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Article de méthode

Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte

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DOI :

10.3791/58565

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15 février 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Second Hospital of Hebei Medical University, 2No.2 Middle School of Shijiazhuang, 3Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 4Key Laboratory of Hebei Neurology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une technique d’injection intrathécale directe à l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans une solution virale pour assurer une prestation efficace virus adeno-associé à de petits animaux et de mettre en place un système de notation pour prédire l’efficacité de la transduction du central système nerveux selon le degré de faiblesse transitoire induit par la lidocaïne.

Résumé

L’injection intrathécale (IT) d’adeno-associated virus (AAV) a attiré un intérêt considérable pour la thérapie génique CNS en raison de son innocuité, invasif et transduction excellente efficacité dans le système nerveux central. Études antérieures ont démontré la puissance thérapeutique de la thérapie de gène AAV-livrés dans les troubles neurodégénératifs qu’elle administration. Cependant, des taux élevés d’échec imprévisible en raison de la limitation technique d’administration informatique chez de petits animaux ont été signalés. Ici, nous avons mis en place un système de notation pour indiquer la mesure du succès d’une ponction lombaire chez de petits animaux en ajoutant du chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans la solution injectable. Plus loin, nous montrons que l’étendue de la faiblesse passagère après une injection peut prédire l’efficacité de la transduction du VAA. Ainsi, cette méthode d’injection TI peut servir à optimiser des essais thérapeutiques dans des modèles murins de maladies de CNS qui touchent de larges régions du SNC.

Introduction

AAV peut médier l’expression génique à long terme et très répandue dans la transduction de CNS avec peu d’effets secondaires et par conséquent est devenu l’un des véhicules plus prometteuses pour la thérapie génique traiter les maladies CNS, y compris la sclérose latérale amyotrophique (SLA), Huntington maladie (HD), la maladie d’Alzheimer (ma), maladies lysosomales (LSD), maladie de Gaucher (GD) et céroïde lipofuscinose neuronale (NCL)1. Actuellement, plus de 100 sérotypes d’AAV ont été isolés chez l’homme et les animaux. Parmi ceux-ci, au moins 12 ont été utilisés dans précliniques et des essais cliniques, y compris le plus couramment utilisé des vecteurs de gènes tels que AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 et rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.

Différentes maladies de CNS nécessitent des stratégies de prestation AAV différentes en raison des diverses régions touchées de CNS et types de cellules. Les régions de la CNS et la cellule types d’AAV peut transduce varie selon le sérotype ainsi que de la méthode de livraison. Par exemple, rAAVrh10 s’est avéré transduce principalement astrocytes par systémique intraveineuse (IV), considérant qu’elle transduites les neurones et cellules gliales par intrathécale injection4,7. En outre, injection de parenchyme a entraîné transduction locale à proximité du site d’injection, tandis que l’injection dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) à travers intraventriculaire ou injection intrathécale a entraîné dans la transduction généralisée du CNS8 . Études ont également démontré l’activité thérapeutique de la thérapie de gène AAV-livrés dans les troubles neurodégénératifs qu’elle administration9,10,11. Les maladies qui affectent les grands domaines du SNC tels que de l’ALS, une injection intrathécale dans le CSF a été démontrée pour couvrir la plupart des régions qui sont affligées par la maladie avec une dose plus faible, par rapport à une délivrance systémique méthode4,10. Des études récentes ont également montré qu’une ponction lombaire peut être utilisée pour injecter AAV dans des modèles murins de la SLA, ce qui évite les risques de blessures associées à une laminectomie et intrathécale cathétérisme4.

Une ponction lombaire expérimentale directe a été utilisée pour livrer des agents, notamment des anesthésiques, à la moelle épinière pour analgésie et anesthésie en 188512,13. Dans ce rapport, Nous illustrons la ponction lombaire méthode d’injection IT chez la souris adulte, avec l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 %, un anesthésique local amide dérivé, dans la solution injectable pour évaluer et surveiller la qualité de l’injection. Injections réussies ont été marquées par la paralysie transitoire induite par la lidocaïne, tandis que l’échec des injections ne montrent pas ce comportement. Nous avons classé le niveau de faiblesse passagère comme l’un des cinq grades afin de prédire l’efficacité de l’injection. Enfin, nous montrons que le niveau de la transduction de rAAVrh10 peut être prédite par le degré de paralysie. Par conséquent, cette méthode de livraison AAV intrathécale peut servir à AAV-mediated gene-prestation pour thérapie expérimentale des maladies de la CNS.

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Protocole

Les souris FVB/NJ ont été élevés dans l’animalerie de laboratoire clé de neurologie de Hebei. Toutes les expériences de souris ont été approuvés par le deuxième hôpital de Hebei Medical University Ethics Committee et effectués selon les prescriptions de gestion animaux de laboratoire promulguée par le ministère de la Science et de la technologie de la République populaire de La Chine.

1. préparation de la Solution mère de 20 % de lidocaïne chlorhydrate

  1. Environ 2 g de chlorhydrate de lidocaïne. Ajouter doucement 5 à 6 mL d’eau stérile et vortex. Augmentez le volume à un total de 10 mL avec de l’eau stérile.
  2. 1.2 filtrer la solution à travers des filtres de 0,2 microns. Partie aliquote de la solution mère, 1 mL par microtubes de 1,5 mL de tube et fermez-le hermétiquement avec un film. Conserver à 4 ° C.

2. direct par voie intrathécale AAV livraison chez la souris éveillés

  1. Essuyer la zone de travail à l’aide de gaze stérile avec 70 % d’éthanol et préparer les fournitures nécessaires, comme indiqué dans le tableau 1.
  2. Préparer 100 µL de chlorhydrate de lidocaïne AAVrh.10/1% complex en ajoutant 95 µL de la solution rAAVrh10 (5 x 1012 génome copies/mL) dans un tube de microcentrifuge stérile 200 µL et ajouter 5 µL de solution stock de 20 % lidocaïne chlorhydrate. Bien mélanger en pipetage de haut en bas. Ensuite, stocker la solution de virus sur la glace (4 ° C).
    Remarque : 8 µL par souris4 sera utilisé.
  3. Préparer la seringue avec la solution de l’AAV pour injection
    1. Assembler un 25 µL Hamilton seringue avec une aiguille de 27 G et alignez la pointe biseautée de l’aiguille avec l’échelle volumétrique sur la seringue.
    2. Aspirer doucement 8 µL avec 4 x 1010 copies de génome de la solution de virus dans la seringue. Veillez à retirer les bulles d’air.
  4. Préparation de la souris
    Remarque :     mâle ou femelles FVB/NJ souris (âgés de 30 à 70 jours) ont été utilisées dans cette étude. Injection de TI a été opérée dans la hotte.
    1. Stériliser à l’aire de travail sous une hotte avec l’éthanol à 70 %. Placez la souris éveillée (mâles ou femelles, 30-70 jours, poids 13 – 20 g) sur un bedpiece dans une position couchée dans la hotte. Couvrir le haut du corps avec de la gaze stérile pour calmer la souris et éviter d’être piqué.
    2. Fixer l’animal en le saisissant correctement et fermement sur sa ceinture pelvienne avec un pouce sur un côté et l’index/moyen doigt de l’autre côté. Gardez la peau entre les gaines de pelviennes bilatérales tendues avec le pouce et l’index. Tenez délicatement sur la partie supérieure du corps de l’animal avec la paume.
    3. Raser la fourrure sur le dos entre les ceintures pelvienne bilatérales, puis stériliser la surface de la peau avec l’éthanol à base d’iodure gommage et 70 %.
  5. D’Injection intrathécale12
    1. Sentir l’espace intervertébral le long de la ligne médiane entre les gaines pelviennes bilatérales avec le pouce ou l’index de l’autre main et appuyer sur une mise en retrait avec un ongle pour indiquer l’espace intervertébral L5-L6 (localiser le point d’injection).
    2. Faire pivoter la base de la queue légèrement et doucement pour indiquer la ligne médiane de la colonne vertébrale. Ajuster le biseau de l’aiguille vers la tête de l’animal avant l’injection (mentionnée à l’étape 2.3.1).
    3. S’assurer que les animaux sont solidement fixés et alignement l’aiguille le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale.
    4. Insérer l’aiguille doucement et verticalement (ou Inclinez légèrement 70 à 80°) à l’intersection du poinçonnement et conserver la seringue dans un plan sagittal médian. Réduire l’angle d’environ 30° lentement lorsqu’il connecte à l’os, puis glisser l’aiguille dans l’espace intervertébral.
      Remarque : Un coup de queue soudaine évident est un signe d’entrée réussie dans l’espace intradural. Lorsque l’aiguille pénètre dans l’espace intervertébral, pointe de l’aiguille vous sentirez fermement fixée. L’aiguille 27 G utilisée dans cette étude est adapté pour la livraison de TI dans la souris mais pas les rats.
    5. Injecter la solution de vecteur (mentionnée à l’étape 2.2). Démarrer le compte à rebours et injecter 8 µL de la solution de vecteur à une vitesse de 1 µL/4 s. maintenir l’aiguille environ 1 min après livraison. Retirer l’aiguille avec rotation douce pour éviter les fuites.
    6. Marquer la faiblesse passagère de la souris membres immédiatement après l’accouchement afin d’évaluer la qualité d’injection4.
      Remarque : La norme est la suivante4. Score 0 : pas de faiblesse ; note 1 : mineur faiblesse des membres postérieurs sans anomalie de démarche ; note 2 : modérer la faiblesse des membres postérieurs avec anomalie de démarche évidente ; note 3 : compléter la paralysie des membres postérieurs ; note 4 : remplir la paralysie des membres postérieurs, essoufflement et faiblesse modérée des membres avant ; et le score 5 : compléter la paralysie des quatre membres et l’essoufflement manifeste.
    7. Déplacez la souris vers la cage pour la récupération de la paralysie.
  6. Nettoyage
    1. Rincer la seringue avec 1 mL d’eau stérile. Trier les fournitures de laboratoire et recueillir tous les matériaux non jetables pour la stérilisation autoclave. Nettoyer le banc avec l’éthanol à 70 %.

3. tissu préparation pour coloration immunohistochimique

  1. Collection de tissus
    1. Anesthésier profondément souris après l’injection 21 jours avec 3 % d’hydrate de chloral (0,1 mL/10 g) par injection intrapéritonéale.
    2. Perfuse transcardially avec 20 mL de PBS glacée de 0,01 M (NaCl 147 mM ; NaH2PO4 1,9 mM ; K2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) tout d’abord, puis 4 % glacee paraformaldéhyde (dans du PBS de 0,01 M) avec pompe (10 mL/min pendant 1 min, puis 5 mL/min pendant 9 min).
      Mise en garde : Paraformaldéhyde est cancérigène et toxique. Manipulez-le uniquement dans la hotte avec des gants.
  2. Dissection de la moelle épinière et le cerveau
    1. Fixer les branches et la tête de chaque animal dans une position couchée sur un couvercle de boîte de mousse avec des aiguilles de seringue, puis Dénudez et retirez la peau de la tête au sacrum avec des ciseaux.
    2. Clip du crâne entre les yeux, couper aux côtés de la voie médiane du crâne et la ligne horizontale sur le cervelet, puis ouvrir le crâne de chaque côté.
    3. Soulever l’OS occipital avec des pincettes et ouvrir le canal rachidien au niveau bilatéral avec des ciseaux ophtalmique. Couper les côtes des deux côtés et retirer la moitié supérieure des vertèbres soigneusement.
    4. Soulevez le cerveau avec des pincettes incurvé et couper les nerfs de la base du crâne, puis disséquer attentivement sur le cerveau et la moelle épinière. Fixer les tissus à la paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h.
  3. Préparation de tranches de tissus
    1. Cryoprotect le cerveau et les cervicale et lombaire de la moelle épinière dans la solution de sucrose à 30 % la nuit à 4 ° C. Incorporer le tissu dans la température de coupe optimale (OCT) composée et congeler rapidement avec l’azote liquide.
    2. Couper le tissu à 25 µm à l’aide d’un cryostat et stocker les coupes congelées dans du PBS 0,01 M à 4 ° C pour une utilisation.

4. immunohistochimie

  1. Prétraitez les sections flottantes dans 1 % H2O2 pendant 10 min, puis les laver dans du PBS pendant 10 min. laisser incuber dans une solution de blocage contenant 5 % de sérum et de 0,3 % de détergent non ionique dans du PBS pendant 1 h.
  2. Incuber les tranches avec des anticorps primaires correspondantes pendant une nuit à 4 ° C. Laver les sections de PBST (0,2 % Tween 20 dans du PBS) pendant 30 min (3 fois pendant 10 min).
  3. Incuber les tranches avec des anticorps de biotine-secondaire correspondant à température ambiante pendant 1 h. lavage de PBST pendant 30 min (3 fois pendant 10 min).
  4. Incuber les sections avec affinité biotine peroxydase complexe pendant 40 min et tacher avec agent achromogènes. Monter les sections sur glissières et bien sécher.
  5. Tremper les lames dans l’éthanol anhydre pendant 5 min et xylène pendant 10 min, puis Scellez les diapositives avec un milieu de montage. Enfin, l’image des diapositives avec un microscope équipé d’un dispositif à couplage de charge (CCD) à x 100, x 200 et 400 x grossissements.

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Résultats

Souris ont montré des degrés différents de faiblesse passagère juste après elle injection d’une solution AAV en chlorhydrate de lidocaïne 1 % en raison de différentes qualité d’injection intrathécale. Selon le semiquantitative grade 5 système de notation nous avons mis en place, nous avons testé les patrons de transduction de l’AAV chez la souris avec différents degrés de la faiblesse des membres induite par la lidocaïne (score 0, n = 2 ; Marquez 1, n = 1 ; score 4, n = 4 ; marquer 5, n =...

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Discussion

Techniquement, il y a plusieurs étapes critiques pendant l’injection de TI chez les souris éveillés. Tout d’abord, le bon geste et la firme contrôle des souris tout au long de l’opération entière est une condition préalable à la mise en œuvre réussie. Deuxièmement, le point le plus difficile se sent l’espace intervertébral avec la pointe de l’aiguille, car il ne faut pas insérer trop profondément sans résistance ou insérer de force sous une forte résistance dans le cas de blesser les animaux ou le pliage de la pointe de ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention du HEBEI Provincial ministère des ressources humaines et de la sécurité sociale (CY201605) et une subvention de la Fondation sciences naturelles de la Province de Hebei (H2017206101), et nous sommes très reconnaissants à m. Guangping Gao, qui a fourni l’AAV pour cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
souris FVB/NJCharles River Laboratories Chine
Chlorhydrate de lidocaïne monohydratéHEOWNS73-78-9
AAV Viral Vector Core du Centre de thérapie génique de la faculté
25 µ ; L  ; Hamilton seringue/27-30 G aiguilleGASTIGHT1702
O.C.T compondSAKURA4583
H 2O 2SHUI HUAN PAI
Sérum de chèvreSolarbioS9070
Triton X-100LIFE SCIENCEST8200
Rabbit anti-GFPLife techG10362Dilution 1:333
Le deuxième anticorps (chèvre-anti lapin)Jackson Immuno Research111-005-144Dilution 1:1 000
VECTASTAIN ABC RÉACTIFVector LabPK-6100
ImmPACT DAB Peroxidase Substrate KitVector LabSK-4105
Milieu de montage pour fluorescence avec DAPIVectorshieldH-1200
NaClYong Da Chemical
NaH2PO4· ; 2H2OYong Da Chemical
Na2HPO4· ; 12H2OYong Da Chemical
ParaformaldehydeYong Da Chemical307699
Adherence Microscope SlidesCITOGLAS1708325 mm x 75 mm
SUPER-SLIP MICRO-GLASElectro Microscopy Siences72236-6024 mm x 60 mm
15 mL Tube à centrifugerCORNING430790
96 puits grappe de culture cellulaireCoster3599
24 puits grappe de culture cellulaireCoster3524
70 % ÉthanolWEN ZHI
GazeWei AN051711128 cm x 10 cm x 12 cm Seringue
1 mLHong Da
MicrotubesMicropipette à plasme
  ;eppendorf
Peppet tipsRainin
Centirifugeeppendorf5427R
RegeratorHaierBCD-539WT
FiltreMILLEX GPR4PA42342
PompeLongerPumpBT-100-2J/YZ1515X
Microscope OlympusBX53
Microtome de congélationLeicaCM1520
de médecine de l’Université du Massachusetts 170401 de

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Virus ad no associadministration d AAVth rapie g nique du SNCmod le murinfaiblesse transitoirechlorhydrate de lidoca netransduction de la moelle pini reanalyse immunohistochimiquecoupe au cryostat
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