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Article de méthode

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

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DOI :

10.3791/58542

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18 janvier 2019

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1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.

Résumé

Protéinurie résulte de la rupture du filtre glomérulaire qui est composé de l’endothélium fenêtrée, membrane basale glomérulaire et podocytes avec leurs membranes de fente. La structure délicate du filtre glomérulaire, en particulier le diaphragme de fente, s’appuie sur l’interaction entre les protéines de surface de diverses cellules. Étudier ces protéines de surface de cellules a été jusqu'à présent limitée à des études in vitro ou l’analyse histologique. Nous présentons ici une biotinylation murine en vivo étiquetage méthode, ce qui permet l’étude des protéines de surface de cellules glomérulaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène d’une protéine d’intérêt. La détermination semi-quantitative de l’abondance de surface cellulaire glomérulaire est disponible avec cette nouvelle méthode et toutes les protéines accessibles à la perfusion de biotine et immunoprécipitation peut être étudiée. En outre, isolement des glomérules avec ou sans biotinylation permet davantage l’analyse de RNA glomérulaire et protéines, mais aussi la culture primaire de cellules glomérulaire (c.-à-d., culture de cellules primaires podocyte).

Introduction

Une protéinurie est une caractéristique des lésions glomérulaires et accompagne habituellement les perturbations du filtre glomérulaire1. Le filtre glomérulaire est composé de l’endothélium fenêtrée et membrane basale glomérulaire podocytes. La délicate structure moléculaire du filtre glomérulaire est très dynamique et soumise à la protéine de surface cellulaire traite les deux reins sains et malades,2,3,4,5,6 . Endocytose des protéines de surface cellulaire s’est avéré essentiel pour la survie des podocytes7. Néphrine et podocalyxin sont des protéines transmembranaires exprimées sur les podocytes. Néphrine est l’épine dorsale de la membrane glomérulaire fente, tandis que podocalyxin est une sialoglycoprotéine revêtements le pied secondaire des podocytes8,9,10. Trafic d’endocytose a déjà démontré pour néphrine et podocalyxin3,11,12,13,14.

Au meilleur de nos connaissances, l’endocytose des protéines de surface cellulaire n’a pas encore été décrite dans les cellules endothéliales glomérulaires dans la littérature. Cependant, les cellules endothéliales expriment en général toutes les protéines nécessaires pour les différents types d’endocytose (c.-à-d. l’endocytose clathrine dépendant, dépendante du radeau)15,16. Donc, le trafic de surface de cellules endothéliales peut être étudié avec cette méthode en utilisant, par exemple, vasculaire endothéliale (VE)-cadhérine et la molécule d’adhérence intracellulaire (ICAM-2) comme une cellule de surface protéine marqueur pour les cellules endothéliales glomérulaire17 .

Malheureusement, il n’y a aucun modèle précis in vitro pour le filtre glomérulaire trois couches délicat dans quelle cellule traite de la protéine de surface peut être étudiée. L’objectif de cette méthode est donc d’étudier protéine glomérulaire traite en vivo. En outre, ce protocole contient des informations sur la façon d’isoler les glomérules, permettant ainsi des analyses glomérulaire ARN, protéines ou cellules plus loin. Un isolement glomérulaire similaire techniques ont été décrites par différents groupes18,19.

Auparavant, nous et autres avons utilisé ex vivo marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire par biotinylation2,3,4,20,21. Toutefois, cette méthode ex vivo , glomérules isolés ont été exposés à des contraintes mécaniques, qui peuvent influer sur le trafic endocytose. Alternativement, l’immunofluorescence marquage des protéines de surface de cellules glomérulaires a largement été utilisé dans la littérature2,20,22. Avec cette méthode, toutefois, seul un petit nombre de protéines peut être analysé dans une diapositive et analyse quantitative d’images d’immunofluorescence est souvent difficile.

Cette méthode novatrice en vivo propose un outil fiable pour étudier les cellules glomérulaires protéine de surface abondance et traite avec précision en sains et malades reins, et il peut être utilisé comme un ajout aux tests d’immunofluorescence.

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Protocole

Souris ont été obtenues comme une race interne de l’établissement de soins animaux locaux ou des laboratoires de Janvier en France. Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour soins et Use of Laboratory Animals (US National instituts de santé Publication n ° 85-23, révisée en 1996). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les autorisations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l’état LANUV AZ:84 numéro de référence-02.04. 2016.A435).

1. préparation des Instruments, des Solutions et équipements

  1. Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate, additionnée de 1 mM chlorure de magnésium (MgCl2) et le chlorure de calcium (CaCl2) 0,1 mM (PBSCM) et la filtrer à travers un filtre stérile.
  2. Préparer 5 mL de PBSCM stérile par souris pour perfusion et placez-le sur la glace.
  3. Pour chaque souris, préparer 5 mL de PBSCM stérile additionné de biotine de 0,5 mg/mL.
  4. Pour chaque souris, préparer les 5 mL de PBSCM stérile et ajouter 0. 8 x 108 billes magnétiques (e.g., 200 µL d’une solution de perles/mL8 4 x 10, sans prétraitement) pour embolisation des glomérules. Préparer cette solution sous le banc de culture cellulaire pour garder les billes magnétiques dans l’original un tube stérile. Placez cette solution sur la glace.
  5. Préparer une solution de refroidissement en ajoutant glycine 100 mM à PBSCM (5 mL / souris) et le maintenir sur la glace.
  6. Préparer une solution de collagénase (0.378 U/mL collagénase A en PBSCM stérile). Par souris, pipetter, dans un tube de 2 mL, 1 mL de la solution de collagénase et placez-le sur la glace.
  7. Pour laver, préparer PBSCM stérile (voir étape 1.1) dans 50 mL de tube et placez-le sur la glace.
  8. Une perfusion, utiliser une seringue avec un débit de 2,0 mL/mn.
  9. Préparez une seringue de 10 mL avec une aiguille de 21G. Placez la pointe de l’aiguille dans un cathéter long de 20 à 30 cm (diamètre intérieur, ID = 0,58 mm). Raccorder le cathéter (ID 0,58 mm) avec un cathéter court de 10 cm (ID 0. 28 mm) et couper l’extrémité du cathéter plus petit oblique pour une insertion facile dans l’aorte de souris.
  10. Pour les procédures de ligature pendant la chirurgie, couper les trois fils de soie de 5-7 cm (4-0, 6-0) par souris.
  11. Pour la chirurgie, préparer 3 pinces chirurgicales, 2 ciseaux chirurgicaux, 2 pinces, 2 pinces fines, 1 ciseaux fine et écouvillons. Préparer l’anesthésie (p. ex., anesthésie intrapéritonéale kétamine 100 mg/kg de poids corporel et de xylazine 5 mg/kg de poids corporel).
  12. Pour l’isolation des glomérules des deux reins, utiliser une passoire de cellule de 100 µm, deux tubes de 50 ml et un receveur de l’aimant.
  13. Préparer les CHAPS tampon de lyse : 20 mM (3-[(3-cholamidopropyl)) diméthylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS) ; 20 mM Tris (hydroxyméthyl)-aminomethan (Tris) pH 7,5 ; 50 mM sodiumchorlide (NaCl) ; 50 mM sodiumfluoride (NaF) ; 15 mM Na4P2O7; pH de 0,1 mM Tétraacétique (EDTA) l’acide 8.0 ; sodiumorthovanadate 2 mM ; et 2 mM adenosinetriphosphat (ATP).
  14. Cool centrifugeuses à 4 ° C.

2. chirurgie sous le Microscope

  1. Anesthésier la souris (par exemple, avec la kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale, reportez-vous à l’étape 1.11). Effectuez le test d’orteil-pincée pour confirmer une anesthésie appropriée.
  2. Désinfecter la partie ventrale de la souris avec de l’isopropanol 70 %.
  3. Effectuer une coupe médiane à travers la peau du bassin au sternum et retirez la peau de l’aponévrose abdominale à l’aide de la pince à épiler. Couper la peau des deux côtés dans le milieu de l’abdomen avec des ciseaux chirurgicaux.
  4. Changer les outils chirurgicaux. Appliquer une coupe médiane de xiphoid à la vessie à travers la couche de muscles abdominaux et les diviser en quatre quadrants à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Fixer le côté supérieur de deux pinces vers le cou de la souris avec deux pinces chirurgicales.
    Remarque : L’abdomen est maintenant ouvert.
  5. Mettre les organes viscéraux côté avec un écouvillon stérile et couper le ligament hépatique-phrénique avec des ciseaux.
  6. Préparer une ligature (avec un fil en soie 4-0, 6-0) autour de l’aorte proximale de l’artère rénale sur la hauteur de la glande surrénale avec deux pinces fines. Serrer la ligature aorte proximale pour l’abolition de la circulation sanguine avec des pincettes.
  7. Libérer l’aorte distale du fascia, matières grasses et d’autres tissus et préparer une ligature autour de l’artère hépatique/mésentérique crâniale de l’artère rénale à l’aide de fines pinces chirurgicales.
  8. Préparer une ligature (avec un fil en soie 4-0, 6-0) autour de l’aorte distale de l’artère rénale et la veine cave supérieure et l’aorte de serrage à la hauteur de la bifurcation.
  9. Couper un petit trou dans l’aorte distale de l’artère rénale afin que le trou soit la moitié du diamètre de l’aorte. Mettre le cathéter dans l’aorte et le fixer avec la ligature préparée.
    Attention : Évitez les bulles dans le système de perfusion pour éviter une embolie.
  10. Commencer la perfusion avec le PBSCM glacée à un débit de 2 mL/min.
  11. Découper un trou dans la veine rénale au niveau de l’artère rénale avec des ciseaux chirurgicaux, puis serrez la ligature autour des artères mésentériques et hépatiques.
    Remarque : Les reins devraient tourner pâles après le début de la perfusion.

3. in Vivo Biotinylation

  1. Changement la seringue bulles de PBSCM glacé additionné de biotine de 0,5 mg/mL pour la surface étiquetage et perfuse les reins avec 5 mL à un débit de 2 mL/min.
    NOTE : Mélanger les solutions PBSCM (p. ex., en tournant les tubes de 50 mL) doucement pour éviter la formation de bulles dans la solution. Après l’aspiration de la solution dans la seringue, évacuer les bulles ou l’air de la seringue. Utiliser une canule supplémentaire (21G) sur la seringue pour remplir l’espace dans la canule qui est connectée au système de cathéter. Enfin, tenir la seringue dans la canule avec le cathéter sans bulles.
  2. Remplacez la seringue sans bulles PBSCM glacé additionné de glycine 100 mM à étancher les glomérules et perfuse avec 5 mL à un débit de 2 mL/min.
  3. Changer la seringue bulles de PBSCM glacé additionné de 200 μL perles magnétiques/mL et perfuse les reins à 2 mL/min.
    Remarque : Sur la surface du rein, embolisation des glomérules avec perles magnétiques brunes seront visible.

4. isolement des glomérules de deux reins

  1. Enlever les reins à l’hile et la capsule. Placez les reins sur glace dans 15 mL de PBSCM dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm. Euthanasier la souris avec dislocation cervicale sous anesthésie après la récolte les reins. Les procédures de chirurgie et de la perfusion durent environ 20-22 min.
  2. Dépecée reins le plus petit possible avec une nouvelle lame à double tranchant. Déplacer le tissu dans un tube de 2 mL avec 1 mL de collagénase A (voir l’étape 1.6) et faire digérer à 37 ° C pendant 30 min. Avant et après la digestion, mélanger doucement avec une 1000 μL couper la pipette.
  3. Rincer les tissus digérés à travers un tamis de cellule 100 μm à l’aide de PBSCM glacée. Utilisez le grattoir de cellules pour l’émincer la fosse de tissu restant la crépine de la cellule et le rincer à glacée PBSCM par la suite pour un volume total de 50 mL.
  4. Centrifuger la suspension à 4 ° C x 500 g pour 5 min. Retirez le surnageant et resuspendre le culot avec un peu moins de 1,5 mL de PBSCM glacée tout en vortex le culot. Ensuite, mettre la suspension glomérulaire dans un nouveau tube de 2 mL.

5. lavage

  1. Le récupérateur de l’aimant permet de tirer les glomérules de côté. Attendre 1 min avant que les glomérules ont déménagé vers l’aimant.
  2. Retirez le surnageant avec une pipette de 1000 μL tandis que le tube 2 mL reste dans le bac à aimant. Pendant le lavage de première et deuxième étapes (voir l’étape 5.3), 250 μL de surnageant reste dans le tube pour éviter la perte des glomérules. Effectuez cette procédure rapidement afin d’éviter de laisser les structures tubulaires à couler au fond du tube.
    Remarque : La procédure de nettoyage dureront plus longtemps dans le cas contraire.
  3. Retirer le tube 2 mL de catcher aimant et ajouter 1 mL de PBSCM, pipette de haut en bas (très important), puis vortexer.
  4. Remettre le tube dans le bac à aimant et recommencer à 5.2.
  5. Répétez les étapes de lavage jusqu'à ce que la pureté des glomérules a atteint 90 %. Pour ce faire, examinez une aliquote représentative du surnageant sous un microscope (X 40-100).
    NOTE : Glomérules apparaîtra en tant que structures rondes contenant des billes magnétiques bruns. Structures allongées sont des fragments tubulaires et billes magnétiques libres apparaissent comme des points ronds bruns. Débris cellulaires peuvent apparaître comme des structures volumineuses.
  6. Si la pureté est atteinte, estimer le nombre de glomérules en dissolvant les glomérules dans 1 mL de PBSCM. Après avoir mélangé, prélever une partie aliquote de 10 μL et compter les glomérules sous le microscope. Calculer le nombre de glomérules avec l’équation suivante : finale nombre de glomérules = nombre de glomérules dans 10 μL aliquot x 100.
  7. Réussite de l’isolement des glomérules conduit à une gamme de 10 000-40 000 glomérules.

6. protein Extraction et immunoprécipitation (IP)

  1. Glomérules virés par centrifugation à 4 ° C à 6800 g pendant 5 min. Retirez le surnageant tout en utilisant un capteur aimant et resuspendre le culot dans le tampon de lyse glacee (e.g., 30 000 glomérules dans 300 μl ; CHAPS, voir étape 1.11). Homogénéiser les échantillons avec un homogénéisateur de tissus à haute vitesse pendant 30 s et leur lyse sur glace pendant 30 min.
  2. Enlever la matière insoluble par centrifugation à 15 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. Pipeter le surnageant qui contient la cellule lysate dans un nouveau tube de 1,5 mL. Jeter le culot.
  3. Mesurer la concentration des protéines du liquide surnageant à l’aide d’un bicinchoninic (BCA)-base de méthode suivant les instructions du fabricant. Une lyse réussie des 30 000 glomérules cède à une quantité de protéine glomérulaire de 700-1000 µg/mL. S’adapter à des quantités égales de protéines avec tampon de lyse.
  4. Prélever une partie aliquote de 10 % du volume total pour glomérulaire lysat et ajouter 2 x Laemmli + dithiothreithol (TNT) avant l’incubation pendant 5 min à 95 ° C.
  5. Pour la période d’enquête, incuber le reste du lysat de streptavidine agarose perles durant la nuit à 4 ° C dans un agitateur généraux.
  6. Centrifuger l’agarose perles à 1000 x g pendant 3 min à 4 ° C, retirez le surnageant et ajouter 800 μL de tampon de lyse pour laver les perles pour la liaison aux protéines non spécifiques.
  7. Répéter le lavage 3 fois et éliminer le surnageant complètement.
  8. Ajouter 30 μL de 2 x Laemmli + TNT et incuber à 95 ° C pendant 5 min.
  9. Charger le lysat et sondes IP sur une SDD 10 % gel et exécutent le gel SDS à 70 V pendant 30 min, puis à 20 mA par gel pour 1,5 h. blot par la suite, le gel pendant 2 h à 200 mA sur une membrane de nitrocellulose.
  10. Bloquer la membrane de nitrocellulose, une nuit à 4 ° C, avec 5 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon de lavage.
  11. Incuber la membrane avec l’anticorps d’intérêt durant la nuit à 4 ° C. Laver avec tampon 3 fois pendant 5 min sur un agitateur de lavage et incuber la membrane avec l’anticorps secondaire HRP-le tag pendant 1 h à température ambiante. Répétez l’étape de lavage.
  12. Visualiser le lysat et immunoprécipitation des sondes sur la membrane au moyen d’un agent de chimiluminescence super-résolution avec une caméra CCD.

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Résultats

Pour isoler des glomérules avec précision, il est nécessaire de perfuse reins murins avec PBSCM tout d’abord. Une perfusion de PBSCM tourne reins pâles (Figure 1A). Embolisation des glomérules avec billes magnétiques seront visible comme des points bruns sur la surface du rein (Figure 1B). Isolement des glomérules avec le récupérateur de l’aimant peut montrer la contamination avec des tubuli réna...

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Discussion

La méthode présentée permet la réussite de l’isolement des glomérules d’enquêter glomérulaire ARN ou protéine. En outre, les cultures primaires de cellules glomérulaires peuvent être effectuées depuis les glomérules isolés. Si biotine est appliqué avant l’isolement glomérulaire, marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire peut être effectuée. Avec cette méthode, in vivo des cellules glomérulaires traite des protéine de surface peut être étudiée, et la détermination semi-quantitative de l’abondance...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Blanka Duvnjak pour son aide technique exceptionnel. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 à M.W. et QU280/3-1 à Q.I. Le bailleur de fonds n’avait aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse des données, décision de publier et préparation du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Motic SMZ168 BL MicroscopeMoticSMZ168BLpour la chirurgie
KL1500LCDMicroscopie Pulch et Lorenz150500lumière pour la chirurgie de la souris
Rompun (Xylazin) 2 %BayerPZN :01320422anesthésie
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rciseaux fins, pour couper dans l’aorte
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rpour la coupe abdominale
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rpour la chirurgie jusqu’à l’ouverture de l’abdomen
Prä ; parierklemmeAesculapBJ008Rpour la chirurgie  ;
SeraflexSerag WiessnerIC108000fil de soie
Kétamine 10 %AnesthésieMedistar
Rompun (Xylazine) 2 %BayerAnesthésie
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Cathéter
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,58 mm OD 0,96 mmCathéterPortex800/100/200
Appareil Harvard 11 PlusAppareil Harvard70-2209pousse-seringue
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotineThermo Scientific21335biotine
Dynabeads Untouched Mouse T-cellsInvitrogen11413Dpour emboliser les glomérules
Collagénase ARoche10103578001pour digérer le tissu rénal
DynaMag-2Invitrogen123.21DAttrape-aimants
100µ ; Colorateur de cellules mGreiner-bio542000pour l’isolement glomérulaire
Axiovert 40 CFLZeissnon disponiblepour confirmer la pureté glomérulaire
TissueRuptorQuiagen9002755Homogénéisateur de tissus
CHAPSSigma-AldrichC3023pour tampon de lyse
Tris-HCLSigma-AldrichT5941pour tampon
Produits chimiques NaClVWR27810295pour tampon de lyse
NaFSigma-Aldrich201154pour tampon de lyse
EDTASigma-AldrichE5134pour tampon de lyse
ATPSigma-Aldrich34369-07-8pour tampon de lyse
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Suivez les instructions du fabricant
ProgenGP-N2pour Westernblot
Anticorps anti-podocalyxineR& D SystemsAF15556-SPpour la
résine d’agarose de streptavarineThermo Scientific20347pour l’immunoprécipitation
Protéine A sépharose CL-4BGE Healthcare17096303pour l’immunoprécipitation
Anticorps polyclonal anti-p57 de lapinSCBTsc-8298pour l’immunohistochimie
Anticorps monoclonal anti-bêta-actine de souris, clone AC-74Sigma-AldrichA2228Western blot contrôle de charge
anti-p44/42signalisation cellulaire4695pour westernblot
Pierce Streptivarine haute sensibilité-HRPThermo Scientific21130polyclonale westernblot
ICAM-2 anticorpsR& D SystemsAF774pour souris polyclonale westernblot
anti-VE-cadhérineR& D SystemsAF1002pour westernblot
de la souris de lyse anticorps anti-podocalyxine de chèvre polyclonale Westernblot lapin pour souris

Références

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