Article de méthode

Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

DOI :

10.3791/58587

⸱

3 juin 2019

 ,  ,  ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics, 2Center for Systems Biology Dresden

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit une méthodologie basée sur les Fidji, conviviale avec des instructions simples expliquant comment analyser de façon fiable le comportement de l'actomyosine dans les cellules individuelles et les tissus épithéliales courbés. Aucune compétence en programmation n'est requise pour suivre le tutoriel; toutes les étapes sont effectuées de manière semi-interactive à l'aide de l'interface utilisateur graphique de Fidji et des plugins associés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les œufs immatures de Drosophila sont appelés chambres d'oeufs, et leur structure ressemble aux organes primitifs qui subissent des changements morphologiques d'un rond à une forme ellipsoïde pendant le développement. Ce processus de développement est appelé oogenesis et est crucial pour générer des œufs matures fonctionnels pour sécuriser la prochaine génération de mouches. Pour ces raisons, les chambres à œufs ont servi de modèle idéal et pertinent pour comprendre le développement des organes animaux.

Plusieurs protocoles de culture in vitro ont été développés, mais il y a plusieurs inconvénients à ces protocoles. L'une consiste à appliquer diverses couvertures qui exercent une pression artificielle sur les chambres d'œufs imageafin de les immobiliser et d'augmenter le plan d'acquisition imagede de la surface circonférence des chambres d'oeufs analysées. Une telle approche peut influencer négativement le comportement de la machinerie actomyosine mince qui génère la puissance de faire pivoter les chambres d'oeufs autour de leur axe plus long.

Ainsi, pour surmonter cette limitation, nous culture Drosophila chambres d'oeufs librement dans les médias afin d'analyser de façon fiable machines actomyosin le long de la circonférence des chambres d'oeufs. Dans la première partie du protocole, nous fournissons un manuel détaillant comment analyser la machinerie d'actomyosine dans un plan d'acquisition limité à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules). Dans la deuxième partie du protocole, nous fournissons aux utilisateurs un nouveau plugin basé à Fidji qui permet l'extraction simple d'une mince couche définie de la surface circonférence des chambres d'oeufs. Le protocole suivant décrit ensuite comment analyser les signaux d'actomyosine à l'échelle des tissus (cellules de 50). Enfin, nous repérons les limites de ces approches à la fois à l'échelle cellulaire et tissulaire locale et discutons de son développement futur potentiel et des applications possibles.

Introduction

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Le développement continu de nouvelles technologies d'imagerie et de logiciels avec des applications dans les sciences de la vie a eu un impact énorme sur la compréhension des principes de base de la vie. L'un des principaux défis est la visualisation fiable des processus de développement en combinaison avec leur imagerie en direct dans divers tissus. Les tissus font partie des organes et des corps et, en tant que tels, la majorité d'entre eux ne sont pas facilement accessibles pour l'imagerie. Par conséquent, des protocoles qui permettent leur dissection et la culture in vitro ont été développés afin de visualiser des événements biologiques qui reflètent suffisamment la situation in vivo au sein d'un corps vivant.

Au cours des dernières décennies, la culture et l'imagerie vivante des chambres d'œufs Drosophila, des structures semblables à des acinars ressemblant à des organes primitifs, ont énormément contribué à la compréhension des principes de base du développement des organes primitifs1 , 2 (en) , 3. Actuellement, il existe plusieurs protocoles de culture, et leur utilisation dépend du temps d'acquisition, du type de cellule à imager et de leur accessibilité (p. ex., lignée germinale interne par rapport à la ligne somatique extérieure)4.

Une caractéristique commune dans tous ces protocoles de culture est la nécessité de l'immobilisation des chambres d'oeufs analysées qui montrent une activité contractile élevée dans les médias liquides. L'activité contractile des chambres d'oeufs est causée principalement par la feuille de muscle qui couvre une longue chaîne de chambres d'oeufs connectés5,6,7. Par conséquent, pour parvenir à l'immobilisation appropriée des chambres d'oeufs jeunes, diverses approches ont été développées, impliquant la couverture des chambres d'oeufs avec des couvertures6,8,9 ou des couvertures flexibles4, 10 ou les intégrer dans l'agarose à faible point de fusion3,11. Ces approches sont populaires car elles permettent également l'imagerie d'un plan visuel plus grand en raison de l'aplatissement subtil de la surface circonférence des chambres d'oeufs.

Cependant, récemment, il a été démontré que les jeunes chambres d'oeufs (stade 1-8) tournent autour de leur axe antérieur-postérieur6 et que ce mouvement de tissu est actionné par un réseau fin d'actomyosine près de la surface circonférence de ces jeunes chambres d'oeufs 12. Par conséquent, l'altération artificielle de la surface cellulaire provoquée par un aplatissement subtil de ce tissu peut avoir un impact négatif sur le comportement de la machinerie d'actomyosine génératrice de force. Le contrepoint est que si le tissu de la chambre d'oeuf s'est aplati, l'imagerie microscopique des protéines à la surface circonférence des chambres d'oeufs devient encore plus limitée par la taille diminuée du plan d'acquisition.

Par conséquent, nous avons combiné des protocoles de Prasad et coll.9 et du laboratoire de Celeste Berg4,10 et nous les avons modifiés de façon à ce qu'aucune couverture/couverture flexible/agarose ne soit utilisée dans la méthode développée. Les chambres d'oeufs drosophiles sont librement cultivées dans les médias et le protocole présenté ici ne s'applique qu'à la microscopie inversée. Il y a deux parties au protocole. La première partie est axée sur l'analyse des signaux d'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules) dans les chambres d'oeufs. Dans la deuxième partie, nous nous concentrons sur le dépassement des limites associées à un petit plan d'acquisition causé par la culture libre des chambres d'oeufs. À cet égard, nous avons développé une nouvelle méthode de calcul basée sur Fidji avec une interface utilisateur graphique semi-interactive qui extrait sélectivement et déploie des couches définies d'une surface tissulaire circonférence. Ceci est suivi d'un protocole qui décrit comment analyser l'actomyosine à l'échelle tissulaire (c.-à-d., les cellules de 50). Comme l'extraction sélective d'une fine couche définie de tissus épithélials incurvés n'a pas été facilement possible à l'aide d'une projection classique de z-stack (Figure 1), cette méthode facile à utiliser sert de condition préalable importante pour comprendre comportement d'un mince réseau d'actomyosine à l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs de Drosophila.

En outre, pour faciliter le protocole, nous fournissons des exemples de films en time-lapse (TLMs) et des fichiers d'exemples de comportement myosin II non musclé fluorescent (voir Dossier supplémentaire 3). Myosin II est une protéine motrice et représente la partie contractile active de la machinerie actomyosine. Afin d'imageMyosin II, nous utilisons des lignes transgéniques Drosophila qui contiennent une chaîne de lumière réglementaire modifiée de Myosin II appelé MRLC::GFP (voir tableau des matériaux pour plus de détails)12,13. Afin de visualiser les membranes cellulaires, le protocole est basé sur des colorants commerciaux (voir Tableau des matériaux). Ce protocole convient non seulement à l'analyse de petits signaux subcellulaires MRLC::GFP12, mais aussi pour toutes les particules subcellulaires de taille similaire autour de 300 m, telles que celles observées avec Life-Act::GFP12,14.

Bien que ces deux protocoles soient présentés à l'aide de chambres d'œufs drosophila de culture in vitro, l'acquisition de signaux d'actomyosine peut également être effectuée à l'aide d'autres tissus lors de l'optimisation des supports de culture et en fonction de la disponibilité des protéines étiquetées fluorescentes avec des colorants commerciaux correspondants ou, par exemple, des microinjections d'ARNm pour obtenir des profils transitoires d'expression génique. De même, le protocole basé aux Fidji pour l'extraction d'une couche mince à partir d'une surface circonférence peut être appliqué plus généralement sur les tissus ellipsoïdes et organiques.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE: Le protocole suivant fournit des instructions sur la façon d'analyser l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale et l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs Drosophila. L'approche à l'échelle locale permet aux utilisateurs d'analyser le comportement détaillé de l'actomyosine dans jusqu'à 15 cellules par chambre d'oeufs et nécessite l'acquisition de TLMs pour une courte période de temps (5-10 min) en utilisant l'imagerie à haute vitesse et un microscope confocal inversé. En revanche, l'échelle tissulaire fournit aux utilisateurs des informations sur l'actomyosine dans 50 à 100 cellules et nécessite l'acquisition de TLM pendant une longue période de temps (30 min) en utilisant l'imagerie à basse vitesse et un microscope à disque filature inversée (voir la figure 2 et paramètres recommandés à chaque échelle du tableau 1). La décision à quelle échelle d'analyser les signaux d'actomyosine dépend entièrement de la question scientifique de l'utilisateur. Les TLM de test accompagnés devraient aider à prendre cette décision.

1. Échelle cellulaire locale (LCS)

REMARQUE: Pour disséquer et imager les chambres d'oeufs drosophila de culture in vitro, suivez le protocole décrit dans le fichier supplémentaire 1. Pour analyser les TLM acquis, continuez avec le protocole suivant. Des liens vers les dossiers de test d'accompagnement des MTL sont fournis dans le fichier supplémentaire 3.

  1. Traitement des données des TLM à l'échelle cellulaire locale (LCS)
    1. Correction de l'eau de Javel des TLM pour compenser la dégradation de l'intensité des étiquettes fluorescentes
      1. Assurez-vous qu'une application Fidji à jour est installée sur l'ordinateur utilisé en suivant ces instructions: Fidji -gt; Ouvrir un TLM (par exemple, TestMovie1.tif à partir du fichier supplémentaire 3).
      2. Divisez les canaux de couleur en cliquant sur L'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels.
      3. Effectuer une correction de l'eau de Javel sur les deux canaux en utilisant l'image 'gt; Ajuster 'gt; Bleach Correction 'gt; Simple Ratio 'gt; Intensité de fond 0.0.
        REMARQUE: Si des résultats insatisfaisants sont obtenus, explorez les méthodes de correction dans ce plugin qui s'adaptent le mieux (par exemple, utilisez Histogram Matching au lieu d'un RatioSimple).
    2. Segmentation cellulaire pour générer un masque cellulaire pour les TLM
      1. Si Fidji n'est pas déjà ouvert, le rouvrir (et assurez-vous qu'il est à jour) suite à l'aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK.
      2. Si cela n'a pas déjà été fait, téléchargez la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (à partir de http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Faites glisser et laissez tomber ce script aux Fidji.
      3. Ouvrez le fichier TLM .tiff corrigé de l'eau de Javel (voir la section 1.1.1). Divisez les canaux du fichier corrigé de l'eau de Javel à l'aide de l'image et de la couleur.
      4. Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du TLM sélectionné en appuyant sur l'icône Exécuter dans le script ouvert. Définir le flou Gaussian à 2.500 et la sensibilité de détection cellulaire à -1 et cliquez sur OK. Afin d'obtenir un masque de cellule agréable, ne modifiez pas ces paramètres ci-dessus. Définir la tolérance au bruit estimée entre 10-20 pour les TLM acquis avec l'objectif 63x et cliquez sur OK.
        REMARQUE: Pour d'autres objectifs, différents paramètres peuvent être nécessaires. Plus l'arrière-plan d'un TLM est net, plus la tolérance au bruit estimée est requise.
      5. Un masque cellulaire généré apparaît dans le TLM analysé et aussi dans une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack (G), et en outre, une petite fenêtre appelée Action Required apparaît. À partir du masque cellulaire sur le TLM, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre du TLM et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du TLM.
      6. Si les cellules sélectionnées contiennent des contours de cellules artificielles ou supplémentaires, utilisez la fenêtre d'outil de fusion appelée Action Requise dans le TLM. Pour ce dernier, suivez les instructions dans la fenêtre.
        REMARQUE: Assurez-vous que les contours des cellules sont bien définis et correspondent à des membranes cellulaires réelles dans un TLM, car toute imprécision peut avoir un impact sur les analyses ultérieures. D'autres modifications et modifications, telles que l'élimination des cellules indésirables, peuvent être effectuées ultérieurement à l'aide de l'outil de gestionnaire de surface (décrit à la section 1.1.3).
      7. Lorsque les cellules sélectionnées dans le centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer ParticleStack comme un fichier .tiff suivant fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
    3. Chargement du masque cellulaire généré dans Surface manager
      1. Installez Surface Manager Plugin15 dans la configuration Fidji utilisée. Suivez les instructions de Viktorinova et coll.16.
      2. Open Surface Manager à l'aide de Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D).
        REMARQUE: La fenêtre De gestionnaire Surface affiche plusieurs boutons d'action à droite et une fenêtre vide à gauche. Pour voir tous les boutons d'action, il peut être nécessaire d'étirer la fenêtre dans sa hauteur / largeur. Notez que les délais apparaîtront sous forme de tranches z.
      3. Ouvrez le fichier Correspondant ParticleStack .tiff dans Surface Manager en cliquant sur Fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez l'image pour l'ouvrir (par exemple, ParticlesStack1.tif).
      4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Lire le plan d'image et définiz l'index Jacquard à 60 %.
        REMARQUE: Le chargement du fichier ParticlesStack1.tif peut prendre jusqu'à plusieurs minutes, selon la puissance de traitement de l'ordinateur.
      5. Une fois chargée, chaque cellule sera assignée avec un numéro S et apparaîtra dans la partie gauche de la fenêtre de gestionnaire Surface.
        REMARQUE: Pour afficher les contours et les noms de cellules pour toutes les cellules, cochez le Show all et affichez les cases à cocher au bas de la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est recommandé d'utiliser cette fonction une fois que les numéros de cellule ont été vérifiés pour leur exactitude.
      6. Cliquez sur le premier numéro S; le contour de la cellule importée de ParticlesStack1.tif apparaît sur le TLM. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours des cellules dans l'ensemble du TLM et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour ce faire, mettez en évidence le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.
        REMARQUE: Il est également possible de corriger les contours imprécis des cellules et d'ajouter de nouveaux contours cellulaires. Ceci est décrit dans la section de discussion.
      7. Enregistrez toutes les cellules corrigées en tant que fichier RoiSet.zip en appuyant sur le bouton Enregistrer sur disque.
        REMARQUE: Si la session doit être interrompue, il est possible de charger le fichier RoiSet dans Surface manager plus tard: ouvrir un TLM à Fidji (Fichier 'gt; Open)et sélectionnez un TLM. Open Surface manager via Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le fichier RoiSet.zip correspondant en cliquant sur la charge à partir du bouton disque et en choisissant le fichier RoiSet.zip approprié. Vérifiez que les masques cellulaires chargés correspondent au TLM chargé.
    4. Correction de la dérive tissulaire dans les TLM
      REMARQUE: Pendant le temps d'acquisition des TLM, des effets de dérive peuvent être observés en raison d'une rotation épithéliale ou d'un mouvement indésirable. Dans les deux cas, nous recommandons de corriger toute dérive afin de simplifier l'analyse manuelle de l'actomyosine plus tard. La correction de dérive n'est requise que pour l'analyse manuelle de l'actomyosine. Ce tutoriel nécessite un logiciel Fidji à jour avec le Plugin MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installé.
      1. Ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel dans les Îles Fidji via Le Fichier et sélectionnez le fichier corrigé de l'eau de Javel créé à l'aide du tutoriel mentionné ci-dessus.
      2. Divisez les canaux et sélectionnez celui qui identifie les membranes cellulaires par l'intermédiaire de l'image et de la couleur et des canaux fractionnés.
      3. Utilisez le protocole suivant lorsque les contours de la cellule ne sont pas visiblement lisses: Processus 'gt; Filtres 'gt; Gaussian Blur. Fixez-le à 1 2 pour un objectif 63x et cliquez sur OK et puis Oui. Cliquez sur Processus 'gt; Binaire 'gt; Convertir en Masque en utilisant les paramètres par défaut; puis, cliquez sur OK.
      4. Chargez le Plugin MultiStackReg suite à Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; MultiStackReg.
      5. Assurez-vous que la pile 1 est réglé sur le canal de membrane cellulaire, l'action 1 est réglé pour aligner, et la transformation est réglé à la traduction. Vérifiez la case à cocher Save Transformation File, puis cliquez sur OK.
      6. Rouvrir le TLM sélectionné, le Plugin MultiStackReg, et le fichier de transformation enregistré à l'aide de Fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM. Fractionner les canaux de couleur en utilisant l'image 'gt; Color 'gt; Split canaux.
      7. Chargez le Plugin MultiStackReg en cliquant sur Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; MultiStackReg. Sélectionnez le fichier de transformation de charge en tant qu'action 1.
      8. Laissez la transformation comme corps rigide et cliquez sur OK. Sélectionnez le fichier de transformation précédemment enregistré et cliquez à nouveau sur OK.
      9. Fusionner les canaux d'image et enregistrer le TLM enregistré comme un fichier .tiff suite à l'image 'gt; Couleur 'gt; Canaux de fusion. Enregistrer le fichier en cliquant sur Le Fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
        REMARQUE: Il existe d'autres façons de corriger pour une dérive tissulaire dans les Îles Fidji, à savoir via Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; StackReg / Correct 3D dérive.
  2. Analyse des impulsions d'actomyosine dans Surface manager chez LCS
    REMARQUE: Cette étape du protocole permet aux scientifiques d'identifier si les impulsions d'actomyosine sont présentes dans le tissu analysé et de comprendre le comportement détaillé ainsi que la directionnalité des signaux d'actomyosine.
    1. Ouvrez Fidji et assurez-vous qu'un TLM et son masque cellulaire correspondant sont ouverts dans Surface manager.
      REMARQUE: Assurez-vous que Fidji est installé et à jour et que le Plugin Surface Manager est installé (étape 1.1.3.1).
    2. Ouvrez un TLM avec File 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM pour ouvrir (par exemple, TestMovie1'bleach.tif). Chargez le gestionnaire de surface Plugin via Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le masque cellulaire enregistré créé dans le tutoriel ici (par exemple, ParticlesStack1.tif) via le fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un masque cellulaire (par exemple, ParticlesStack1.tif). Chargez la région d'intérêt correspondante (ROI, par exemple, TestMovie1-RoiSet.zip). Voir la figure 3A.
    3. Passez au canal d'intérêt dans le TLM sélectionné.
      REMARQUE: Pour distinguer les canaux, suivez le code couleur indiqué autour du TLM.
    4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Valeur grise moyenne Tranche par tranche ( Figure3B). Notez que les valeurs d'intensité moyenne/médiane des signaux d'actomyosine dans un canal analysé donné dans les contours définis de la cellule au fil du temps seront affichées, ainsi que d'autres paramètres liés à la zone cellulaire et à la forme des cellules.
      REMARQUE: Les valeurs d'intensité sont dans les unités d'arbitrage (A.U.); la zone cellulaire est en pixels et doit être convertie en micromètres carrés.
    5. Enregistrer les valeurs obtenues en tant que fichier de feuille de calcul. Cliquez sur la fenêtre Statistiques, Fichier 'gt; Enregistrer comme.
      REMARQUE: Il est possible de vérifier les valeurs statistiques obtenues plus tard comme suit : ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel aux Fidji et ouvrez le gestionnaire de surface. Chargez le RoiSet.zip correspondant au TLM en appuyant sur la charge à partir du bouton disque et ouvrez le fichier. Le masque enregistré avec les contours de cellule sera téléchargé et les noms des cellules apparaîtront dans la fenêtre gauche du gestionnaire Surface. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir des valeurs statistiques.
  3. Analyse manuelle des signaux d'actomyosine sous-cellulaires individuels à LCS
    REMARQUE: Ce protocole exige le plus de concentration et prend beaucoup de temps. En général, un TLM acquis peut être confortablement analysé dans un délai de 1 jour. Cela n'inclut pas le temps de préparation de la mouche avant leur dissection, la dissection elle-même, et l'acquisition d'image.
    1. Ouvrez un TLM sélectionné, corrigé de l'eau de Javel et enregistré (corrigé de la dérive) dans une application Fidji à jour. Utilisez un TLM corrigé de l'eau de Javel et corrigé par la dérive (p. ex., TestMovie1-bleach-reg.tif) comme exemple d'essai.
    2. Ajuster la luminosité et le contraste pour voir les signaux d'actomyosine individuelle à l'aide de l'image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
    3. Aligner les TLM dans la même direction par rapport à l'axe tissulaire/corps. Dans le cas des chambres d'oeufs, alignez le côté antérieur des chambres d'oeuf toujours à gauche de l'image/sousfilm/TLM avant l'analyse.
    4. Divisez le film sélectionné en courts sous-films de 30 s et projetez chacun d'eux. Enregistrez les sous-films non projetés et projetés dans le temps avec les noms correspondants. Gardez la source d'origine.
      REMARQUE: Submovies peut être créé à partir de TLMs d'origine en supprimant d'abord les cadres indésirables via l'image 'gt; Stacks 'gt; Slice Remover. Définir les tranches à enlever et définir Increment. Transformez-le en RGB avant d'utiliser le dissolvant de tranche lorsque l'incrément est no 1. Pour le temps-projet d'un sous-film de 30 s, cliquez sur Image 'gt; Stacks 'gt; Z-projet 'gt; Intensité maximale pour les cadres définis (tranches) et puis cliquez sur OK. Passer chaque seconde 30 s sous-film afin d'éviter de compter les signaux d'actomyosine 2x dans deux sous-films suivants 30 s.
    5. Placez une image projetée dans le temps à côté du sous-film correspondant de 30 s (Figure 4A,B). Identifiez la ligne de signal sur le sous-film projeté dans le temps. Identifiez la direction du mouvement du signal d'actomyosine (0 à 360 degrés) le long de cette ligne dans le sous-film original en jouant manuellement le sous-film. Utilisez l'outil Angle (dans la barre Fidji) pour mesurer manuellement la direction du mouvement du signal par rapport à l'axe tissulaire défini ou à un outil similaire disponible.
      REMARQUE: Fidji ne fonctionne qu'à l'échelle de 0 à 180 degrés (figure4C),et un nouveau calcul des valeurs obtenues sur une échelle de 0 à 360 degrés est nécessaire. Une ligne de signal correspond à la trajectoire d'un mouvement de signal d'actomyosine au fil du temps.
    6. Pour éviter la duplication dans l'analyse des signaux d'actomyosine, marquez les lignes de signal analysées dans les cellules du sous-film projeté dans le temps (figure4B,D).
    7. Analysez toutes les cellules sélectionnées dans le sous-film 30 s et enregistrez les angles obtenus.
      REMARQUE: Analyser seulement les signaux d'actomyosine cytoplasmique subcellulaire dans les cellules avec des contours de cellules bien définis tout au long d'un TLM. Exclure les cellules individuelles avec moins de 15 à 20 signaux détectés dans l'ensemble du TLM. Ignorer les signaux d'actomyosine qui se déplacent à travers les cellules en raison de leur origine inconnue. Un exemple de nombre de signaux pour une cellule analysée dans le sous-film 30 s est affiché dans la figure 4D.
    8. Continuez jusqu'à ce que les 30 sous-films s-long d'un TLM soient analysés, et enregistrez tous les angles mesurés des signaux d'actomyosine d'un TLM dans un fichier de feuille de calcul.
    9. Résumez tous les angles mesurés par rapport au nombre pertinent de TLM (dépendant de l'expérience). Tracer le pourcentage de la direction des signaux analysés d'actomyosine, par exemple, comme un diagramme de rose avec une gamme de 0 à 360 degrés avec un logiciel préféré.
      REMARQUE: Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, cinq à dix chambres d'oeufs indépendantes de n'importe quel stade de chambre d'oeuf sont recommandées pour être analysées.

2. Échelle de tissu

REMARQUE: Pour disséquer et imager les chambres d'oeufs drosophila de culture in vitro, suivez le protocole dans le fichier supplémentaire 2. Pour analyser les TLM acquis, continuez avec le protocole suivant ci-dessous. Les fichiers de test accompagnés des TLM sont placés dans le fichier supplémentaire 3.

  1. Extraction sélective de surface des tissus épithélials courbés
    note:Ce protocole permet aux utilisateurs d'extraire sélectivement une fine couche d'actomyosine dans un tissu épithélial incurvé au fil du temps. Cette étape du protocole est conviviale et basée sur une interface graphique intuitive. Il est possible d'analyser confortablement (surface d'extraction) plusieurs TLM. Utilisez TestMovie2.czi (à partir de laDossier supplémentaire 3) comme exemple TLM de test.
    1. Ouvrez une application à jour Fidji (Fidji 'gt; Aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK).
    2. Assurez-vous que le Plugin15 de projection de surface elliptoïde est installé. Suivre Viktorinova et al. 16.
    3. Ouvrez un TLM et l'exporter comme un fichier XML / HDF5 en cliquant sur Plugins 'gt; BigDataViewer 'gt; Export Current Image comme fichier XML/HDF5.
      REMARQUE: Il est nécessaire de définir une voie d'exportation. L'enregistrement lui-même peut prendre plusieurs minutes et dépend de la longueur TLM.
    4. Ouvrez le fichier exporté dans Ellipsoid Surface Projection en cliquant sur Plugins 'gt; BigDataViewer 'gt; Ellipsoid Surface Projection 'gt; Sélectionnez fichier XML.
      REMARQUE: Une nouvelle fenêtre avec des vues sagittales de la chambre d'oeuf et un dialogue pour guider l'utilisateur à travers le traitement apparaîtra. Des détails sur la façon de naviguer dans la vue de la tranche peuvent être trouvés à https://imagej.net/BigDataViewer.
    5. La fenêtre de dialogue appelée Ovaries Projection a plusieurs onglets. Dans le premier onglet de dialogue appelé boîte de délimitation, définissez les bordures x et y d'une chambre d'oeufs dans le TLM avec la largeur z de la boîte de délimitation (c.-à-d., la profondeur d'une chambre z-pile/oeuf) et appuyez sur l'ensemble (figure 5A).
    6. Pour définir les bordures, faites glisser les boutons à côté de x, y et z ou définissez les coordonnées des nombres dans les cases x, y et z. Assurez-vous que les bordures sont assez généreuses pour obtenir la partie de la chambre d'oeuf d'intérêt dans l'extraction de surface. Les parties sélectionnées de la chambre d'oeuf sont surlignées en rose.
    7. Passez à l'onglet appelé Trouver des objets blobs dans la fenêtre Ovaries Projection. Définir le sigma et la valeur maximale minimale; puis, appuyez sur le calcul pour identifier les signaux d'actomyosine (Figure 5B), qui apparaîtront sous forme de taches vertes. Réessayez cette étape avec différents paramètres jusqu'à ce que suffisamment de taches (environ 100) soient trouvées.
      REMARQUE: Sigma 1-u20123 avec une valeur maximale minimale de 20'u2012100 fonctionne le mieux pour identifier les signaux d'actomyosine des chambres d'oeufs de stade-6 à -8. L'identification des signaux d'actomyosine est une étape cruciale et dépend de la qualité du signal et de sa taille. Il est important de confirmer la taille correcte des blobs existants. Aucune tache verte visible /blobs dans l'image signifie que la prochaine étape ne fonctionnera pas. Parcourez les avions z sélectionnés pour voir les blobs.
    8. Pour concevoir l'ellipsoïde, continuer avec l'onglet appelé Ellipsoïde Fit. Définir des échantillons aléatoires à 10 000, distance de coupure extérieure/intérieure à 1 u201210, puis, cliquez sur Compute (Figure 5C).
      REMARQUE: Plus la distance de coupure est basse, plus l'ellipsoïde désiré sera précis. Après cela, l'onglet appelé Projection s'ouvrira automatiquement et permet la définition de l'extraction de surface. Les paramètres doivent être optimisés.
    9. Continuer plus loin avec l'onglet appelé Projection (Figure 5D). Configurez une distance de projection minimale et maximale (c.-à-d. la largeur de l'ellipsoïde désiré). Il est nécessaire de définir une distance de projection minimale et maximale de sorte que la région ellipsoïde rose définie comprend toute la couche extérieure de la chambre d'oeuf. Définir la distance de tranche (1 est recommandé).
      REMARQUE: Des exemples d'ajustement ellipsoïde incorrect et optimal entraînant des paramètres de projection incorrects et optimaux sont présentés à la figure 6A,C. La mince couche circonférence de l'intérêt peut être définie plus tard. Assurez-vous que la région rose de l'ellipsoïde avec la largeur définie sur la chambre d'oeuf est visible avant d'appuyer sur le calcul. Il est important que l'ellipsoïde désiré (ligne unique rose) s'adapte bien à la surface ellipsoïde d'une chambre d'oeuf afin d'obtenir les meilleurs résultats. Si l'ajustement ellipsoïde n'est pas bon, organiser différents réglages jusqu'à ce que l'extraction de surface désirée soit obtenue.
      1. Définir une largeur de sortie (800 euros) et une hauteur (400 euros) de l'ellipsoïde. Définir à partir de quel moment l'extraction de surface doit être créée (c.-à-d. définir la longueur de l'extraction TLM). Choisissez une projection sphérique ou cylindrique. Retournez Z et alignez Y si nécessaire.
      2. Appuyez sur le calcul pour obtenir une extraction de surface pour les deux canaux dans de nouvelles fenêtres appelées Image. Ajuster la luminosité et le contraste des fenêtres d'image obtenues pour être en mesure de voir les signaux d'actomyosine projetée, en cliquant sur L'image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
        REMARQUE: Un exemple de comparaison d'une projection résultant d'un ajustement ellipsoïde incorrect et optimal est montré dans la figure 6B,D.
    10. Si l'extraction de surface semble bonne, enregistrez les images (les deux canaux séparément) comme .tiff. En outre, enregistrez le fichier de fenêtre de journal pour la référence future quant à la façon dont la surface de cette chambre d'oeuf particulière a été extraite.
      REMARQUE: Il s'agit d'informations particulièrement importantes si la couche mince extraite doit être retournée à sa forme dépliée d'origine (pour les développeurs seulement).
    11. Fusionnez les canaux avec un code couleur préféré aux Fidji.
      REMARQUE: Si nécessaire, projetez des couches z-stack sélectionnées avec des signaux d'actomyosine. La projection de couches z-stack sélectionnées est nécessaire lorsque l'objectif d'acquisition change légèrement au fil du temps dans un TLM. Pour de meilleurs résultats, projetez tout au plus une à deux couches z-stack.
    12. Enregistrer les résultats en tant que fichiers .tiff.
      REMARQUE: Des exemples représentatifs de couches minces (surface basale sélective et apicale) qui représentent le signal de myosine II (MRLC::GFP) provenant de l'épithélium follicule de la chambre d'œufs mutants de contrôle et de graisse2 se trouvent dans la figure 8.
  2. Traitement des données d'une surface tissulaire extraite sélectivement
    1. Bleach-corriger les TLMs pour compenser la décomposition de l'intensité des étiquettes fluorescentes.
      1. Ouvrez Fidji. Ouvrez un TLM (par exemple, TestMovie2-extraction.tif à partir du fichier supplémentaire 3) en utilisant le fichier 'gt; Open. Sélectionnez l'image pour l'ouvrir.
      2. Divisez les canaux de couleur et les convertir en images 16 bits, si nécessaire, en cliquant sur L'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels. Convertir les canaux en images 16 bits (à partir d'images 32 bits) en utilisant l'image 'gt; Type 'gt; 16-bit.
      3. Effectuer une correction de l'eau de Javel sur les deux canaux en utilisant l'image 'gt; Ajuster 'gt; Bleach Correction 'gt; Simple Ratio 'gt; Intensité de fond 0.0.
        REMARQUE: Si des résultats insatisfaisants sont obtenus, il est nécessaire d'explorer les méthodes de correction dans ce plugin s'adaptent le mieux (par exemple, utiliser Histogram Matching au lieu d'un Ratio Simple).
      4. Fusionnez les canaux à partir des deux images corrigées de l'eau de Javel en cliquant sur Image 'gt; Color 'gt; Merge Channels. Enregistrer l'image fusionnée comme un fichier .tiff en cliquant sur fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
        REMARQUE: Ajustez le contraste et la luminosité des canaux si nécessaire.
    2. Segmentation cellulaire pour générer un masque cellulaire pour les TLM
      1. Si Fidji n'est pas déjà ouvert, le rouvrir (et assurez-vous qu'il est à jour en cliquant sur L'aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK).
      2. Si ce n'est pas déjà fait, téléchargez la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Faites glisser et laissez tomber ce script aux Fidji. Ouvrez le fichier corrigé de l'eau de Javel (p. ex., TestMovie2-bleach.tif du fichier supplémentaire 3, voir aussi 2.2.1).
      4. Divisez les canaux du fichier corrigé de l'eau de Javel en cliquant sur Image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels. Ajuster le canal de membrane pour assurer des contours cellulaires clairs en cliquant sur Image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
      5. Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du TLM sélectionné en appuyant sur l'icône Exécuter dans le script ouvert. Définir le flou gaussien à 1.500. Définir la sensibilité de détection cellulaire à -1 et cliquez sur OK. Définir la tolérance au bruit estimée à 8 euros pour les TLM acquis avec l'objectif 40x et cliquez sur OK.
        REMARQUE: Afin d'obtenir un masque de cellule agréable, ne modifiez pas ces paramètres ci-dessus. Pour d'autres objectifs, différents paramètres peuvent être nécessaires. Plus l'arrière-plan d'un TLM est net, plus la tolérance au bruit estimée est requise.
      6. Un masque cellulaire généré apparaît dans le TLM analysé et aussi dans une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack (G). En outre, une petite fenêtre appelée Action requise apparaît. À partir du masque cellulaire sur le TLM, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre du TLM et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du TLM.
      7. Si les cellules sélectionnées contiennent des contours de cellules artificielles ou supplémentaires, utilisez la fenêtre d'outil de fusion appelée Action requise dans le TLM. Pour ce dernier, suivez les instructions dans la fenêtre.
        REMARQUE: Assurez-vous que les contours des cellules sont bien définis et correspondent à des membranes cellulaires réelles dans un TLM, car toute imprécision peut avoir un impact sur les analyses ultérieures. Des modifications et des modifications supplémentaires, telles que l'élimination des cellules indésirables, peuvent être effectuées plus tard à l'aide de l'outil de gestionnaire De surface (décrit dans le tutoriel ci-dessous).
      8. Lorsque les cellules sélectionnées dans le centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer le ParticleStack comme un fichier .tiff suivant fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff. Procédez au chargement du masque cellulaire généré et à l'analyse de l'actomyosine dans Surface Manager, comme précédemment effectué dans les sections 1.1.3 et 1.2 (également décrites en détail dans les sections 2.2.3 et 2.3).
    3. Chargement du masque cellulaire généré dans Surface manager
      1. Si le Plugin Surface Manager est déjà installé dans la configuration Fidji utilisée, passez à l'étape 2. Si ce n'est pas le cas, suivez Viktorinova et coll.16. Pour les développeurs, seul le code source est également disponible15.
      2. Open Surface Manager en cliquant sur Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D).
        REMARQUE: La fenêtre De gestionnaire Surface affiche plusieurs boutons d'action à droite et une fenêtre vide à gauche. Pour voir tous les boutons d'action, il peut être nécessaire d'étirer la fenêtre dans sa hauteur / largeur. Notez que les délais apparaîtront sous forme de tranches z.
      3. Ouvrez le fichier ParticleStack.tif correspondant dans Surface Manager via File 'gt; Ouvrez et sélectionnez l'image à ouvrir (par exemple, ParticleStack2.tif à partir du fichier supplémentaire 3).
      4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Lire le plan d'image et définiz l'index Jacquard à 60 %.
        REMARQUE: Le chargement d'un fichier ParticleStack.tif peut prendre jusqu'à plusieurs minutes, selon la puissance de l'ordinateur.
      5. Une fois chargée, chaque cellule sera assignée avec un numéro S et apparaîtra dans la partie gauche de la fenêtre du gestionnaire de surface (figure 7A).
        REMARQUE: Pour afficher les contours et les noms de cellules pour toutes les cellules, cochez le Show all et affichez les cases à cocher au bas de la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est recommandé d'utiliser cette fonction une fois que les numéros de cellule ont été vérifiés pour leur exactitude.
      6. Cliquez sur le premier numéro S; le contour de la cellule importée de ParticleStack.tif apparaît sur le TLM. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours des cellules dans l'ensemble du TLM et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour ce faire, mettez en évidence le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.
        REMARQUE: Il est également possible de corriger les contours imprécis des cellules et d'ajouter de nouveaux contours cellulaires. Ceci est décrit dans la section de discussion.
      7. Enregistrez toutes les cellules corrigées en tant que fichier RoiSet.zip en appuyant sur le bouton Enregistrer sur disque.
        REMARQUE: Si la session doit être interrompue, il est possible de charger le fichier RoiSet.zip dans Surface manager plus tard: ouvrir un TLM à Fidji via Le Fichier 'gt; Ouvrir et sélectionner un TLM. Open Surface manager comme suit: Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le RoiSet.zip correspondant en cliquant sur la charge à partir du bouton disque et en choisissant le fichier RoiSet.zip approprié (par exemple, TestMovie2-RoiSet.zip). Vérifiez que les masques cellulaires chargés correspondent au TLM chargé.
  3. Analyse des impulsions d'actomyosine dans Surface manager
    REMARQUE: Ouvrez Fidji et assurez-vous qu'un TLM et son masque cellulaire correspondant sont ouverts dans Surface manager. Assurez-vous que Fidji est installé et à jour et que le Plugin Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) est installé.
    1. Ouvrez un TLM avec File 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM pour ouvrir (par exemple, TestMovie2'bleach.tif). Chargez le plugin de gestionnaire de surface par l'intermédiaire de Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Gestionnaire de surface(3D). Chargez le masque cellulaire enregistré créé dans le tutoriel ici (par exemple, ParticlesStack2.tif) via le fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un masque cellulaire (par exemple, ParticlesStack2.tif). Chargez le retour sur investissement correspondant (p. ex., TestMovie2-RoiSet.zip).
    2. Passez au canal d'intérêt dans le TLM sélectionné.
      REMARQUE: Pour faire la distinction entre les canaux, suivez le code de couleur indiqué autour du TLM.
    3. Dans Surface manager, cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Valeur grise moyenne Tranche par tranche ( Figure7B). Notez que les valeurs d'intensité moyenne/médiane des signaux d'actomyosine dans un canal analysé donné dans les contours définis de la cellule au fil du temps seront affichées, ainsi que d'autres paramètres liés à la zone cellulaire et à la forme des cellules.
      REMARQUE: Les valeurs d'intensité sont dans a.U.; la zone cellulaire est en pixels et doit être convertie en micromètres carrés.
    4. Enregistrer les valeurs obtenues comme un fichier feuille de calcul: cliquez sur la fenêtre Statistiques, Fichier 'gt; Enregistrer comme.
      REMARQUE: Il est possible de vérifier les valeurs statistiques obtenues plus tard, comme suit. Ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel aux Fidji. Gestionnaire Open Surface. Chargez le RoiSet.zip correspondant au TLM en appuyant sur la charge à partir du bouton disque et ouvrez le fichier. Le masque enregistré avec les contours de cellule sera téléchargé et les noms des cellules apparaîtront dans la fenêtre gauche du gestionnaire Surface. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir des valeurs statistiques.
      REMARQUE: En ce qui concerne une analyse manuelle des signaux d'actomyosine subcellulairesindividuels, il n'est pas possible d'effectuer une analyse manuelle des signaux subcellulaires d'actomyosine à l'échelle de tissu. L'optimisation est nécessaire pour l'analyse des signaux individuels d'actomyosine à l'échelle de semi-tissu, comme souligné dans la section de discussion.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole permet aux scientifiques d'étudier le comportement des réseaux d'actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n'est possible que lorsqu'une analyse détaillée du comportement de l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (quelques cellules) est combinée à une analyse similaire à l'échelle tissulaire (de nombreuses cellules). Cependant, les tissus épithélialsont sont souvent courbés et l'extraction d'une mince couche de ces tissus n'était pas possible auparavant, comme le mo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Étapes critiques et dépannage pour la dissection et la culture des chambres d'oeufs

Si trop de mouches sont placées dans une petite fiole, la nourriture de mouche peut devenir boueuse après 2-3 jours en raison des quantités étendues de larves d'alimentation et les mouches adultes se coincer dans la nourriture de mouche. Dans un tel cas, retournez le reste de ces mouches dans une nouvelle fiole avec des aliments frais et réduire leur nombre. En particulier, exclure les femelles...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs sont très reconnaissants à Miriam Osterfield pour partager ses conseils sur l'imagerie de la vie in vitro des chambres d'oeufs en utilisant une approche adoptée par le laboratoire Celeste Berg4. Nous remercions également Sebastian Tosi pour le script Fidji qui permet la segmentation cellulaire.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Schneider MediumGibco21720-024[+]-Glutamine
Pénicilline/StreptomycineGibco15140-122  ;[ +] 10.000 unités/mL de pénicilline [+] 10.000 & micro ; g/mL de streptomycine
Sérum fœtal bovinSigma  ; F135Solution
d’insulineHuman Sigma  ; I9278
50 mL Tubes FalconEppendorf
Filtre stérile Millex-GVMilliporeSLGV033NS33 mm
Fond en verre Plats à micropuitsMatTek CorporationP35G-1.5-14-CBoîte de Pétri de 35 mm, 14 mm Micropuits, n° 1,5 Verre de couverture
PinceA. Dumont & Fils  ;#55
CellMask Deep Red (colorant pour membrane cellulaire)InvitrogenC10046
FM4-64 (colorant pour membrane cellulaire)ThermoFisher/InvitrogenT13320
Lame de dissection de dépressionFisher Scientific12-560B
Équipement microscopique
Steromicroscopepar exemple ZeissStemi SV 6
Microscope confocal inversépar exemple Zeiss/Olympus
Microscope à disque rotatifpar exemple Zeiss/Andor
Verre microscopique/verre de protection,par exemple Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit porte-aiguilleHammacher9160020
Épine de cactusEchinocactus grusonii/cactus baril<
strong>Drosophila stocks utilisés dans le manuscrit
AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFPPour plus de détails, voir Rauzi et al. : Les flux contractiles d’actomyosine polarisés planaires contrôlent le remodelage de la jonction épithéliale. Nature 2010, vol. 468, p. 1110-1115.
AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFP/sqh-MRLC ::GFP ; fat258D/fat2103CPour plus de détails, voir Viktorinova et al. : La rotation épithéliale est précédée d’une brisure de symétrie planaire de l’actomyosine et protège le tissu épithélial des déformations cellulaires. PLoS Genetics 2017, vol. 13, numéro 11, p. e1007107.
inactivée par la chaleur , ,

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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