Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans le foie, les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte et leur fonction décrite consiste à éliminer le liquide interstitiel du foie vers les ganglions lymphatiques où les débris cellulaires et les antigènes peuvent être interrogés. Nous sommes très désireux de comprendre comment le système vasculaire lymphatique peut-être être impliqué dans l’inflammation et la fonction des cellules immunitaires dans le foie. Cependant, très peu a été publié d’établir des protocoles de digestion pour l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques (ESL) du foie ou des marqueurs spécifiques qui peuvent servir à évaluer le foie ESL sur une base par cellule. Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour la digestion et du foie de coloration afin d’évaluer la population de l’ESL dans le foie. Nous sommes convaincus que la méthode décrite ici vous sera utile pour l’identification et l’isolement des ESL le foie et permettra de renforcer notre compréhension de comment ESL répondent au microenvironnement du foie.
Introduction
Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie1 et augmentent au cours de la maladie2, très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l'on trouve principalement sur ESL3, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le gang....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.
1. préparation des matériaux
- Préparer une solution de 5 mg/mL de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Faire un mélange de digestion en ajoutant 5 000 U/mL de collagénase IV aux médias EHAA de clic.
- Réchauffer le mélange de digestion à 37 ° C pendant 30 min avant de l’utiliser.
- Faire un tampon d’isolement en ajoutant 4,8 % d’albumine sérique bovine (BSA) et l’aci....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Des études analysant les vaisseaux lymphatiques du foie ont principalement utilisé immunohistochemistry pour quantifier la fréquence et le diamètre des vaisseaux lymphatiques dans le foie. Cependant, cette méthode ne permet pas pour l’évaluation d’ESL sur une base de la cellule par cellule, ou pour l’expression de multiples marqueurs, cytokines, chimiokines ou des facteurs de transcription. Par conséquent, nous avons demandé si foie ESL pouvait être isolées du foie et évaluées à l’aide de.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’importance des ESL dans l’homéostasie du système immunitaire et la régulation est récemment venu à lumière25. Une grande partie de la littérature publiée lymphatique se concentre sur la peau et les ganglions lymphatiques ; Cependant, vaisseaux lymphatiques sont trouvent partout dans le corps26 et, par conséquent, notre compréhension de leur importance dans les différents organes est nécessaire. Nous montrons ici une méthode dans laquelle les ESL dans le foie peut être étu.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs aimeraient remercier les GI et les programmes système immunitaire innée de foie pour un soutien financier de ce projet. B.A.J.T. est également financé par R01 AI121209.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Clics/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagénase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Désoxyribonucléase 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Gradient de densité moyen |
| V450 anti souris CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti souris CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) |
| Pacific Blue anti souris CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti souris CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Protéines péridinine-chlorophylle-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti souris PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanine (APC), podoplanine (PDPN) |
| APC/Cy7 anti souris CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti souris CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti souris CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti souris CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viabilité colorant | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC Syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti souris LYVE1 (clone 223322) | R& D systems | FAB2125A | |
| anti-souris Cytokératine (clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-souris F4/80 (clone Cl :A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Albumine sérique bovine (BSA) |
| Sérum de chèvre | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Sérum d’âne | Jackson Immunorecherche | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) -pour tampon de lyse des globules rouges |
| Chlorure d’ammonium | Fischer | A687-500 | pour tampon de lyse des globules rouges |
| Bicarbonate de potassium | Fischer | P184-500 | pour tampon de lyse des globules rouges |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 &mu ; Passoire à cellules m | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | Bloc FC pour inhiber la liaison non spécifique aux cellules Fc gamma + -fabriqué à partir d’hybridome |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| Plaque 96 puits | Corning | 3788 | |
| Plaque 6 puits | Corning | 3506 | |
| 50 mL conique | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conique | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pointe de pipette | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µ ; Pointe de pipette L | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 & micro ; Pointe de pipette | L USA scientific | 1111-3700 | |
| pipette sériologique 10 mL | greiner bio-one | 607107 | |
| sériologique 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Incubateur de cellules | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II cytomètre en flux | BD biosciences | ||
| Centrifugeuse clinique | Beckman | soc modèle X-14R |
Références
- Tanaka, M., Iwakiri, Y. Lymphatics in the liver. Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The ....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
Explorer plus d’articles
