Article de méthode

Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

DOI :

10.3791/58523

⸱

7 janvier 2019

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1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La présente étude décrit un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection associée aux biomatériaux au fil du temps basée sur la microscopie de fluorescence. Ce modèle est un système prometteur en complément des modèles animaux mammifères tels que les modèles de souris pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est des principales causes de l’échec de biomatériaux/appareils médicaux. Staphylococcus aureus est l’un des principaux pathogènes en BAI. Cours expérimentales animales mammifères de BAI modèles tels que les modèles murins sont coûteuses et chronophages et donc pas adapté à l’analyse à haut débit. Ainsi, les nouveaux modèles animaux comme des systèmes complémentaires pour enquêter sur les BAI in vivo sont souhaitées. Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour visualisation in vivo et l’analyse intravitale d’infection bactérienne en présence de biomatériaux basés sur la microscopie de fluorescence. En outre, la réponse provoquée macrophage a été étudiée. À cette fin, nous avons utilisé fluorescent protéine exprimant S. aureus et embryons de poisson-zèbre transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les macrophages et mis au point une procédure pour injecter des bactéries, seuls ou avec des microsphères dans le muscle tissus d’embryons. Pour suivre l’évolution de l’infection bactérienne chez les embryons vivants au fil du temps, nous avons conçu une méthode simple mais fiable de la notation microscopique de bactéries fluorescentes. Les résultats de marquer microscopiques ont montré que tous les embryons avec plus de 20 unités formant colonie (UFC) de bactéries a donné un signal positif fluorescent de bactéries. Afin d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur infection, nous avons déterminé le nombre d’UFC de S. aureus avec et sans des microsphères de polystyrène 10 µm (PS10) comme les biomatériaux de modèle chez les embryons. En outre, nous avons utilisé le fichier de projet ObjectJ « Poisson-zèbre-Immunotest » opérant dans ImageJ pour quantifier l’intensité de la fluorescence de l’infection à Staphylococcus aureus avec et sans PS10 au fil du temps. Les résultats de ces deux méthodes ont montré un nombre plus élevé de S. aureus dans des embryons infectés avec microsphères que chez les embryons sans microsphères, indiquant une susceptibilité accrue d’infection en présence de ce biomatériau. Ainsi, cette étude montre le potentiel du modèle embryon de poisson zèbre pour étudier BAI avec les méthodes développées ici.

Introduction

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Une variété de dispositifs médicaux (dénommé « biomatériaux ») sont plus utilisés dans la médecine moderne à restaurer ou remplacer des parties de corps humain1. Toutefois, l’implantation des biomatériaux prédispose un patient à l’infection, appelée une infection associée aux biomatériaux (BAI), qui est une complication majeure des implants en chirurgie. Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis sont deux espèces de bactéries plus répandus responsables de BAI2,3,4,5,6. Implanté à forme de biomatériaux une surface sensible à la formation de biofilm bactérien. En outre, réponse immunitaire locale peut être dérangée par les biomatériaux implantés, causant une efficacité réduite de clairance bactérienne. Le dégagement initial d’infectant des bactéries est effectué principalement par infiltration de neutrophiles, qui ont fortement réduit la capacité bactéricide en présence d’inséré ou un biomatériau7. En outre, macrophages s’infiltrer dans les tissus après que l’afflux initial de neutrophiles vont phagocyter les bactéries restantes, mais ne peuvent pas efficacement les tueront intracellulaire, en raison de dérangé immunitaire de signalisation qui est une conséquence de la présence combinée de le biomatériau et bactéries8. Ainsi, la présence des biomatériaux peut faciliter la survie intracellulaire des bactéries9,10,11,12,13 et biofilm formation sur l’implant biomatériaux,4,14. Par conséquent, BAI peut conduire à l’échec et nécessaire pour le remplacement des biomatériaux implantables, causant une augmentation de la morbidité et de mortalité et d’hospitalisation prolongée avec des coûts supplémentaires2,15.

Un nombre croissant de stratégies anti-BAI est actuellement développés2,16,17. Évaluation in vivo de l’efficacité de ces stratégies dans des modèles animaux pertinents est essentielle. Cependant, les traditionnels modèles animaux expérimentaux de la BAI (p. ex., les modèles de souris, ) sont généralement coûteux, chronophages et donc ne convient pas pour le haut débit test de multiples stratégies18. Développement récent des techniques d’imagerie bio-optique basé sur bioluminescent/fluorescent étiquetage des bactéries et des cellules de l’hôte peut permettre la surveillance continue des interactions de progression et hôte-pathogène-matériel/hôte BAI en simples petits animaux comme les souris18,19,20,21. Cependant, cette technique est relativement complexe et encore à ses balbutiements, et plusieurs questions doivent être traitées pour l’analyse quantitative de BAI18. Par exemple, une dose de provocation élevée est nécessaire pour visualiser la colonisation bactérienne. En outre, la lumière diffusion et adsorption des signaux de bioluminescence/fluorescence dans les tissus des essais chez les mammifères, les animaux doivent être également adressée à18,19,21. Par conséquent, des modèles animaux innovatrice et rentables permettant une visualisation intravitale et analyse quantitative au fil du temps sont des systèmes complémentaires utiles pour l’étude in vivo de BAI.

Poisson-zèbre (embryons) ont servi comme un outil polyvalent in vivo pour disséquer les interactions hôte-pathogène et la pathogenèse de l’infection de plusieurs espèces de bactéries telles que les mycobactéries22, Pseudomonas aeruginosa,23, Escherichia coli24, Enterococcus faecalis25et staphylocoques26,27. Des embryons de poisson-zèbre présentent de nombreux avantages tels que la transparence optique, un coût d’entretien relativement faible et la possession d’un système immunitaire très semblable à celui des mammifères28,29. Cela rend les embryons de poisson-zèbre, un organisme modèle très économique, vivant pour intravitale visualisation et l’analyse de la progression de l’infection et hôtes réponses28,29. Pour permettre la visualisation du comportement de la cellule zebrafish in vivo, transgénique lignes avec différents types de cellules immunitaires (par exemple, les, macrophages et les neutrophiles) et même avec des structures subcellulaires fluorescent marqués ont été mis au point28 ,29. En outre, le taux de reproduction élevé du poisson-zèbre offre la possibilité de développer des systèmes de test haut débit avec injection robotique automatisée, quantification de fluorescence automatisé et RNA sequence analysis27, 30.

Dans la présente étude, nous avons cherché à développer un modèle d’embryon de poisson zèbre pour infection associée aux biomatériaux à l’aide de techniques d’imagerie de fluorescence. À cette fin, nous avons développé une procédure pour injecter des bactéries (Staphylococcus aureus) en présence de microsphères de biomatériau dans le tissu musculaire des embryons de poisson-zèbre. Nous avons utilisé des S. aureus RN4220 exprimant mCherry protéine fluorescente (s. aureus- mCherry), qui a été construite comme ailleurs pour un autre S. aureus souche10,31. La ligne zebrafish transgénique (mpeg1 : SAMU/Kaede) exprimant Kaede protéine fluorescente verte dans les macrophages32 et bleu fluorescent des microsphères de polystyrène ont été utilisés. Dans une étude précédente, nous avons montré qu’une injection intramusculaire de microsphères dans des embryons de poisson-zèbre pour imiter l’implantation biomatériau est faisable33. Quantitativement, analyser la progression de BAI et l’infiltration de cellules associées chez les embryons unique au fil du temps, nous avons utilisé le fichier de projet de « Poisson-zèbre-Immunotest » qui est utilisé dans un « ObjectJ » (un plug-in pour ImageJ) pour quantifier l’intensité de la fluorescence de les bactéries résidant et macrophages infiltrant à proximité du site d’injection de microsphères33. En outre, nous avons déterminé les numéros formant des colonies (UFC) d’unités de bactéries en présence et en absence des microsphères dans les embryons d’étudier les effets potentiels des biomatériaux sur l’infection. Notre étude montre qu’avec les méthodes développées ici, l’embryon de poisson zèbre est un modèle animal vertébré prometteur, roman pour l’étude des infections associées aux biomatériaux in vivo.

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Protocole

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Dans ce protocole, maintenance de poissons zèbres adultes est conforme au règlement de bien-être animal local tel qu’approuvé par le comité local de bien-être animal. Expériences avec des embryons ont été effectuées conformément à la Directive 2010/63/UE.

1. préparation des « Bactéries seulement » et des Suspensions de bactéries-microsphères

Remarque : La souche de S. aureus RN4220 exprimant la protéine fluorescente mCherry (S. aureus- mCherry) est utilisée. La souche RN4220 de S. aureus est mutée dans la virulence gène régulateur agrA (détendeur de gène accessoire A)34et par conséquent peut-être relativement faible virulence dans le modèle d’embryon de poisson zèbre. Autres souches de S. aureus ou d’autres espèces bactériennes pour BAI peut être utilisé.

  1. Prendre 4 à 5 colonies de S. aureus RN4220 bactéries de culture gélose trypticase soja additionné de 10 chloramphénicol µg/mL et la culture de la bactérie à la phase de croissance moyenne logarithmique dans 10 mL de bouillon trypticase soja additionné de 10 µg/mL chloramphénicol à 37 ° C sous agitation.
    1. Au cours de la culture, diluer 100 µL de la suspension bactérienne dans 900 µL d’une solution saline de stérile tamponnée au phosphate (PBS) dans une cuvette (largeur de 1 cm) pour une mesure de la densité optique (Do) à 620 nm (do620). La culture des bactéries jusqu'à ce que le do620 atteint 0,4 – 0,8.
      Remarque : Un do620 de 0,1 correspond généralement à 3,0 x 107 UFC/mL S. aureus. Le do620 d’un inoculum de bactéries en phase de croissance logarithmique moyenne se situe entre 0,4 à 0,8. Différentes périodes de culture peuvent être nécessaire pour d’autres espèces et souches de bactéries.
  2. Centrifuger à 3 500 x g pendant 10 min, les bactéries et remettre en suspension les bactéries boulettes dans 1 mL de PBS stérile. Par la suite laver les bactéries avec des temps de 2 PBS stériles et enfin remettre en suspension les bactéries dans 1,1 mL de solution de40 (PVP-40) de polyvinylpyrrolidone de 4 % (p/v) dans du PBS.
  3. Vortex cette suspension bactérienne et diluer 100 µL de la suspension dans 900 µL de PBS stérile dans une cuvette pour la mesure de620 OD. Ajuster la concentration de la suspension bactérienne avec solution40 PVP. Il s’agit de la suspension « Bactéries seulement ».
  4. Biomatériaux peut être librement choisi de mélanger avec une suspension bactérienne. Dans la présente étude, des microsphères commercial polystyrène (PS) (bleu fluorescent, 10 µm) sont utilisés. Pour générer une suspension de bactéries-microsphères, centrifuger les microsphères pdt 1 min à 1 000 x g, température ambiante, jeter le surnageant et remettre en suspension les microsphères dans la suspension « Bactéries seulement » (en solution PVP de40 ).
  5. Afin d’injecter des doses approximativement égales de bactéries en présence et en l’absence des microsphères, la concentration de bactéries-microsphères suspension doit être de deux tiers de la concentration de la suspension « Bactéries seulement » (sans microsphères). Ceci est réalisé en diluant la suspension de bactéries-microsphères avec 0,5 volume de solution40 PVP. Mélanger les suspensions au vortex. Remarque, ce ratio (deux tiers) a été évalué pour S. aureus. Il est également approprié pour S. epidermidis, mais il est conseillé de vérifier si ce ratio s’applique également aux autres espèces bactériennes et autres formes de biomatériaux (que microsphères) ou de tailles (à 10 µm) à doser.
  6. Vérifier la concentration de la suspension « Bactéries seulement » et les bactéries-microsphères en culture quantitative de dilutions en série 10 fois comme ci-dessous : transférer 100 µL des suspensions pour un 96 puits-plaque et en série diluées par le transfert de 10 µL d’extraits de la suspension en 90 µL de PBS stérile. Plaque double 10 µL d’extraits des suspensions non diluées et diluées sur les plaques de gel d’agarose, incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit, compter les colonies et calculer le nombre de bactéries (unités formant des colonies. CFU).

2. pendant la reproduction, la récolte et l’entretien des embryons de poisson-zèbre

  1. Suivez les procédures générales décrites plus tôt35,36 pour reproduction, exploitation et entretien des embryons de poisson-zèbre, avec les modifications décrites ci-dessous. Traverser une famille de type sauvage Tupfel longue nageoire (TL) poisson zèbre ou poisson-zèbre de la lignée transgénique sélectionnée (ici, Mpeg1 : Kaede) dans un bassin avec un filet ajouté pour induire les femelles adultes de produire des œufs après que le voyant s’allume, puis se séparent des œufs produits adultes.
  2. Recueillir les embryons le lendemain et jeter celles non transparentes qui ne sont pas viables. Gardez environ 60 embryons par boîte de pétri (diamètre 100 mm) à l’E3 moyen37 et incuber à 28 ° C. Retirer les embryons morts et anormales et actualiser le milieu E3 tous les jours.

3. préparation des aiguilles à Injection

  1. Préparer les verre microcapillaire aiguilles pour injection en utilisant un instrument d’extracteur de micropipette. Utilisez les paramètres suivants : chaleur : 772, tirer : 100, vel : temps 200, : 40, gaz : 75.
  2. Briser la pointe de l’aiguille avec une pince à la position où l’aiguille a un diamètre extérieur d’environ 20 µm (pour 10 µm microsphères), à l’aide d’un microscope optique avec une barre d’échelle dans l’oculaire. Évitez les aiguilles avec une ouverture très grande taille, car ils vont compromettre la survie des embryons.
    Remarque : L’ouverture peut être choisie pour être le plus petit ou plus, selon la taille et la forme des biomatériaux à doser. Dans la littérature, des injections avec des aiguilles avec une ouverture d’environ 50 µm ont été signalées à provoquer une diminution significative de la survie embryonnaire38.

4. l’injection de « Bactéries seulement » ou bactéries-microsphères Suspension dans des embryons de poisson-zèbre

  1. Chauffer la solution de gel d’agarose (1 à 1,5 % (wt) en demi-eau) à l’aide d’un four à micro-ondes et la verser dans un plat de pétri de 100 mm. Placer un modèle de moule en plastique sur le dessus de la solution d’agarose dans la boîte de pétri pour créer des empreintes dans le gel d’agarose pour le placement des embryons en bonne position, faciliter les injections. Incuber à température ambiante et enlever le moule lorsque la solution de gel d’agarose est solidifiée.
  2. À fécondation après 3 d, placer les embryons dans un 100 mm boîte de pétri contenant 0,02 % (p/v) d’acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne) pour anesthésier les. Après 5 min, transférer les embryons à la plaque de gel d’agarose superposée avec E3 milieu contenant 0,02 % (p/v) Tricaïne et alignez-les dans une orientation d’injection. Pour le Mpeg1 : Kaede lignée transgénique tout d’abord anesthésier dans E3 moyen tricaïne de 0,02 % (p/v) contenant des embryons. Sélectionnez ensuite les embryons exprimant des protéines fluorescentes vertes à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo.
  3. Charger l’aiguille avec environ 10 µL de la suspension « Bactéries seulement » ou des bactéries-microsphères à l’aide d’une pointe de pipette de microloader. Monter l’aiguille sur un micromanipulateur relié à la micro-injecteur. Pour l’injecteur utilisé ici (voir Table des matières), utiliser les paramètres suivants pour les injections de 2 – 3 nL : pression : 300 – 350, contre-pression : 0, temps : 2 ms.
    Remarque : Les réglages pour le micro-injecteur dépendent de l’injecteur utilisé. Paramètres de l’injecteur peuvent devoir être ajustée pour les injections de bactéries mélangés avec des biomatériaux avec d’autres formes ou tailles.
    1. Utiliser des aiguilles avec la même ouverture pour l’injection de la suspension « Bactéries seulement » et la suspension de bactéries-microsphères. Si l’aiguille est cassé ou bouché, toujours changer pour une nouvelle aiguille pour injections de plus loin.
  4. Introduire l’aiguille dans le tissu musculaire des embryons sous un microscope optique (Figure 1), à un angle de 45 à 60 ° entre l’aiguille et le corps des embryons. Régler la position de l’aiguille dans le tissu en le déplaçant doucement en arrière. Injecter les embryons à l’aide d’une pédale reliée à la micro-injecteur.
  5. Après l’injection de bactéries fluorescentes, marquer les embryons pour infection réussie sous un microscope à fluorescence stéréo. Jeter l’embryons a marqué négatif (aucune bactérie fluorescent visible ou pas microsphères fluorescentes visibles). Maintenir les embryons individuellement dans un milieu E3 en plaques de 48 puits. Actualiser le support de tous les jours.

5. broyage des embryons microscopiques marquant et Culture Quantitative des bactéries

  1. Marquer tous les embryons au microscope la présence de bactéries fluorescentes à l’aide d’un microscope à fluorescence stéréo, commençant immédiatement après les injections et sur chaque jour suivant jusqu'à ce que les embryons sont choisis au hasard pour la culture quantitative.
  2. Au hasard choisir quelques embryons vivants d’infectées (5 à 6 dans la présente étude) peu de temps après l’injection et de les transférer individuellement pour microtubes séparés de 2 mL à l’aide d’embouts stériles. Retirez le support, laver les embryons doucement avec du PBS stérile une fois et ajouter 100 µL de PBS stérile.
  3. Ajouter 2 ou 3 perles de zircone stérile (2 mm de diamètre) à chaque flacon et écraser les embryons à l’aide de l’homogénéisateur (voir Table des matières) à 3 500 tr/min pendant 30 s. Culture l’homogénat quantitativement comme indiqué au point 1.3.
    Remarque : Autres homogénéisateurs peuvent nécessiter des paramètres différents.
  4. Choisir au hasard des embryons multiples sur les jours suivants après l’injection pour la culture quantitative selon l’étape 5.3.

6. Fluorecence de la Progression de l’Infection et une Infiltration cellulaire provoquée chez les embryons de poisson-zèbre

  1. Anesthésier les embryons comme indiqué au point 4.2. Pipeter 500 µL de solution PBS - 2 % (wt) méthyl cellulose dans une boîte de pétri contenant le support E3 avec 0,02 % (p/v) Tricaïne. Placez les embryons dans la solution de méthyl cellulose et conservez-les droites et horizontales.
    Remarque : Solution de méthyl cellulose est utilisée comme une « colle », qui, en raison de sa viscosité, peut immobiliser temporairement les embryons dans la meilleure orientation pour l’imagerie.
  2. Utiliser un microscope à fluorescence stéréo équipés de champ lumineux, mCherry, protéine fluorescente verte (GFP) et UV filtres aux embryons individuels image sous paramètres optimisés identiques (p. ex. temps intensité, gain et l’exposition de, ) à un grossissement x 160 . Définir le plan focal tels que les lésions tissulaires dues à l’injection sont mise au point, en utilisant le filtre champ lumineux. Réglez la profondeur Z-pile à 10 µm et pas en taille à 5 µm, ce qui permet pour un enregistrement de 3 images consécutives.
  3. Embryons individuels de image une fois par jour par injection après 5 h jusqu'à 2 jours après injection. Exclure des embryons morts (aucune pulsation ou embryon partiellement dégradé) pour davantage d’imagerie et d’analyse. Maintenir les embryons individuellement dans un milieu E3 en plaques de 48 puits. Actualiser le support de tous les jours.

7. analyse Quantitative de l’intensité de la Fluorescence de la Progression de l’Infection et une Infiltration cellulaire provoquée à l’aide de fichier de projet objet J « Poisson-zèbre-Immunotest »

  1. Télécharger « Poisson-zèbre-Immunotest » et le manuel détaillé du lien : < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>, tel que décrit dans une précédente étude33. En bref, ouvrir des images pour l’analyse « Poisson-zèbre-Immunotest », fonctionnant sous le logiciel freeware Image J. Dans chaque image chargée, marquer manuellement le point d’injection basée sur les dégâts observés tissus d’embryons.
    Remarque : Le site marqué est utilisé par « Poisson-zèbre-Immunotest » comme point central pour détecter le pic de fluorescence à une distance de 50 µm. Le pic de la fluorescence détectée sert ensuite comme le centre d’une zone standard (diamètre de 100 µm) pour la mesure de la fluorescence.
  2. Cliquez sur « calcul » dans le menu objet J d’exécuter la mesure fluorescente pour plusieurs canaux, le cas échéant, automatiquement pour toutes les images. Exporter les données et les analyser par des méthodes de test statistique approprié.

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Résultats

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La présente étude a évalué l’applicabilité des embryons de poisson-zèbre comme un nouveau modèle animal vertébré pour enquêter sur les infections associées aux biomatériaux. Technique de microinjection a été couramment utilisé pour injecter différentes espèces bactériennes dans des embryons de poisson-zèbre pour causer une infection22,26,27,30,

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infection associée aux biomatériaux (BAI) est une complication grave de clinique. Une meilleure compréhension de la pathogenèse de BAI in vivo pourrait apporter un nouvel éclairage pour améliorer la prévention et le traitement de BAI. Cependant, actuel BAI des modèles animaux expérimentaux tels que les modèles murins sont coûteuses et fastidieuses et nécessitent un personnel spécialisé formés aux techniques chirurgicales complexes. Par conséquent, ces modèles ne conviennent pas pour analyse à haut débit. Étant donné que ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financièrement soutenue par le projet d’IBIZA du programme matériel biomédical (BMM) et cofinancée par le ministère néerlandais des affaires économiques. Les auteurs souhaite remercier Prof. Dr. Graham Lieschke de l’Université Monash en Australie pour fournir la lignée transgénique de poisson-zèbre (mpeg1:Gal4 / UAS:Kaede).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Gélose tryptique au sojaBD Difco236950Unité de préparation des milieux chez AMC
Bouillon de soja tryptiqueBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidone40ApplichemA2259.0250
10 & micro ; microsphères en polystyrène de diamètre m (bleu fluorescent)Life technology/ThemoFisherF8829
Microcapilaire en verre (1 mm de diamètre extérieur x 0,78 mm de diamètre intérieur)Harvard Apparatus30-0038
Instrument d’extraction de micropipettesSutter Instrument IncFlaming p-97
Microscope optique LM 20LeicaMDG33 10450123
Acide 3-aminobenzoïque (Tricaïne)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
Microscope stéréofluorescent LM80PointesMDG3610450126
MicroloaderEppendorf5242956.003
Micromanipulateur M3301 avec support M10World Precision Instruments00-42-101-0000
Micro-injecteur FemtoJet expressEppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 mL ppSarstedt72.693.005
Billes de zirconeBio-connect11079124ZX
MagNA lyserRoche41416401
MSA-2 plaques (Mannitol Salt Agar-2)Biomérieux43671Chapmon 2 medium
Methyl cellulose 4000cpSigma-AldrichMO512-250G
ChloramphénicolSigma-AldrichC0378
Gyrotory shaker (pour la croissance bactérienne)New Brunswick ScientificG10
Incubateur de poisson-zèbreVWRIncu-line
CuvettesBRAND759015
CentrifugeuseHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
Spectromètre Pharmacia biotechUltrospec® ; 2000
PinceSigma-AldrichF6521-1EA
48 plaques de puitsGreiner bio-one677180
96 plaques de puitsGreiner bio-one655161
boîte de PétriFalcon353003
boîte de PétriBiomérieuxNL-132
ImageJSans objetobjetlien : https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0PrismSans objet
de pipette Leica Sans

Références

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Infection associ e aux biomat riauxmicroscopie fluorescenceinjection de microsph resr ponse macrophagiqueunit formant colonieObjectJ ImageJexpression de prot ines fluorescentes

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