue de 1 mL remplie avec une solution d’administration et se connecter à une pompe à seringue à injection programmable.
   8. Se connecter au-dessus de l’aiguille à la canule qui a été insérée dans le œsophage à 3.2.5 (Figure 2).
   9. Administrer un volume total de 25 μL [¹⁴C]-solution d’inuline à un rythme constant (5 μL/min) (Figure 2 et 2D).

4. expérience quantitative à l’aide de macromolécules hydrosolubles Radio-marquées ([¹⁴C]-inuline)

1. Décapiter les souris expérimentales sous anesthésie et ouvrir leurs crânes, à l’aide de ciseaux et du côté du bulbe rachidien, tout en prenant soin de ne pas endommager le cerveau.
2. Extraire soigneusement tout le cerveau à l’excavation à l’aide d’une micro-spatule de crâne.
3. Place un papier filtre imbibé de solution saline sur une boîte de Pétri qui est stocké sur la glace.
4. Placer le cerveau extrait sur papier filtre humide.
5. Essuyez les sang adhère à la surface du cerveau avec un coton-tige imbibé d’une solution saline pour éliminer au moins l’influence de [¹⁴C]-inuline dans le sang à la surface du cerveau.
6. Disséquer les cerveaux rapidement et les diviser en trois parties : le bulbe olfactif, cerveau et bulbe rachidien (y compris la protubérance).
7. Placer des échantillons de cerveau en solubilisant des tissus à 50 ° C pendant 1 h.
8. Ajouter 10 μL de la scintillation liquide cocktail à des échantillons de cerveau.
9. Transférer une aliquote de la solution d’administration dissoute à scintillation cocktail dans un flacon à scintillation pour déterminer la radioactivité de la solution appliquée 25 μL.
10. Mesurer les désintégrations par minute [¹⁴C] radioactivité dans l’échantillon de cerveau (X [¹⁴C] du_cerveau) et la solution appliquée ([¹⁴C] X_{IN dose}) dans un compteur à scintillation liquide équipé d’une bonne correction de Crossover pour ³H et de ¹⁴.

5. analyse

1. Calculer les drogue distribution niveaux (%) de la dose injectée (ID %) selon l’équation suivante :
   Cerveau de ⁄g % ID = ([¹⁴C] X_cerveau/ [¹⁴C] X_{en dose}) × 100,
   où X_brain (cerveau dpm/g) est la quantité de [¹⁴C] - inuline mesuré dans le tissu cérébral et X_{IN dose} (solution dpm/25 μL) est la concentration de la [¹⁴C] - inuline dans la solution utilisée pour l’administration par voie nasale.

Résultats

La figure 3 illustre la [¹⁴C]-niveaux d’inuline (ID % ⁄g du cerveau) dans le bulbe olfactif (A), cerveau (B) et bulbe rachidien (C) obtenue à l’aide de deux types d’administration intranasale évalué dans cette étude. Administration par voie nasale à l’aide de la livraison de méthode activé pipette [¹⁴C]-inuline dans le cerveau à l’aide de masques d’inhalation ouvrante (Figure 1). Sous anesthésie par inhalati...

Discussion

La livraison de nez-à-cerveau de médicaments devrait avoir un effet prononcé sur les troubles du système nerveux central parce que cette voie représente une voie de transport directe qui contourne la BHE. Trois voies différentes de nez-à-cerveau ont été signalés à la date⁸. La première est la voie du nerf olfactif, qui passe de la muqueuse olfactive dans la muqueuse nasale pour le cerveau via le nerf olfactif. La seconde est la voie du nerf trijumeau, qui passe de la muqueuse respiratoire dans la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris ddY	Japan SLC, Inc.		Mâle, 4-6 semaines, 20-30 g
Isoflurane	Pfizer	v002139
Isoflurane setup	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-OTAir, SN-489-4
Masque isoflurane	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Pour les petits rongeurs
Masque isoflurane (type ouvrable)	SHINANO manufacturing CO. LTD.		Commandes spéciales
Boîte d’anesthésie	SHINANO manufacturing CO. LTD.	SN-487-85-02
Ciseaux d’expérimentation animale-1	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-27H
Ciseaux d’expérimentation animale-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	B-13H
Pince à épiler-1	FINE SCIENCE TOOLS Inc.	11272-30	Dumont #7 Pince
épiler Dumoxel-2	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	A-12-1
Tube de canule (PE-50)	Becton, Dickinson and Company.	5069773	D.E. : 0,58 mm, D.E. : 0,965 mm
Tube de canule (SP-10)	NATSUME SEISAKUSHO CO., LTD.	KN-392	D.I. : 0,28 mm, D.E. : 0,61 mm
Rasoir	MARUKAN, LTD.	DC-381
Microscope stéréoscopique	Olympus Corporation	SZ61
Aiguille 27G 1/2 in 13 mm	TERUMO CORPORATION	NN-2738R
Seringue 1 mL	TERUMO CORPORATION	SS-01T
Pousse-seringue	Neuro science	NE-1000
Membrane cellulosique	Toyo Roshi Kaisya, Ltd.
Micro spatule	Shimizu Akira Inc.	91-0088
Micropipette (0,5-10 uL)	Eppendorf AG	Z368083
Pipette à puce	Eppendorf AG	0030 000.811
Tape	TimeMed Labeling System, Inc.	T-534-R	Pour la fixation de la souris
[14C]-Inuline	American Radiomarked Chemicals Inc.	ARC0124A	0,1 mCi/mL
EtOH	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-00461
Compteur à scintillation liquide	Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc	Tri-Carb 4810TR