Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Résumé

Ce protocole fournit une méthodologie basée sur les Fidji, conviviale avec des instructions simples expliquant comment analyser de façon fiable le comportement de l'actomyosine dans les cellules individuelles et les tissus épithéliales courbés. Aucune compétence en programmation n'est requise pour suivre le tutoriel; toutes les étapes sont effectuées de manière semi-interactive à l'aide de l'interface utilisateur graphique de Fidji et des plugins associés.

Résumé

Les œufs immatures de Drosophila sont appelés chambres d'oeufs, et leur structure ressemble aux organes primitifs qui subissent des changements morphologiques d'un rond à une forme ellipsoïde pendant le développement. Ce processus de développement est appelé oogenesis et est crucial pour générer des œufs matures fonctionnels pour sécuriser la prochaine génération de mouches. Pour ces raisons, les chambres à œufs ont servi de modèle idéal et pertinent pour comprendre le développement des organes animaux.

Plusieurs protocoles de culture in vitro ont été développés, mais il y a plusieurs inconvénients à ces protocoles. L'une consiste à appliquer diverses couvertures qui exercent une pression artificielle sur les chambres d'œufs imageafin de les immobiliser et d'augmenter le plan d'acquisition imagede de la surface circonférence des chambres d'oeufs analysées. Une telle approche peut influencer négativement le comportement de la machinerie actomyosine mince qui génère la puissance de faire pivoter les chambres d'oeufs autour de leur axe plus long.

Ainsi, pour surmonter cette limitation, nous culture Drosophila chambres d'oeufs librement dans les médias afin d'analyser de façon fiable machines actomyosin le long de la circonférence des chambres d'oeufs. Dans la première partie du protocole, nous fournissons un manuel détaillant comment analyser la machinerie d'actomyosine dans un plan d'acquisition limité à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules). Dans la deuxième partie du protocole, nous fournissons aux utilisateurs un nouveau plugin basé à Fidji qui permet l'extraction simple d'une mince couche définie de la surface circonférence des chambres d'oeufs. Le protocole suivant décrit ensuite comment analyser les signaux d'actomyosine à l'échelle des tissus (cellules de 50). Enfin, nous repérons les limites de ces approches à la fois à l'échelle cellulaire et tissulaire locale et discutons de son développement futur potentiel et des applications possibles.

Introduction

Le développement continu de nouvelles technologies d'imagerie et de logiciels avec des applications dans les sciences de la vie a eu un impact énorme sur la compréhension des principes de base de la vie. L'un des principaux défis est la visualisation fiable des processus de développement en combinaison avec leur imagerie en direct dans divers tissus. Les tissus font partie des organes et des corps et, en tant que tels, la majorité d'entre eux ne sont pas facilement accessibles pour l'imagerie. Par conséquent, des protocoles qui permettent leur dissection et la culture in vitro ont été développés afin de visualiser des événements biologiques qui reflètent suffisamment ....

Protocole

REMARQUE: Le protocole suivant fournit des instructions sur la façon d'analyser l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale et l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs Drosophila. L'approche à l'échelle locale permet aux utilisateurs d'analyser le comportement détaillé de l'actomyosine dans jusqu'à 15 cellules par chambre d'oeufs et nécessite l'acquisition de TLMs pour une courte période de temps (5-10 min) en utilisant l'imagerie à haute vitesse et un microscope confocal inversé. En revanche, l'échelle tissulaire fournit aux utilisateurs des informations sur l'actomyosine dans 50 à 100 cellules et nécessite l'acquisition de TLM pendant....

Résultats

Ce protocole permet aux scientifiques d'étudier le comportement des réseaux d'actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n'est possible que lorsqu'une analyse détaillée du comportement de l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (quelques cellules) est combinée à une analyse similaire à l'échelle tissulaire (de nombreuses cellules). Cependant, les tissus épithélialsont sont souvent courbés et l'extraction d'une mince couche de ces tissus n'était pas possible auparavant, comme le mo.......

Discussion

Étapes critiques et dépannage pour la dissection et la culture des chambres d'oeufs

Si trop de mouches sont placées dans une petite fiole, la nourriture de mouche peut devenir boueuse après 2-3 jours en raison des quantités étendues de larves d'alimentation et les mouches adultes se coincer dans la nourriture de mouche. Dans un tel cas, retournez le reste de ces mouches dans une nouvelle fiole avec des aliments frais et réduire leur nombre. En particulier, exclure les femelles.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Pénicilline/Streptomycine	Gibco	15140-122	;[ +] 10.000 unités/mL de pénicilline [+] 10.000 & micro ; g/mL de streptomycine
Sérum fœtal bovin	Sigma	; F135	Solution
d’insuline	Human Sigma	; I9278
50 mL Tubes Falcon	Eppendorf
Filtre stérile Millex-GV	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Fond en verre Plats à micropuits	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Boîte de Pétri de 35 mm, 14 mm Micropuits, n° 1,5 Verre de couverture
Pince	A. Dumont & Fils		;#55
CellMask Deep Red (colorant pour membrane cellulaire)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (colorant pour membrane cellulaire)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Lame de dissection de dépression	Fisher Scientific	12-560B
Équipement microscopique
Steromicroscope	par exemple Zeiss		Stemi SV 6
Microscope confocal inversé	par exemple Zeiss/Olympus
Microscope à disque rotatif	par exemple Zeiss/Andor
Verre microscopique/verre de protection,	par exemple Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit porte-aiguille	Hammacher	9160020
Épine de cactus	Echinocactus grusonii/cactus baril<
strong>Drosophila stocks utilisés dans le manuscrit
AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFP			Pour plus de détails, voir Rauzi et al. : Les flux contractiles d’actomyosine polarisés planaires contrôlent le remodelage de la jonction épithéliale. Nature 2010, vol. 468, p. 1110-1115.
AX3/AX3 ; sqh-MRLC ::GFP/sqh-MRLC ::GFP ; fat258D/fat2103C			Pour plus de détails, voir Viktorinova et al. : La rotation épithéliale est précédée d’une brisure de symétrie planaire de l’actomyosine et protège le tissu épithélial des déformations cellulaires. PLoS Genetics 2017, vol. 13, numéro 11, p. e1007107.

inactivée par la chaleur , ,