Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Résumé

Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.

Résumé

Biogenèse des chloroplastes nécessite l’importation de milliers de protéines codées noyau dans les plastes. L’importation de ces protéines dépend du translocon à l’extérieur (TOC) et les membranes internes des chloroplastes (TIC). Les complexes TOC et TIC sont multimériques et probablement contiennent des composants encore inconnus. L’un des principaux objectifs dans le domaine est d’établir l’inventaire complet des composants TOC et TIC. Pour l’isolement des complexes de TIC-TOC et l’identification de nouveaux composants, le récepteur préprotéines que Toc159 a été modifiée en position N-terminale par l’ajout de la balise de purification (TAP) tandem affinité aboutissant à TAP-TOC159. Le TAP-tag est conçu pour les deux étapes de purification d’affinité séquentielle (d'où « affinité tandem »). La TAP-balise utilisée dans ces études se compose d’un domaine N-terminal IgG-liaison dérivé de protéine de Staphylococcus aureus un (ProtA) suivi par un peptide liant la calmoduline (CBP). Entre ces balises deux affinité, un tabac etch clivage protéase virus (TEV) site a été inclus. Par conséquent, protéase TEV peut être utilisé pour douce élution des complexes contenant du TOC159 après la liaison d’IgG perles. Dans le protocole présenté ici, la deuxième étape de purification de la calmoduline-affinité a été omise. Le protocole de purification commence par la préparation et la solubilisation des membranes cellulaires totales. Après le traitement-détergent, les protéines de la membrane solubilisée sont incubés avec perles d’IgG pour l’immunoisolation des complexes contenant du robinet-TOC159. Liaison et un lavage, TAP-TOC159 complexes contenant sont clivés et libérés des perles d’IgG à l’aide de la protéase TEV par laquelle le domaine de liaison à IgG S. aureus est supprimé. Western Blot de l’isolé complexes contenant TOC159 peuvent être utilisés pour confirmer la présence de protéines connues ou soupçonnées, TOC et TIC. Plus important encore, les complexes contenant du TOC159 ont été utilisés avec succès pour identifier les nouveaux composants des complexes TOC et TIC par spectrométrie de masse. Le protocole que nous vous présentons potentiellement permet l’isolement efficace d’une protéine de membrane-bondissent complexe à utiliser pour l’identification des éléments encore inconnus par spectrométrie de masse.

Introduction

Les plantes dépendent des chloroplastes pour la photosynthèse et la croissance photoautotrophique¹. La grande majorité des protéines de chloroplastes est codée dans le noyau, synthétisée dans le cytosol et importée dans le chloroplaste par les complexes TIC et TOC dans l’enveloppe membranes². Le noyau du complexe TOC est constitué du chenal menant à la protéine Toc75 et deux récepteurs GTPases Toc33 Toc159^3,4,5. TOC159 est essentiel pour la biogenèse des chloroplastes et intervient dans l’accumulation massive de protéines associées à la photosynthèse,⁶. Le complexe des TIC se compose de la canal de conduction protéine TIC20 ainsi que TIC110 et TIC40^7,8. Récemment, une translocation de protéines 1MD complexe au niveau de la membrane enveloppe intérieure a été isolée et contenait des éléments inconnus⁹, dont a été TIC56. Récemment, nous avons isolé co TIC56 du 1 MDa complexe en utilisant le protocole de purification d’affinité TAP-TOC159. Les données indiquent un chevauchement structurels entre les complexes TOC/TIC « canonical » et le complexe 1 MDa¹⁰. Auparavant inconnue des composants tels que KOC1 sont désignés comme nouveaux partenaires d’interaction des complexes TOC et TIC à l’aide de la méthode robinet décrit ici^10,11.

Ainsi, la purification de TAP-tag est une méthode efficace pour l’isolation des complexes protéiques et l’identification des partenaires qui interagissent par l’analyse par spectrométrie de masse subséquentes¹². La balise de robinet se compose de deux répétitions de liaison IgG séparées d’un peptide liant la calmoduline (CBP) par un tabac etch site de clivage de protéases virus (TEV). La méthode originale, consistant en une étape de purification d’affinité IgG suivie par TEV et chromatographie d’affinité-calmoduline subséquente autorisée la purification native de grand et très pur protéines complexes^13,14 . Nous avons simplifié la procédure et a démontré que les complexes de protéine contenant du TOC159 peuvent également être épurées efficacement en utilisant uniquement l’étape de purification IgG-affinité suivie par TEV élution¹⁵. Dans notre expérience, l’omission de l’étape de la calmoduline-affinité a donné lieu à des rendements plus élevés et peut-être donc convenir pour des protéines de faible abondance.

En bref, nous avons conçu le stable transgéniques a. thaliana exprimant TAP-TOC159 dans le ppi2 (toc159 KO mutant) contexte et établi comme une source fiable pour la purification des complexes TOC-TIC. Le protocole pour l’isolement du complexe TOC-TIC commence par l’homogénéisation de la matière végétale dans un tampon sans détergent. Après centrifugation, le surnageant est ignoré. La pastille contenant la fraction totale de membrane est solubilisée à l’aide d’un tampon contenant du détergent. Après une étape d’ultra-centrifugation, le surnageant contenant des complexes de TOC-TIC solubilisées est appliqué à l’IgG de résine pour la purification d’affinité. Après plusieurs étapes de lavage, élution est réalisée en utilisant un tampon contenant de protéase TEV pour cliver sélectivement en aval du domaine de liaison IgG et doucement relâchez natives complexes contenant TOC159. L’éluat TEV peut être analysé directement par Western blot ou spectrométrie de masse pour identifier les partenaires d’interaction de TOC159^10,11,15. La méthode a également été utilisée pour identifier les modifications post-traductionnelles des TOC159¹⁵. À l’avenir, natives complexes contenant TOC159 peuvent être utilisés pour les études structurales à l’aide de la microscopie cryoélectronique.

Protocole

1. préparation des plantes Arabidopsis

1. Préparer 1 L de force la moitié du milieu de Murashige et Skoog (MS) moyen y compris vitamines contenant 1 % de sucrose et ajuster le pH à 5,7 avec l’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter 0,8 % du phytoagar et stériliser pendant 20 min à 120 ° C.
2. Verser 75 mL de milieu MS par boîte de Petri (diamètre 14,5 cm, hauteur 3 cm) et de permettre la solidification pendant 1 h.
3. Ajouter 30 mg de graines d’Arabidopsis thaliana à un tube de microtubes de 1,5 mL et surface de stériliser avec de l’éthanol 70 % (v/v) contenant 0,05 % (v/v) X-100 Triton pendant 5 min, suivie de 100 % (v/v) d’éthanol pendant 10 min. Retirez l’éthanol.
4. Transférer les graines stérile papier filtre pour le séchage. Saupoudrer les graines stérilisées uniformément sur une plaque de MS (chaque génotype nécessite au moins 8 à 10 plaques) et sceller chaque plaque avec ruban chirurgical.
5. Incuber les plaques à 4 ° C pendant deux jours dans l’obscurité pour synchroniser la germination des graines. Transfert vers une chambre de croissance avec le cycle de lumière suivant : 8 h de 120 µmol m⁻² s⁻¹ léger et 16 h d’obscurité à 22-20 ° C.

2. préparation de la HsIgG d’Agarose perles

1. Suspendre le CNBr activés d’agarose perles (4 g) dans 100 mL d’HCl à 1 mM et incuber 30 min à température ambiante.
2. Transférer les perles d’agarose dans un filtre en verre fritté, laver sous vide avec 100 mL d’HCl à 100 mM et répéter 2 - 3 fois.
   NOTE : Refroidir la solution de lavage à 4 ° C.
3. Remettre en suspension l’agarose perles dans 1 mL de HCl à 100 mM froid et les transférer dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Laver le filtre en verre fritté avec 3 mL de HCl à 100 mM et transférer le liquide dans le même tube.
4. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette.
   Remarque : Ne pas décanter le tube.
5. Remettre en suspension les perles dans 50 mL de tampon de couplage (tableau 1) ; mélanger brièvement et ensuite tourner à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.
6. Dissoudre 50 mg de l’Homo sapiens lyophilisée IgG (Hs-IgG) dans 10 mL de tampon de couplage, mélanger doucement les talons d’agarose et incuber dans un agitateur rotatif pendant une nuit à 4 ° C.
7. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette.
8. Laver les perles IgG-agarose avec 50 mL de couplage tampon et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.
9. Remettre en suspension les perles IgG-agarose avec 50 mL de tampon de blocage (tableau 1) et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C. Répéter une fois.
10. Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 50 mL de tampon de blocage, tournez le mélange pendant 2 h à RT et un essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C.
11. Retirez le surnageant et remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 200 mL de tampon de couplage de NaCl (tableau 1).
12. Pour bloquer les groupes restants de CNBr réticulation, laver les perles IgG-agarose avec 100 mL de glycine-HCl 0,1 M pH 2,8. Tournant à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Laver avec 0,2 M glycine-HCl, pH 2,8, essorage à 400 × g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Enfin, laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure.
13. Laver les perles IgG-agarose avec 200 mL d’eau ultrapure et ensuite 200 mL de tampon PBS (tableau 1).
14. Remettre en suspension les IgG-agarose perles dans 20 mL de tampon PBS avec 0,01 % NaN₃ (azoture de sodium) et de conserver à 4 ° C.

3. isolement et solubilisation de la Fraction de Membrane

1. Broyer 10 g de semis a. thaliana âgé de trois semaines dans l’azote liquide en utilisant un froid mortier et un pilon avec du sable.
2. Ajouter 20 mL de froid meulage tampon (tableau 1) à 10 g de tissu fondamental, bien mélanger et fondre sur la glace.
3. Filtrer l’homogénat deux couches de matériau de filtration rapide dans un tube à centrifuger conique 50mL. Faire tremper le matériel de filtration rapide avec mouture tampon avant la filtration.
4. Centrifuger le filtrat pendant 10 min à 1 500 × g à 4 ° C et transfert le surnageant dans un tube à centrifuger conique réfrigérés 50 mL, répétez la même étape une fois de plus et récupérer le surnageant. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction totale » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure
5. Transférer le surnageant à tubes ultracentrifugeuse mL 38,50 froide et garnir à 35 mL avec tampon de meulage froid. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse.
6. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL de la « fraction soluble » et les conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
7. Resuspendre le culot vert en utilisant un homogénéisateur de téflon de verre, dans un tampon de meulage. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse et éliminer le surnageant.
8. Resuspendre le culot vert dans 18,75 mL 1 x tampon à l’aide d’un homogénéisateur de téflon verre de meulage et ajouter 9,375 mL 1 x tampon de meulage.
9. Ajouter 9,375 mL de la solution de x solubilisation 4 (tableau 1) (contenant le détergent TX-100) pour donner 37,5 mL et incuber pendant 30 minutes sur un « agitateur rotatif » à 4 ° C.
10. Centrifuger pendant 1 h à 100 000 × g à 4 ° C dans une ultracentrifugeuse. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger conique 50 mL. Conserver un échantillon de 200 µL du surnageant (futur « fraction de charge ») et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
11. Resuspendre le culot dans 37,5 mL de tampon de meulage. Conserver l’échantillon de la partie insoluble et conserver à-80 ° C

4. immunoprécipitation

1. Equilibrer les 100 µL de panier résine IgG-agarose en tampons A (tableau 1) et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C.
2. Retirez le surnageant et remettre en suspension dans la résine IgG-agarose dans 100 µL de tampons A à 4 ° C.
3. Transférer la résine IgG-agarose lavée à 37,5 mL des membranes solubilisées et incuber pendant la nuit sur un agitateur rotatif dans un tube à centrifuger conique 50 mL à 4 ° C.
4. Sédiments l’IgG-agarose en résine à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C et retirer le surnageant avec une pipette. Conserver un échantillon de 200 µL du flux « à travers » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
5. Laver la résine IgG-agarose à 37,5 mL de tampons A et incuber pendant 10 min sur un agitateur rotatif.
6. Sédiments la résine IgG-agarose à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C, retirez le surnageant avec une pipette, ajouter 5 mL de broyage des tampons A dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à 100 × g, 4 ° C, 5 min. conserver un échantillon de 200 µL du « Lavage 1 » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
7. Répéter les 5 mL étape trois fois avec le tampon A. de lavage
8. Effectuer les deux dernières étapes de lavage sans les inhibiteurs (NaF, inhibiteur de la protéase et PMSF)
   NOTE : Les inhibiteurs sont n’est plus nécessaire à ce stade et omis pour réduire les coûts. Conserver un échantillon de 200 µL du dernier lavage étape « lavage final (W6) » et conserver à-80 ° C pour une analyse ultérieure.
9. Transférer la résine IgG-agarose à une colonne 500 µL avec un filtre à 35 µm et laver les perles deux fois avec 300 µL de tampon d’élution TEV (tableau 1) (ne contenant ne pas de AcTEV) pour l’équilibration. Fermer la colonne.
10. Ajouter 300 µL de tampon d’élution TEV contenant 50 unités (10 µL) de l’AcTEV. Préparer le mélange dans un tube avant d’ajouter à la résine.
11. Incuber la colonne avec des perles dans un thermomixer à 16 ° C, 350 tr/min pendant 2 h. la colonne inverser doucement plusieurs fois toutes les 30 minutes.
12. Ouvrir la colonne, placez-le dans un nouveau tube propre 1,5 mL et un essorage à 100 × g pendant 5 min à 4 ° C à recueillir l’éluat.
13. Sec (par exemple) 10 % (v/v) de l’échantillon éluée (~ 25 µL) dans un évaporateur centrifuge et utiliser pour la spectrométrie de masse ou autre une analyse plus approfondie.
14. Aliquote l’éluat restant (~ 275 µL) divisé en onze centrifuger de 1,5 mL tubes (25 µL chaque), sécher dans un évaporateur centrifuge et conserver à-80 ° C.
15. Analyse des échantillons conservés tout au long de la procédure ainsi que les éluats de norme SDS-PAGE suivie par immunoblotting. Pour la préparation de l’échantillon, précipité 50 µg de Total (T), charge (L), le débit à travers (FT), laver 1 (W1) et 200 µL de lavage 6 (W6) par chloroforme/méthanol extraction¹⁶.
16. Ajouter 10 µL de 2 x tampon de charge de SDS-PAGE (tableau 1) pour les échantillons précipités et 25 µL de l’échantillon séché éluée. Vortex et faire bouillir pendant 10 min à 95 ° C dans un bloc chauffant.
17. Analyse totale (T), charge (L), écoulement à travers (FT), lavage 1 (W1), laver 6 (W6) et élution (E) par immunotransfert utilisant des anticorps anti-TOC159 pour déterminer l’efficacité de la technique d’isolation.

Résultats

Nous avons décrit ici un protocole pour la purification d’une protéine d’enveloppe chloroplastique TAP-tag complexe transgéniques a. thaliana plantes. Comme le montre la Figure 1A, plantes exprimant le 35S:NTAP-TOC159 construct a permis d’isoler ce complexe alors que les plantes exprimant la construction de 35S:NTAP ont été utilisés comme un contrôle. Figure 1 B indique les étapes détaillées de la purification de complexes protéiques de TAP-TOC159 suivi par spectrométrie de masse pour permettre l’identification des protéines qui interagissent. L’analyse par immunotransfert (Figure 2, côté droit) confirme que TAP-TOC159 isolé interagit avec TOC75 et TOC33 du complexe TOC. La kinase de la membrane externe de chloroplaste KOC1 connu de phosphoryler TOC159 aussi co isolé avec le complexe de TAP-TOC159 (Figure 2B, côté droit). La présence de TIC110 révèle que le complexe de TAP-TOC159 isolé contient également les composants de l’ensemble des TIC. L’anticorps FBN1A dirigé contre une protéine de plastoglobule non liée à l’import des protéines ne reconnaissait pas le complexe de TAP-TOC159 indiquant l’absence de contaminations. Dans le contrôle négatif, immunoprécipitée PAEEN protéine isole pas conjointement avec n’importe lequel des protéines TOC-TIC (Figure 2, côté gauche) et confirme la spécificité de la purification de TAP-TOC159.

Figure 1 . Régime de la constructions et la méthode de purification d’affinité. (A). le 35S:NTAP-TOC159 construction, encodage PAEEN-TOC159 était stablement exprimé chez Arabidopsis thaliana. Plantes de contrôle négatif exprime la construction 35S:NTAP, codant le seul robinet-tag. B. le protocole de purification d’affinité sage étape se compose de membrane d’isolement et de solubilisation, IgG d’agarose immuno-purification, lavages, le clivage de protéase TEV et élution. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 . Purification d’affinité en tandem de la protéine TOC159. N-terminale TOC159 TAP-tag a été purifiée de NTAP-TOC15 : plantesArabidopsis ppi2 et robinet protéine purifiée à partir de plantes WT robinet a été utilisée comme contrôle négatif. Total de protéine solubilisées des extraits (T), protéines de la membrane = fraction de charge (L), écoulement à travers (FT), premier et dernier lavage fractions (W1 et W6) et 10 % de l’éluat TEV ont été analysés par Western Blot. La membrane a été sondée avec les anticorps contre TOC159 (AT4G02510), TOC75 (AT3G46740), TOC33 (AT1G02280), KOC1 (AT4G32250), TIC110 (AT1G06950) et FBN1A (AT4G04020). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table des tampons
Tampon de couplage	NaHCO3 Ajuster au pH 8,5 ajuster le pH avec 0,1 M Na2CO3	100 mM
Tampon de blocage	Tris-HCl Ajuster le pH 8 avec HCl.	100 mM
Tampon PBS	Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl Ajuster le pH 7,3 avec HCl.	4.3 mM 1,4 mM 137 2.7
NaCl tampon de couplage	Tampon de couplage NaCl	1 M
2 x tampon de meulage	Tris-HCl, pH 7.5 avec HCl. NaCl NaF PMSF Cocktail d’inhibiteur de la protéase de plantes	100 mM 200 mM 5 mM 1 mM 0,20 %
4 x solution de solubilisation	Glycérol Triton-X100	40 % 3 %
Tampon A	2 x tampon de meulage 1 x tampon de meulage 4 x solution de solubilisation	100 ml 50 ml 25 ml 25 %
Élution de TEV tampon	Tris-HCl, pH 8 avec HCl EDTA, pH 8 avec HCl NaCl Glycérol Triton-X100 TNT	50 mM 0,5 mM 100 mM 10 % 0,75 % 1 mM
2 x chargement de SDS-PAGE tampon	Tris-HCl pH 6,8 avec HCl SDS Glycérol Bleu de bromophénol TNT	0,1 M 4 % 20 % 0,20 % 0,2 M

Le tableau 1. Recettes de tampon.

Discussion

Nous avons démontré qu’une seule étape de purification de robinet tag est une méthode spécifique et efficace pour la purification de l’Arabidopsis TOC-TIC complexe. Bien que la balise de robinet permettrait aux deux étapes de purification successives (IgG-suivie de la calmoduline purification d’affinité après clivage protéase TEV), nous croyons que, dans de nombreux cas, la première étape de l’affinité suivie par protéase TEV sera suffisante. Notre objectif, TOC159, est peu abondante et l’inclusion de la deuxième étape de la calmoduline-affinité excessivement réduit le rendement de protéine qui était la principale raison pour l’exclure de notre présent protocole. Le TEV-élution en soi est une étape de purification très spécifique et douce qui sortira seulement la cible TAP-tag ainsi que de partenaires d’interaction associés tandis que contaminer les protéines coller non spécifique à la résine d’IgG y restera. Ainsi, en combinaison avec l’étape IgG-affinité, l’élution de TEV se traduit par une purification suffisamment efficace pour nos et probablement plusieurs autres fins.

Il faut que la construction de TAP-tag est pleinement fonctionnelle in vivo. TAP-tagging pourrait avoir des effets potentiellement délétères sur l’activité de la protéine, de stabilité ou de localisation. TOC159 se compose de trois domaines, le domaine acide N-terminal, la centrale du domaine liant le GTP et domaine C-terminal membrane, qui ancre TOC159 dans le de membrane externe du chloroplaste². Pour éviter toute interférence avec l’insertion de la membrane, nous fusionnés avec la balise de robinet à l’extrémité N-terminale de TOC159. La fusion à l’extrémité N-terminale est plutôt l’exception que la règle. Beaucoup de protéines contiennent des informations de ciblage N-terminale et devrait par conséquent par étiqueté à l’extrémité C-terminale. On assure que TOC159 est fonctionnelle in vivo par complémentation du mutant ppi2 (un mutant albinos manque TOC159) avec robinet-TOC159. Le sauvetage du vert, phénotype sauvage a indiqué que TAP-TOC159 était fonctionnelle¹⁵.

Le protocole de purification servait à identifier de nouveaux partenaires d’interaction de TOC159, qui comprenait KOC1 et TIC56^10,11. Au total, environ 30 protéines étaient associés avec le complexe, ce qui suggère que l’interaction nouvelle partenaires seront isolés et caractérisés dans un proche avenir. Alors que nous vous recommandons le robinet-tag pour la purification de complexe, nous tenons encore à souligner que les versions supplémentaires à celle présentée ici existent et peuvent être très utiles pour certaines applications.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaHCO3	PanReac  ; AppliChem	A0384
Tris	Biosolve	0020092391BS
Na2HPO4	Sigma	S7909
KH2PO4	PanReac  ; AppliChem	A2946
NaCl	PanReac  ; AppliChem	A2942
NaF	Sigma	S1509	Toxique
PMSF	PanReac  ; AppliChem	A0999	Cocktail
d’inhibiteurs de protéase végétale	Sigma	P9599
Glycérol	PanReac  ; AppliChem	A0970
Triton X100	Roche	10789704001
Glycine	PanReac  ; AppliChem	A1067
EDTA	Carl Roth	8043
Dithiothreitol (DTT)	PanReac  ; AppliChem	A1101
FDS	PanReac  ; AppliChem	A0675
Bleu de bromophénol	Sigma	B0126
HCl VWR		20252-290
Saccharose	PanReac  ; AppliChem	A3935
Murashige et Skoog milieu avec vitamines	Duchefa Biochemie	M0222
Phytoagar	Duchefa Biochemie	P1003
Plaque de Pétri	Greiner Bio-one	639102
1,5 mL tubes microfuge	Sarstedt	72.706
Éthanol	Fisher chimique	E/0600DF/15
Papier filtre  ;	Whatman	10311804
Ruban chirurgical	3M	1530-1
Billes d’agarose activées par CNBr (sépharose 4B)	GE Healthcare	17-0430-01
Filtre en verre fritté	DURAN	2515703
Tube à centrifuger 50 mL	TPP	91050
Immunoglobuline G purifiée (HsIgG)	MP Biomedicals	855908
Agitateur rotatif	IKA	4016000
NaN3 (azoture de sodium)	Sigma	71290	Matériau toxique
à filtration rapide (Miracloth)	Merk-Millipore	475855
Ultracentrifube XNP-80	Beckman Coulter	A99839
Rotor SW 32 Ti	Beckman Coulter	369650
Tubes à ultracentrifuger	Beckman Coulter	326823
Homogénéisateur en téflon en verre (Potter)	Wheaton	357426
Colonne de spin (Mobicol)	Mo Bi Tec	M1003
Filtre 35µ ; m pour colonne de centrifugation (Mobicol)	Mo Bi Tec	M513515
AcTEV	Invitrogen	12575-015
Évaporateur centrifuge (Speed Vac)	Eppendorf	5305000100
FBN1A(PGL35)	anticorps AgriSera	AS06 116	RRID :AB_2247012
Sand, Fontainebleau	VWR	27460.295