Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Eva Königshausen; Sebastian A. Potthoff; Raphael Haase; Catherine Meyer-Schwesinger; Ernest Kaufmann; L. Christian Rump; Johannes Stegbauer; Lorenz Sellin; Ivo Quack; Magdalena Woznowski

doi:10.3791/58542

Article de méthode

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

DOI :

10.3791/58542

⸱

18 janvier 2019

Eva Königshausen¹ , Sebastian A. Potthoff¹ , Raphael Haase¹ , Catherine Meyer-Schwesinger² , Ernest Kaufmann¹ , L. Christian Rump¹ , Johannes Stegbauer¹ , Lorenz Sellin¹ , Ivo Quack¹ , Magdalena Woznowski¹

¹Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, ²Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour l’étiquetage des murins in vivo des protéines de surface de cellules glomérulaire avec de la biotine. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène de la protéine d’intérêt.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protéinurie résulte de la rupture du filtre glomérulaire qui est composé de l’endothélium fenêtrée, membrane basale glomérulaire et podocytes avec leurs membranes de fente. La structure délicate du filtre glomérulaire, en particulier le diaphragme de fente, s’appuie sur l’interaction entre les protéines de surface de diverses cellules. Étudier ces protéines de surface de cellules a été jusqu'à présent limitée à des études in vitro ou l’analyse histologique. Nous présentons ici une biotinylation murine en vivo étiquetage méthode, ce qui permet l’étude des protéines de surface de cellules glomérulaire dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Ce protocole contient des informations sur la façon de perfuse les reins de souris, isoler les glomérules et effectuer d’immunoprécipitation endogène d’une protéine d’intérêt. La détermination semi-quantitative de l’abondance de surface cellulaire glomérulaire est disponible avec cette nouvelle méthode et toutes les protéines accessibles à la perfusion de biotine et immunoprécipitation peut être étudiée. En outre, isolement des glomérules avec ou sans biotinylation permet davantage l’analyse de RNA glomérulaire et protéines, mais aussi la culture primaire de cellules glomérulaire (c.-à-d., culture de cellules primaires podocyte).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une protéinurie est une caractéristique des lésions glomérulaires et accompagne habituellement les perturbations du filtre glomérulaire¹. Le filtre glomérulaire est composé de l’endothélium fenêtrée et membrane basale glomérulaire podocytes. La délicate structure moléculaire du filtre glomérulaire est très dynamique et soumise à la protéine de surface cellulaire traite les deux reins sains et malades,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Endocytose des protéines de surface cellulaire s’est avéré essentiel pou....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Souris ont été obtenues comme une race interne de l’établissement de soins animaux locaux ou des laboratoires de Janvier en France. Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices énoncées dans le Guide pour soins et Use of Laboratory Animals (US National instituts de santé Publication n ° 85-23, révisée en 1996). Toutes les expériences animales ont été effectuées selon les autorisations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l’état LANUV AZ:84 numéro de référence-02.04. 2016.A435).

1. préparation des Instruments, des Solutions et équipements

Préparer 1 L de solution saline tamponnée au phosphate, additionn....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour isoler des glomérules avec précision, il est nécessaire de perfuse reins murins avec PBSCM tout d’abord. Une perfusion de PBSCM tourne reins pâles (Figure 1A). Embolisation des glomérules avec billes magnétiques seront visible comme des points bruns sur la surface du rein (Figure 1B). Isolement des glomérules avec le récupérateur de l’aimant peut montrer la contamination avec des tubuli réna.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La méthode présentée permet la réussite de l’isolement des glomérules d’enquêter glomérulaire ARN ou protéine. En outre, les cultures primaires de cellules glomérulaires peuvent être effectuées depuis les glomérules isolés. Si biotine est appliqué avant l’isolement glomérulaire, marquage des protéines de surface de cellules glomérulaire peut être effectuée. Avec cette méthode, in vivo des cellules glomérulaires traite des protéine de surface peut être étudiée, et la détermination semi-quantitative de l’abondance.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Blanka Duvnjak pour son aide technique exceptionnel. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 à M.W. et QU280/3-1 à Q.I. Le bailleur de fonds n’avait aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données, analyse des données, décision de publier et préparation du manuscrit.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Motic SMZ168 BL Microscope	Motic	SMZ168BL	pour la chirurgie
KL1500LCD	Microscopie Pulch et Lorenz	150500	lumière pour la chirurgie de la souris
Rompun (Xylazin) 2 %	Bayer	PZN :01320422	anesthésie
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	ciseaux fins, pour couper dans l’aorte
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	pour la coupe abdominale
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	pour la chirurgie jusqu’à l’ouverture de l’abdomen
Prä ; parierklemme	Aesculap	BJ008R	pour la chirurgie ;
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	fil de soie
Kétamine 10 %	Anesthésie	Medistar
Rompun (Xylazine) 2 %	Bayer		Anesthésie
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,28 mm OD 0,61 mm	Portex	800/100/100	Cathéter
Tube en polyéthylène à alésage fin ID 0,58 mm OD 0,96 mm	Cathéter	Portex	800/100/200
Appareil Harvard 11 Plus	Appareil Harvard	70-2209	pousse-seringue
EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotine	Thermo Scientific	21335	biotine
Dynabeads Untouched Mouse T-cells	Invitrogen	11413D	pour emboliser les glomérules
Collagénase A	Roche	10103578001	pour digérer le tissu rénal
DynaMag-2	Invitrogen	123.21D	Attrape-aimants
100µ ; Colorateur de cellules m	Greiner-bio	542000	pour l’isolement glomérulaire
Axiovert 40 CFL	Zeiss	non disponible	pour confirmer la pureté glomérulaire
TissueRuptor	Quiagen	9002755	Homogénéisateur de tissus
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023	pour tampon de lyse
Tris-HCL	Sigma-Aldrich	T5941	pour tampon
Produits chimiques NaCl	VWR	27810295	pour tampon de lyse
NaF	Sigma-Aldrich	201154	pour tampon de lyse
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134	pour tampon de lyse
ATP	Sigma-Aldrich	34369-07-8	pour tampon de lyse
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	Suivez les instructions du fabricant
	Progen	GP-N2	pour Westernblot
Anticorps anti-podocalyxine	R& D Systems	AF15556-SP	pour la
résine d’agarose de streptavarine	Thermo Scientific	20347	pour l’immunoprécipitation
Protéine A sépharose CL-4B	GE Healthcare	17096303	pour l’immunoprécipitation
Anticorps polyclonal anti-p57 de lapin	SCBT	sc-8298	pour l’immunohistochimie
Anticorps monoclonal anti-bêta-actine de souris, clone AC-74	Sigma-Aldrich	A2228	Western blot contrôle de charge
anti-p44/42	signalisation cellulaire	4695	pour westernblot
Pierce Streptivarine haute sensibilité-HRP	Thermo Scientific	21130	polyclonale westernblot
ICAM-2 anticorps	R& D Systems	AF774	pour souris polyclonale westernblot
anti-VE-cadhérine	R& D Systems	AF1002	pour westernblot

de la souris de lyse anticorps anti-podocalyxine de chèvre polyclonale Westernblot lapin pour souris

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin en....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Glomerular Isolation In Vivo Biotinylation Cell Surface Protein Labeling Kidney Perfusion Magnetic Bead Purification Glomerular Cell Surface Proteins Nephrin Podocalyxin Analysis Immunoprecipitation Method Protein Trafficking Study Primary Podocyte Culture

Isolement des glomérules et In Vivo , marquage des protéines de Surface de cellules glomérulaire

Dans cet article

Résumé

Résumé

Introduction

Protocole

Résultats

Discussion

Déclarations de divulgation

Remerciements

Matériaux

Références

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Articles connexes