Article de méthode

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

DOI :

10.3791/58545

⸱

4 juin 2019

 ,  ,  , 
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les techniques d'imagerie à base de fluorescence, combinées aux développements de la microscopie légère, ont révolutionné la façon dont les biologistes cellulaires mènent des études d'imagerie cellulaire vivante. Les méthodes de détection des ARN se sont considérablement développées depuis que les études séminales ont lié la localisation de l'ARNm spécifique au site à la régulation de l'expression génique. Les processus d'ARNm dynamique s'accompagnent désormais d'approches qui détectent les ARNm, couplées à des configurations de microscopie suffisamment rapides pour capturer la gamme dynamique du comportement moléculaire. La technologie de balise moléculaire est une approche basée sur l'hybridation capable de détecter directement les transcriptions endogènes dans les cellules vivantes. Les balises moléculaires sont en forme d'épingle à cheveux, étanchées à l'intérieur, un seul nucléotide discriminant les sondes d'acide nucléique, qui fluoresce seulement sur l'hybridation à une séquence cible unique. Lorsqu'ils sont couplés à la microscopie à fluorescence avancée et à la formation image à haute résolution, ils permettent d'effectuer un suivi spatial et temporel du mouvement intracellulaire des ARNM. Bien que cette technologie soit la seule méthode capable de détecter les transcriptions endogènes, les biologistes cellulaires n'ont pas encore pleinement adopté cette technologie en raison des difficultés dans la conception de telles sondes pour l'imagerie cellulaire vivante. Une nouvelle application logicielle, PinMol, permet une conception améliorée et rapide des sondes les mieux adaptées pour s'hybrider efficacement aux régions cibles de l'ARNm au sein d'une cellule vivante. En outre, l'acquisition d'images haute résolution et en temps réel et le logiciel actuel d'analyse d'images open source permettent une sortie de données affinée, ce qui permet une évaluation plus fine de la complexité qui sous-tend les processus dynamiques impliqués dans le cycle de vie de l'ARNm.

Nous présentons ici un protocole complet pour la conception et la livraison de balises moléculaires dans les chambres d'œufs Drosophila melanogaster. La détection et la visualisation directes et très spécifiques des ARNm maternels endogènes sont effectuées par microscopie confocale de disque tournant. Les données d'imagerie sont traitées et analysées à l'aide de la détection et du suivi d'objets dans le logiciel Icy afin d'obtenir des détails sur le mouvement dynamique des ARNM, qui sont transportés et localisés dans des régions spécialisées au sein de l'ovocyte.

Introduction

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Les études de biologie cellulaire qui visualisent des événements dynamiques avec la résolution spatiale et temporelle ont été rendues possibles par le développement des techniques d'imagerie cellulaire vivante basées sur la fluorescence. Actuellement, la visualisation in vivo d'ARNm est réalisée par des technologies qui sont basées sur des interactions aptamer-protéine d'ARN, fluorescence aptamer-induite d'ARN des colorants organiques et sonde d'acide nucléique annealing1,2, 3. Ils offrent tous une grande spécificité, sensibilité et rapport signal-arrière. Cependant, les approches centrées sur l'aptamer d'ARN exigent la manipulation génétique étendue, où un transgène est conçu pour exprimer un ARN avec des motifs structurels artificiels qui sont exigés pour la liaison de protéine ou organique de colorant. Par exemple, le système MS2/MCP exige la coexpression d'un transgène exprimant une construction d'ARN contenant plusieurs répétitions en tandem de la séquence de liaison pour la protéine bactériophage MS2 (MCP), et un autre transgène codant une protéine fluorescente fusionné à MCP4,5. L'ajout de tels motifs structurels secondaires à l'ARN, ainsi qu'une protéine voilonée étiquetée fluorescente, a soulevé des préoccupations que les processus d'ARN indigènes peuvent être affectés6. Une technologie qui répond à cette préoccupation et offre d'autres avantages uniques est l'approche à base d'acide nucléique, les balises moléculaires (MBs). Les MB permettent la détection multiplexe des ARNm endogènes, la discrimination des variations nucléotides simples, et la cinétique rapide de l'hybridation avec l'ARNm cible7,8. Les MB sont des sondes oligonucléotides qui restent dans un pli d'épingle à cheveux éteint avant de subir un changement de conformationnel fluorogénique une fois qu'ils s'hybrident à leurs cibles (Figure 1C)9. Plusieurs groupes ont réussi à utiliser les MB pour détecter à la fois les ARN non codants (microARN et lncRNAs)10,11,12,13, les rétrovirus d'ARN14 et les dynamiques ADN-protéines interactions15. Ils ont été utilisés avec succès pour l'imagerie dans divers organismes et tissus, tels que les embryons de poissons zèbres16, neurones13, tissu tumoral17, différenciant cardiomyocytes18, et Salmonella 19.

Nous décrivons ici l'approche de conception, de livraison et de détection des ARNm endogènes dans les chambres d'œufs D. melanogaster vivantes couplée à une configuration de microscopie qui est assez rapide pour capturer la gamme dynamique du transport moléculaire actif. La chambre d'oeuf séminocytrale de D. melanogaster a servi de système modèle multicellulaire idéal pour un large éventail d'études développementales, de la division des cellules souches germinées précoces et de l'expression des gènes maternels à la génération du plan corporel segmentaire20, 21. Les chambres d'oeufs sont facilement isolées, grandes et translucides, et capables de résister à des heures d'analyse ex vivo, ce qui les rend très propices aux expériences d'imagerie. Beaucoup de travail a porté sur la localisation asymétrique des transcriptions maternelles aux régions subcellulaires discrètes avant d'être activement traduites. En particulier, la localisation de l'ARNm oskar et sa traduction ultérieure au pôle postérieur de l'ovocyte doivent se produire d'une manière étroitement réglementée pour éviter un phénotype d'embryon bicaudal mortel22. L'ARNm oskar est transcrit dans les 15 cellules germinales, appelées cellules d'infirmière, et activement transporté par des ponts cytoplasmiques, appelés canaux d'anneau, dans l'oocyte, la cellule germinale qui devient l'œuf mûr et est finalement fécondé (Figure 1A ). La quantité considérable d'informations déjà disponibles concernant le recrutement dynamique et l'échange de facteurs protéiques à destination et en provenance du mRNP oskar, ainsi que son voyage intracellulaire à longue portée, font d'oskar un candidat privilégié pour étudier les nombreux processus du cycle de vie de l'ARNm. Les MB ont joué un rôle déterminant dans la révélation de détails sur le processus de localisation de l'ARNm et le déchiffrement de la régulation et de la fonction des facteurs protéiques qui contrôlent le transport de l'ARNm pendant l'oogenèse de Drosophila. En particulier, en micro-injectant des MB dans les cellules d'infirmières et en effectuant des expériences d'imagerie cellulaire en direct, le suivi des ARNm endogènes est possible8,23.

La feuille de route présentée ici offre les étapes d'un processus complet, de la réalisation d'une expérience d'imagerie cellulaire en direct à l'aide de MBs, l'acquisition de données d'imagerie, à l'exécution de l'analyse des données pour suivre l'ARNm endogène dans son environnement cellulaire natif. Les étapes peuvent être modifiées et optimisées pour répondre aux besoins des chercheurs travaillant avec d'autres tissus/types de cellules dans leur propre laboratoire.

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Protocole

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1. Conception de MBs pour l'imagerie cellulaire en direct

  1. Pliez la séquence d'ARN cible pour prédire la structure secondaire de la cible de l'ARNm à l'aide de la « forme d'ARN » du serveur mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. Coller/télécharger la séquence cible en format FASTA, sélectionner 5 ou 10% de sous-optimalité (structures avec une énergie libre de pliage dans 5 ou 10% de la valeur MFE, respectivement), et ajuster le nombre maximum de pliages calculés en conséquence (par exemple plus grand pour 10% sous-optimalité).
      Remarque : L'inclusion de structures secondaires sous-optimales lors de la conception des MB permet d'identifier des régions à l'intérieur de l'ARNm cible qui peuvent être plus souples ou plus rigides que prévu pour la structure d'énergie libre minimale (MFE) seule, ce qui améliore le conception globale des MB adaptés à l'imagerie cellulaire vivante.
    2. Sélectionnez un « travail immédiat » pour les cibles d'ARNm de 800 nucléotides (nt), ou un « travail de lot » pour les longueurs d'ARNm entre 801 et 8 000 nt. Enregistrer le fichier « ss-count » comme fichier texte simple.
  2. Utilisez le fichier "ss-count" obtenu à l'étape 1.1 comme entrée pour le programme PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) avec les paramètres souhaités, pour concevoir plusieurs MBs pour la cible de l'ARNm (voir les tutoriels décrivant l'utilisation du programme PinMol 24 à https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. Déterminer la spécificité des MB sélectionnés en effectuant l'analyse BLAST : utilisez le « blastn » avec la base de données appropriée (p. ex. pour les MB spécifiques à l'ARNm oskar utilisent la base de données « refseq-rna » et l'organisme Melanogaster Drosophila).
    2. Identifiez toute expression spécifique aux tissus de la cible de l'ARNm (par exemple pour l'ARNm oskar Flybase-gt; High-Throughput Expression Data -gt; FlyAtlas Anatomy Microarray ou modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) et comparez avec tous les coups positifs BLAST. Éliminer les sondes qui montrent une homologie croisée avec d'autres ARNm qui sont également exprimées dans le tissu/cellule d'intérêt.
  3. Sélectionnez la paire de fluorophore et de quencher appropriée pour la microscopie disponible pour effectuer l'imagerie cellulaire en direct (p. ex. Cy5/BHQ2)25.

2. MB Synthèse, Purification et Caractérisation

  1. Utiliser la synthèse et la purification internes comme décrit précédemment7, ou les services de fournisseurs commerciaux, pour synthétiser et purifier un à cinq MB (voir note ci-dessus), en utilisant le schéma d'étiquetage suivant: [5'(Fluorophore)-(C3 ou C6 linker)-(2'-O -séquence MB méthyle)-(Quencher)3']. Purifie les MB en utilisant la phase inverse HPLC, en interne ou en utilisant les services du fournisseur commercial.
    REMARQUE: Les phosphoramidites utilisées pour la synthèse automatisée de sonde doivent avoir la modification de 2'- O-méthyle ribonucleotide. On peut également utiliser des chimères d'acide nucléique en alternance (LNA) et 2'-O-méthyl modifications pour augmenter la stabilité d'un hybride entre un MO plus court et son ARNm cible26.
  2. Synthétiser les oligonucléotides d'ADN qui correspondent à la séquence de la région d'ARN ciblée et sont donc complémentaires à la région de la sonde des MB, pour une utilisation dans la caractérisation in vitro (voir les étapes 2.3 à 2.5; au-dessus de la note). Maximiser l'hybridation du MB avec l'imitation de la cible DE l'ADN-oligonucléotide, en incluant à chaque extrémité de la cible d'ADN quatre nucléotides supplémentaires, comme trouvé dans la séquence d'ARNm cible.
    Note : Une caractérisation plus rigoureuse de l'efficacité du MB pour détecter la séquence ciblée peut être effectuée à l'aide de cibles d'ARN synthétisées in vitro au lieu d'oligonucléotides d'ADN complémentaires8.
  3. Effectuez la dénaturation thermique du MB seul, mesurez sa température de fusion (Tm), et confirmez que le MB assume la forme désirée d'épingle à cheveux à la température physiologique. Nous avons observé des valeurs Tm entre 60 et 90 oC.
  4. Effectuer la dénaturation thermique du MB en présence de la cible d'oligonucléotide d'ADN et mesurer le Tm de l'hybride de cible d'ADN MB:DNA, comme décrit précédemment7. Un Tm entre 55 et 60 oC est souhaité pour l'hybride MB:DNA.
  5. Effectuer des réactions d'hybridation in vitro avec la cible correspondante d'oligonucléotide d'ADN, et déterminer l'efficacité de la formation hybride MB:ADN à la température physiologique, comme précédemment décrit7. La cinétique d'hybridation rapide avec l'imitation de cible d'ADN est désirée, cependant les MBs qui ne montrent pas l'efficacité élevée d'hybridation avec des cibles d'ADN peuvent avoir une meilleure exécution avec l'ARNm cible in vitro et/ou in vivo.

3. Dissection et préparation des chambres d'oeufs individuelles pour la microinjection

  1. Nourrissez les femelles nouvellement écloses et accouplées pendant 2-3 jours avec de la pâte de levure fraîche.
  2. Anesthésiez les mouches sur un tampon CO2 et, à l'aide de fines pinces (Dumont #5), transfèrez 1-2 femelles dans une goutte d'huile de halocarbone 700 sur un bordereau de couverture en verre.
  3. À l'aide d'une pince à épiler, orienter la mouche avec le côté dorsal vers le haut sous un stéréomicroscope. Disséquer l'abdomen féminin en faisant une petite incision à l'extrémité postérieure et presser doucement la paire d'ovaires dans l'huile.
  4. Explantez les ovaires sur une goutte d'huile sur un nouveau bordereau. Tenez délicatement un ovaire avec une pince à épiler tout en pinçant les plus jeunes stades de l'ovariole avec l'autre pince. l'ARNm oskar est activement localisé à et après la mi-oogenèse (étapes 'gt; 7), et les chambres d'oeufs plus jeunes (étapes 'lt; 7) sont plus difficiles à injecter et ne survivent pas aussi longtemps. Faites glisser lentement sur le bordereau de couverture (avec un mouvement vers le bas) jusqu'à ce que les ovarioles individuels ou les chambres d'oeufs soient isolés et alignés verticalement. Séparer davantage les chambres d'œufs simples en déplaçant les stades indésirables de la chaîne d'œufs ovariole.
    REMARQUE: Assurez-vous que les chambres d'œufs taquinées individuellement ne flottent pas dans l'huile, et qu'elles adhèrent à la feuille de couverture. Ceci est important à la fois pour la microinjection réussie et l'acquisition d'images.

4. Microinjection de MBs dans les cellules d'infirmière des chambres d'oeufs

  1. Préparer la solution MB, à l'aide d'une balise moléculaire (p. ex. osk2216Cy5), ou d'un mélange de deux MB qui ciblent différents ARNM et qui sont étiquetés avec des fluorophores spectrally distincts (p. ex. osk2216Cy5 et drongo111Cy3). Utilisez une concentration de 200-300 ng/L par Mo dans HybBuffer (50 mM Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 mM MgCl2 et 100 mM NaCl). Pour un cocktail de quatre MB étiquetés avec le même fluorophore qui ciblent le même ARNm à 200 ng/L chacun dans HybBuffer (p. ex. osk82, osk1236, osk2216). Faites tourner la solution MB immédiatement avant de charger l'aiguille pour la microinjection.
  2. Sélectionnez l'objectif. Un objectif d'huile 40x est recommandé pour trouver une chambre d'oeuf appropriée et pour effectuer la microinjection.
  3. Montez la couverture avec la chambre d'oeuf disséquée sur l'étape de microscope. Amener l'objectif dans la position de mise au point et identifier une chambre d'oeuf à un stade de développement moyen à tardif, qui est correctement orientée pour la microinjection (c.-à-d., avec l'axe AàP perpendiculaire à la pointe de l'aiguille pour permettre une injection facile au sein d'une infirmière cellulaire proximale à l'ovocyte).
  4. Chargez une aiguille (commerciale ou préparée dans la maison27) avec une solution de 1 ML(voir l'étape 4.1) et connectez-la au micro-injecteur. Pour les microinjections dans les chambres d'oeufs De. melanogaster, orientez l'aiguille (voir Tableau des matériaux) à un angle de 45 degrés au stade du microscope (p. ex. 30 degrés) pour éviter de perforer plusieurs cellules d'infirmières.
  5. Mettre en place l'injecteur avec une pression d'injection de 500-1000 hPa et une pression de compensation de 100-250 hPa (voir Tableau des matériaux).
  6. Déplacez lentement la scène pour apporter dans le champ de vision une zone de la goutte d'huile vide de chambres d'oeufs.
  7. À l'aide du joystick micromanipulateur, abaissez doucement l'aiguille dans la goutte d'huile et mettez son bout en évidence vers la périphérie du champ de vision.
  8. Effectuez une fonction « propre » pour retirer l'air de la pointe de l'aiguille et pour s'assurer qu'il y a un écoulement de l'aiguille.
  9. Apportez l'aiguille à la position de la maison et concentrez-vous sur la chambre d'oeuf à micro-injecter, puis ramenez l'aiguille au point et placez-la près du bord de la chambre d'oeuf.
  10. Effectuer un ajustement fin de la position Z de l'objectif de telle sorte que la membrane séparant les cellules folliculaires des cellules d'infirmière est au point.
  11. Insérez l'aiguille dans une cellule d'infirmière et effectuez l'injection pendant 2-5 s.
  12. Retirez délicatement l'aiguille et rétractez-la en position d'accueil.
  13. Modifier l'objectif du grossissement souhaité pour l'acquisition d'images (60-63x ou 100x), se concentrer sur la chambre d'oeufs, et commencer l'acquisition.

5. Acquisition de données à l'aide d'une configuration de microscope confocal spinning Disc

REMARQUE: Voir Tableau des matériaux pour notre configuration spécifique.

  1. Configurez le protocole d'acquisition pour enregistrer une pile XYZCt d'images 8-16 bits (XYZ - volume, C ' canal, t 'temps).
  2. Sélectionnez des lignes laser pour les canaux souhaités (p. ex. 641 nm laser pour Cy5 et 491 nm pour GFP) et acquièrent les canaux de façon séquentielle : d'abord le signal de fluorescence dans chaque canal, puis changez la position Z, pour permettre une analyse de colocalisation appropriée.
  3. Sélectionnez l'étape Z (p. ex. 0,3 m) et les limites du haut et du bas de l'étape Z(p. ex. -2 m à 2 m).
  4. Entrez le temps d'acquisition et le taux d'échantillonnage (p. ex. tous les 15-30 s jusqu'à 1 h).
  5. Initier l'acquisition.

6. Traitement, analyse de données pour obtenir des informations de suivi et de colocalisation, et préparation des fichiers vidéo

  1. Traitement d'images
    1. Téléchargez, déballez et ouvrez Icy, une plateforme communautaire ouverte pour l'informatique bioimage (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. Ouvrez la pile XYZCt acquise à l'étape 5 : Image/Séquence .'
    3. Convertissez la pile en ImageJ: ImageJ -gt; Tools 'gt; Convertir à IJ, ont le mode détaché sur.
    4. Faire une sous-pile (une sélection d'une gamme d'étapes Z et des points de temps à analyser plus en détail): ImageJ 'gt;Image 'gt;Stacks 'gt;Tools 'gt;Make Substack ...; sélectionnez les canaux souhaités, les étapes Z et les points de temps.
    5. Enregistrer sous-pile comme fichier TIFF: ImageJ -gt;File 'gt;Save As 'gt;Tiff...; utiliser ce fichier pour les étapes suivantes.
    6. Chaînes fractionnement: ImageJ 'gt;Image 'gt;Color'gt;Split Channels.
    7. Soustrayez l'arrière-plan soit à l'aide d'une pile d'arrière-plan: ImageJ -gt;Process '..., ou en utilisant l'option Rolling ball: ImageJ 'gt;Process 'gt;Subtract Background..., sélectionnez le rayon de boule roulante. Aperçu de l'image pour le rayon sélectionné avant de sélectionner "Accepter".
      Remarque : Le signal de fond résultera principalement d'un désétichage incorrect du flurorophore. Le rapport de signal :background (S:B) est souvent utilisé comme indicateur de la « luminosité » d'un MB, et il est mesuré à partir d'expériences d'hybridation in vitro de l'oligonucléotide cible MB et ADN. Par exemple, les MBs osk1236 et osk2216 ont un S:B de 81 et 120 euros, respectivement.
    8. Ajustez la luminosité et le contraste pour chaque canal : ImageJ-gt;Image-gt;Adjust-gt;Brightness/Contrast, sélectionnez Appliquer.
    9. Enregistrer chaque canal comme un fichier TIFF distinct: ImageJ 'gt;File 'gt;Save As 'gt;Tiff....
    10. Fusionnez les deux canaux : ImageJ-gt;Image-gt;Color-gt;Merge Channels...; sélectionner les canaux. Enregistrer la nouvelle pile comme un nouveau fichier TIFF (voir l'étape 6.1.8).
  2. Détection et suivi des taches
    1. Convertissez-vous à Icy: ImageJ -gt;Tools 'gt;Convert to Icy.
    2. Une barre d'échelle est automatiquement superposée sur la pile lors de la conversion à Icy, si le plugin de barre d'échelle est installé [Recherche à l'aide de Plugins .gt;Setup 'gt;plugin en ligne]. Si nécessaire, modifiez la barre d'échelle via la fenêtre de l'inspecteur (côté droit de l'écran) .
    3. Désélectionnez/inactivez l'icône 'eye' pour la barre d'échelle de l'onglet Couche pour supprimer la barre d'échelle de la pile d'origine. Il peut être réactivé sur la pile finale.
    4. Enregistrer la pile nouvellement traitée en prenant une capture d'écran en utilisant l'icône "caméra" de la barre de menu de la fenêtre d'image, "Prendre une capture d'écran de la vue actuelle" et Fichier 'gt;Save as 'gt;Tiff....
    5. Déterminer la sensibilité au spot, si les paramètres de sensibilité au spot ont déjà été déterminés se déplacent sur l'étape 6.2.7.
    6. Détectez les taches : sélectionnez la fenêtre avec l'image ou la pile à analyser, Détection et suivi et détection de points, et remplissez les paramètres Paramètres :
      1. Pour l'entrée, sélectionnez "currentSequenceInputDetection" (par défaut).
      2. Pour le pré-traitement, sélectionnez "Channel 0" (par défaut), ou le canal souhaité en recoupant le numéro dans l'onglet Inspecteur.gt;Séquence.
      3. Pour le détecteur, sélectionnez « Détecter la tache brillante sur le fond sombre ; » utilisez « Utilisation par la force des ondlettes 2D pour la 3D » uniquement s'il n'y a pas assez de tranches Z dans les piles pour effectuer l'analyse. Sélectionnez « Échelle »et « Sensibilité » pour chaque échelle (ajouter plus d'échelles pour les taches plus grandes). L'échelle et la sensibilité (plus le nombre est grand, plus la détection est sensible, un maximum de 140 est suggéré par Icy) sont des variables d'essai et d'erreur, qui doivent être vérifiées visuellement par la suite et décidées.
      4. Pour la région d'intérêt, utilisez "ROIfromSequence" (par défaut).
      5. Pour le filtrage, utilisez "NoFiltering" (par défaut), ou sélectionnez "SizeFiltering" pour définir la "Range of accepted objects (en pixels)".
      6. Sortie : sélectionnez le paramètre de sortie XLS ou XML (sélectionnez format XML lors de l'utilisation de 2007 MS Excel ou plus tôt et il y a 65 000 places). Si les résultats du détecteur de place sont utilisés pour l'analyse de suivi, sélectionnez également « Export to SwimmingPool ».
      7. Répéter la détection des taches en utilisant diverses valeurs d'échelle/sensibilité jusqu'à ce que la totalité ou la plupart des taches soient détectées. Enregistrez tous les paramètres finaux.
      8. Pour l'analyse de colocalisation, répéter la détection des taches pour l'autre canal.
    7. Pour suivre les taches, sélectionnez Détection et Suivi de la piste avec les paramètres de l'étape 6.2.6., ou utilisez le menu de traction " Sélectionnez les résultats de détection ici pour sélectionner un jeu de données existant (pour cela, gardez la fenêtre Spot Detector s'ouvrir à partir de l'étape 6.2.5). Appuyez sur le bouton « Paramètres d'estimation » et sélectionnez le mouvement cible souhaité dans la fenêtre pop-up d'estimation paramètres (p. ex. « est à la fois diffuse et dirigée »). Appuyez sur le bouton " Suivi de la course ".
    8. Répétez la détection et le suivi des taches ponctuelles pour les autres canaux lors du suivi des taches des piles multicanaux, en suivant les étapes 6.2.6 et 6.2.7, en commençant par la pile générée à partir de l'étape 6.2.7.
    9. Pour visualiser les pistes, sélectionnez Detection et Tracking-gt;Track Manager - cette fenêtre s'ouvre automatiquement à la fin d'une course de suivi. Pour "Color Track Processor", sélectionnez "Enable" et choisissez la représentation souhaitée de la couleur pour les pistes. Les processeurs de piste pertinents peuvent être consultés via le « processeur de piste ajouté... menu de traction vers le bas (p. ex. sélectionnez « Clip de temps du processeur de piste », activez la fenêtre « Track Clipper » et choisissez le nombre de détections souhaité s'afficher avant et après le point d'heure actuel.)
    10. Enregistrer les informations de pistes comme un fichier de piste XML: Détection et Tracking 'gt;Tracking 'gt;Track Manager 'gt;File 'gt;Save as....
    11. Enregistrez les résultats en prenant une capture d'écran à l'aide de l'icône " caméra " de la barre de menu de la fenêtre d'image, « Prenez une capture d'écran de la vue actuelle ». Captures d'écran peuvent être prises avec les taches détectées et / ou les pistes tout simplement en activant / désactiver l'icône oculaire correspondant (s) trouvé dans la fenêtre de l'inspecteur -gt;Layer tab 'gt;Name 'gt;Overlay wrapper.
    12. Installez le plugin TimeStamp Overlay: Plugins .-gt;Setup .'en ligne plugin'gt;TimeStamp Overlay.gt;Install.
    13. Ajouter timetamp: Plugins 'gt;TimeStamp Overlay (Nouveau). Suivez les instructions sur la fenêtre contextielle (coin inférieur droit de l'écran) pour les instructions sur le placement et la mise en forme de l'horodatage. L'intervalle de temps peut être ajouté/modifié dans la fenêtre de l'inspecteur.gt;Séquence tab .'Séqueur Properties'gt;Edit.
    14. Enregistrer les résultats en prenant une autre capture d'écran. Enregistrer l'image comme 1) format Tiff, et 2) comme format AVI; pour le format AVI d'abord convertir en rendu RGB (Image / Séquence 'gt;Rendering 'gt;RGB image).
    15. Faites pivoter l'image vers l'orientation souhaitée : Fenêtre de l'inspecteur .gt;Séquence tab.-Canvas.-Rand.
    16. Enregistrer l'image en rotation par "Prendre une capture d'écran de la vue actuelle". Assurez-vous que l'icône "oeil" de la barre d'échelle est désélectionnée, car elle tournera également avec l'image.
    17. Choisissez et récoltez le retour sur investissement : sélectionnez Région d'Intérêt -gt;2D ROI-gt;Choisissez la forme du ROI, puis créez/dessinez le retour sur investissement sur l'image ; Image /Séquence 'gt;Plane (XY) 'gt;Fast crop.
  3. Analyse de la colocalisation
    1. Préparer un protocole de colocalisation; plusieurs exemples sont fournis sur le site Web d'Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (voir Matériaux supplémentaires).
    2. Protocole de colocalisation de la charge : Outils -gt;Scripting-gt;Protocols-gt;Load, et ajuster les paramètres dans les blocs d'interaction (par exemple dans les paramètres d'utilisation des blocs de «Wavelet Spot Detecting» déterminés à l'étape 6.2.6.).
    3. Mesurez la taille d'une particule en pixels, déterminez la distance de colocalisation et entrez-la dans le bloc « Colocalizer » sous le titre « Distance maximale ».
      REMARQUE: La taille de la particule en pixels dépend du système de détection. Pour mesurer la taille, zoomez sur une seule particule et comptez manuellement les pixels qui couvrent la largeur du signal à travers. Moyenne des mesures d'au moins trois particules. La distance maximale à définir pour la colocalisation est la taille de la particule en pixels (ce qui représente la somme maximale du rayon de deux particules qui se touchent).
    4. Si vous le souhaitez, sélectionnez un ou plusieurs ROIs pour l'analyse de colocalisation: Region Of Interest 'gt;2D ROI 'gt;Choose ROI shape 'gt;Draw ROI on image.
    5. Crop ROI(s) : Image/Séquence(MD)
    6. Effectuer la colocalisation: Protocoles éditeur fenêtre 'gt;Chosen protocol tab 'gt;Run. Le bloc final dans la fenêtre de l'éditeur de protocoles contiendra le pourcentage global de colocalisation basé sur la détection de spot, tandis que l'information à chaque point de temps peut être trouvée dans la fenêtre de l'inspecteur.gt; onglet sortie.
    7. Suivre les particules colocalisées et uniques en suivant l'étape 6.2.7 (points de piste).
    8. Enregistrer tel que décrit à l'étape 6.2.16.

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Résultats

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À l'aide de PinMol, plusieurs MB peuvent être conçus pour une cible de l'ARNm (Figure 1B-C). Après synthèse et purification, les MB sélectionnés sont caractérisés et comparés à l'aide d'analyses in vitro.

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Figure 1 : Technique et description des tissus pour l'imagerie cellulaire vivan...

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Discussion

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La visualisation en direct du trafic d'ARNm endogène dans les chambres d'oeufs drosophila repose sur l'utilisation de MB spécifiques, efficaces et résistants aux nucléasmes, qui peuvent maintenant être facilement conçus avec le logiciel PinMol. Les MB sont des sondes spécifiques conçues pour détecter des séquences uniques au sein d'un ARNm cible (de préférence des régions exemptes de structure secondaire), ce qui rend possible la détection d'une transcription très résolue. La seule limitation lors de l'...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

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Nous remercions Salvatore A.E. Marras (Public Health Research Institute Center, Rutgers University) pour la synthèse, l'étiquetage et la purification des balises moléculaires, et Daniel St Johnston (The Gurdon Institute, Université de Cambridge) pour l'oskar -MS2/ Stock de mouches transgéniques MCP-GFP. Ce travail a été soutenu par un prix CARRIÈRE de la National Science Foundation 1149738 et un Prix du Congrès du personnel professionnel-CUNY à DPB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
SpectrofluorimètreFluoromax-4 Horiba-Jobin Yvonn/aSpectrofluorimètre à comptage de photons
Cuvette à quartzFireflysci (anciennement Precision Cells Inc.)701MFL
Pince à épiler Dumont #5World Precision Instruments501985Des pinces fines sont très importantes pour séparer les chambres d’œufs individuelles
Huile d’halocarbure 700Sigma-AldrichH8898
Couvercle n° 1 22 mm x 40 mmVWR48393-048
Microscope de dissectionLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.n/a
CO2 tampon d’anesthésie pour mouches des fruitsGenesee Scienific59-114
Tris-HCL pH 7,5Sigma-Aldrich1185-53-1
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich7791-18-6
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Microscopeconfocal à disque rotatifMicroscope inversé Leica DMI-4000B équipé d’un disque rotatif Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.n/a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM Caméra EMCCDHamamatsun/a
PatchMan NP 2 MicromanipulateurEppendorf Inc.
Microinjecteur FemtoJetEppendorf Inc.
Aiguille d’injection : Femtotips IIEppendorf Inc.
Astuce de chargement : 20 &mu ; L MicrochargeurEppendorf Inc.
Verres Micro Cover n° 1 ou 1,5, 22 mm x 40 mmVWR48393-026 ; 48393-172
Levure sècheN’importe quelle épicerien/a
Ordinateur, > 20 Go de RAMBien que le traitement puisse être effectué sur la plupart des ordinateurs, des capacités plus élevées augmenteront la vitesse du traitement
920000037920010504930000043930001007

Références

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Mots-clés

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