Article de méthode

Construction d’une feuille les cellules souches mésenchymateuses multicouche avec un système de Culture dynamique 3D

DOI :

10.3791/58624

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20 octobre 2018

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1Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University, 2Department of Developmental and Regenerative Biology, Jinan University, 3Nansha College Preparatory Academy, 4Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of Jinan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Cet article fournit une méthode efficace et réalisable pour la construction de plusieurs couches de cellules souches feuilles dont la propriété des cellules souches favorables.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Thérapie de cellules souches montre un prometteur future dans la régénération de blessés organes et tissus, et la technique de feuille de cellule a été développée pour améliorer la rétention cellulaire faible et faible taux de survie dans la zone cible. Cependant, au cours du processus de construction in vitro , une solution pour le maintien des cellules souches bioactivité et augmentant la quantité de cellules dans la feuille de la cellule est absolument nécessaire. Ici, ce protocole présente une méthode pour construire une feuille de plusieurs couches de cellules avec des cellules souches favorables bioactivité et opérabilité optimale. DECELLULARISE péricarde porcin (DPP) est préparée par la phospholipase une méthode de DÉCELLULARISATION2 (PLA2) comme l’échafaud de feuille de cellule, et rat cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse (BMSC) sont isolées et élargis comme les cellules ensemencées. La structure en tôle cellulaire multicouche temporaire est construite à l’aide de RAD16-j’ai peptide hydrogel. Enfin, la feuille de la cellule est cultivée avec un système de perfusion dynamique pour stabiliser la structure de tridimensionnelle (3D) et la plaque de cellules pourrait être obtenue après une culture de 48 heures en vitro. Ce protocole fournit une méthode efficace et réalisable pour la construction d’une feuille de plusieurs couches de cellules souches, et la plaque de cellules pourrait être développée comme un produit de thérapie des cellules souches favorables à l’avenir.

Introduction

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Thérapie de cellules souches a été signalée comme un traitement efficace pour de nombreuses maladies ; Cependant, rétention cellulaire faible et faible taux de survie dans la zone cible restent des problèmes critiques après l’injection des cellules souches traditionnelles. Pour résoudre ce problème, les scientifiques ingénierie tissulaire a développé la technique de feuille de cellule. Une feuille d’examen cellule avec la matrice extracellulaire intacte a été tout d’abord préparée à l’aide de la réponse de la température de culture plat1, et ses études de suivi a signalé les améliorations significatives de la conservation de cellules souches et la survie au sein de la strangulation zone2,3. Parmi les méthodes, la construction de la plaque de plusieurs couches de cellules a signalé comme une stratégie efficace pour améliorer la survie de la cellule et la cellule feuille effet thérapeutique3,4. Depuis lors, les scientifiques ont travaillé sur l’élaboration de méthodes de construction différentes cellules feuille afin d’augmenter la quantité de cellules, propriété des cellules souches et des propriétés mécaniques des feuilles cellule. Jusqu'à présent, certains types de plaque de cellules ont été construites et étudiés dans le traitement de l’infarctus du myocarde5, blessures des cartilages6, et peau plaie7.

La bioactivité des cellules souches avant la transplantation a montré une influence émergente sur la régénération des tissus lésés, et les stratégies de construction différentes cellules feuille ont des effets différents sur les cellules souches. D’une part, feuilles de cellules confluentes consistaient seulement à haute densité de cellules souches, et matrices extracellulaires naturelles pourraient être acquis par empilement de feuilles cellule examen8 ou à l’aide de tissus magnétique d’ingénierie techniques9. En revanche, les chercheurs ont développé différents échafaudages pour offrir une résistance mécanique suffisante et un soutien cellule croissance10,11,12, qui a permis une cellule souche basse densité pour assurer la nutrition de l’ensemencement approvisionnement. Cependant, malgré ces approches, l’alimentation faible nutrition efficace au sein de la structure en tôle multicouches cellule reste une préoccupation majeure lors de la construction en vitro . Par conséquent, il est urgent d’un système de construction efficace et réalisable cellule feuille.

Ce protocole décrit les étapes pour préparer une feuille de cellules multilayeredmesenchymal stem cell (MSC). Dans ce système de construction, la résistance mécanique de feuille de cellule est assurée par un DPP. Se fondant sur cet échafaudage, la structure cellulaire 3D peut être construite rapidement avec RAD16-j’ai hydrogel de peptide et un système de perfusion dynamique est utilisée pour la culture de la feuille de plusieurs couches de cellules, afin de stabiliser la structure de feuille 3D cell et de fournir une alimentation suffisante alimentation pour les cellules. Grâce à ce système, une feuille BMSC multicouche a été préparée avec succès et montre un effet thérapeutique optimal sur le rat infarctus du modèle13.

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Protocole

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Toutes les procédures de l’expérimentation animale et de cellules souches ont été réalisées selon les directives éthiques du Guide National pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvés par le Comité de l’urbanisme (Guangzhou, Chine) et de Jinan University animalier.

1. préparation de l’échafaudage DPP avec la PLA2 DÉCELLULARISATION méthode14

Remarque : Voir la Figure 1 a pour une représentation schématique de la méthode de DÉCELLULARISATION2 PLA.

  1. Préparer 100 mL de solution de2 200 U/mL PLA. Ajouter 0,5 g de désoxycholate de sodium et 2 mL de PLA2 dans 198 mL de solution tampon de carbonate. Cette solution devrait être utilisée dans les 24h après sa préparation.
  2. Obtenir le péricarde porcin fraîche (FPP) de l’abattoir et retourner au laboratoire de moins de 1 h.
    Remarque : Le FPP doit être conservé à 4 ° C durant le transport. 1.2-1.10 des mesures devraient être menées sous agitation continue dans un bain d’eau contrôlé par thermostat.
  3. Lavez soigneusement le FPP avec 200 mL de tampon phosphate (PBS) contenant 1 % de pénicilline-streptomycine dans un bécher de 500 mL à 10 ° Cpendant 10 min. Répétez cette étape 2 x.
  4. Le FPP scindée en deux couches et retirer le tissu adipeux avec pinces et ciseaux.
    Remarque : Conservez le FPP humide en ajoutant 50 mL de PBS toutes les 20 min lors du retrait du tissu adipeux.
  5. Façonner le FPP en morceaux de2 de 10 x 10 cm avec des ciseaux. Laver le FPP avec 200 mL de solution tampon de carbonate (CBS) contenant 1 % de pénicilline-streptomycine dans un bécher de 500 mL à 10 ° C pendant 10 min. Répétez cette étape 2 x.
  6. Transférer le FPP pure de l’eau et faire tremper à 10° C pendant 12 h.
  7. Faire tremper les2 échantillons de 10 x 10 cm dans 50 mL de CBS contenant 200 U/mL PLA2 et solution de désoxycholate de sodium 0,5 % (p/v) à 37 ° C pendant 6 h.
  8. Laver les échantillons avec CBS contenant 1 % de pénicilline-streptomycine à 10 ° C pendant 10 min. répéter cette étape 2 x.
  9. Tremper chaque échantillon dans 50 mL de CBS contenant 200 U/mL PLA2 et solution de désoxycholate de sodium 0,5 % (p/v) à 37 ° C pendant 2 h.
  10. Laver les échantillons avec CBS contenant 1 % de pénicilline-streptomycine à 10 ° C pendant 2 h. répéter cette étape pour x 10 au moins. Placer les échantillons dans des assiettes plates et les faire sécher à poids constant dans un four à température constante à 55 ° C.
    NOTE : L’échantillon doit être complètement sec. Peser l’échantillon DPP toutes les 10 min et le répéter 3 x ou jusqu'à ce que le poids n’est plus de changements.
  11. Façonner chaque échantillon DPP dans un cercle de 10,5 mm de diamètre avec un trépan. Emballez chaque DPP dans un sac scellé stérile.
  12. Stériliser les échantillons DPP par irradiation gamma (25 kGy). Stockés les échantillons DPP à 4 ° C avant utilisation.
    Remarque : Tous les échantillons peuvent être conservés pendant six mois à 4 ° C.

2. les préparations pour la cellule de feuille de Construction

  1. Stériliser tous les instruments et composants de support tissulaires à 121 ° C pour les dents de 30 min, y compris les tubes centrifuges de 1,5 mL, pinces, pinces, ciseaux, noir bases (composant de porteuse de tissu) et les bagues de tension blanc (composant de porteuse de tissu).
  2. Préparer 20 mL de solution de saccharose de 10 % sans germes. Poids 2 g de saccharose et dissoudre le saccharose dans 18 mL d’eau ultrapure. Autoclave la solution 10 % de sucrose à 121 ° C pendant 30 min ou filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µm.
  3. Stériliser les dispositifs de perfusion dynamique à 121 ° C pendant 30 min, y compris un gaz échangent des équipements, une bouteille de verre de 500 mL, un conteneur de culture de perfusion et les tubes conjonctives.
  4. Préparer les instruments stérilisés à l’autoclave et les tissus composants du transporteur. Mettre la pièce de base noire du transporteur le tissu dans une boîte de Petri.
  5. Ramasser un échafaudage DPP séché et mettez-le dans le centre de la base noire. Mettre une bague de serrage blanc sur l’échafaud DPP et fixez-le dans le support de tissu.
    Remarque : S’assurer que l’échafaudage est totalement fixe dans le support de tissu et il n’y a pas d’espace entre la base noire et la bague de serrage blanc. Si ce n’est pas le cas, séparer le transporteur de tissu et fixez l’échafaud encore.
  6. Ajouter 100 µL de milieu de culture sur l’échafaud DPP pour la réhydratation.
    Remarque : Si l’échafaudage n’est pas fixe dans le transporteur de tissu, le milieu de culture sera d’infiltrer la boîte de Petri.
  7. Mettez l’échafaud dans un incubateur à 37 ° C et laisser tremper pendant 15 min.

3. préparation des cellules pour cellule feuille Construction

Remarque : Ce protocole est pour la culture cellulaire à l’aide d’un plat de 100 mm. Voir Figure 1 b pour une représentation schématique de la construction de la structure plusieurs couches cellulaires.

  1. Isoler BMSC13.
    Remarque : Cette méthode est conçue pour la construction d’une feuille de cellules CSM multicouche. Rat BMSC est utilisés dans le présent protocole. Le BMSC est isolées en utilisant la méthode adhérentes de toute la moelle osseuse et le BMSC est élargis in vitro d’obtenir assez montant de cellule.
    1. Stériliser les instruments à 121 ° C pendant 30 min, y compris les pinces, pinces crantées et ciseaux. Préparer une seringue d’injection de 2 mL et le milieu de culture BMSC (Dulbecco modifié moyen [DMEM] de l’aigle, 10 % sérum de veau fœtal, glutamine 1 % et 1 % la pénicilline-streptomycine).
    2. Euthanasier les rats Sprague-Dawley (SD) mâles de trois semaines par luxation de vertèbre cervicale. Faire tremper l’animal dans 100 mL de solution d’alcool 75 % dans un bécher pendant 5 min.
    3. Sortir l’animal le bécher et placez-le sujets sur la table d’opération. Inciser la peau sur le dos de l’animal avec des ciseaux et pinces. Isoler les tissus de la peau et des muscles afin d’exposer les fémurs de la cuisse.
    4. Isoler les fémurs de la cuisse et le mettre dans 30 mL de PBS dans un tube à centrifuger 50 mL. Placez deux fémurs de cuisse dans un tube. Vortex le tube à centrifuger de se laver le tissu de fond. Répétez cette étape 2 x.
    5. Couper les deux extrémités du fémur avec des ciseaux et exposer la cavité de moelle osseuse.
    6. Aspirer 2 mL de milieu de culture BMSC avec une seringue à injection. Introduire l’aiguille dans la cavité de moelle et débusquer la moelle osseuse avec milieu de culture. Rincer chaque fémur deux cuisse dans une boîte de Petri de 100 mm.
    7. Pour chaque boîte de Petri de 100 mm, ajouter 2 mL de milieu de culture dans la boîte de Pétri. Mettre la boîte de Pétri dans l’incubateur de 37 ° C et de la culture statique pendant 72 h.
    8. Sortez de la boîte de Pétri de l’incubateur. Remplacer le liquide surnageant avec 6 mL de milieu de culture frais.
    9. Observer BMSC primaire sous un microscope. Suite à cela, le passage du BMSC tous les 5 à 7 jours.
  2. Prendre les cellules hors de l’incubateur. Observer des cellules au microscope et choisir les cellules appropriés pour la construction de cellule feuille. Quand le BMSC atteindre 80 % - 90 % confluence, les cellules peuvent être choisis comme les cellules ensemencées.
  3. Enlever le milieu de culture de la boîte de Pétri. Laver délicatement les cellules avec 2 mL de PBS chaud. Retirez tous les PBS de la boîte de Petri et faire reste bien sûr aucun liquide. Ajouter 2 mL de 0,25 % de trypsine (ou une autre solution de dissociation) au plat et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
  4. Arrêtez l’effet de la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de culture et laver délicatement les cellules du plat. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger 15 mL. Centrifuger les cellules à 225 x g pendant 5 min.
  5. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 3 mL de solution sucrée 10 % (p/v).
    NOTE : solution de sucrose à 10 % (p/v) est utilisée pour laver les cellules afin d’obtenir un mélange uniforme de cellule-hydrogel dans les étapes suivantes.
  6. Aspirer 10 µL de la suspension cellulaire et compter le nombre de cellule avec un hémocytomètre. Calculer le volume nécessaire pour la prochaine étape. Pour les tôles d’une seule cellule, BMSC 3 millions est utilisés.
  7. Extrait de 3 millions de cellules et de les transférer dans un nouveau tube à centrifuger 15 mL. Centrifuger les cellules à 225 x g pendant 5 min.
  8. Retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules avec 1 mL de solution sucrée 10 % (p/v). Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
    NOTE : À l’aide d’un tube centrifuge de 1,5 mL est bénéfique pour la préparation du mélange de cellule-hydrogel.
  9. Centrifuger les cellules à 260 xg pour 5 min. complètement éliminer le surnageant et obtenir le sédiment de la cellule.

4. préparation de la BMSC et le RAD16-je mélange Hydrogel Peptide

Remarque : Voir la Figure 1 b pour une représentation schématique de la construction de la structure plusieurs couches cellulaires.

  1. Ajouter 20 µL de solution de saccharose de 10 % (p/v) dans le tube centrifuge de 1,5 mL. Resuspendre le BMSC doucement et obtenir une suspension homogène.
    Remarque : Ne génèrent pas de bulles lors de la remise en suspension.
  2. Ajouter 20 µL de RAD16-j’ai peptide hydrogel en haut de la suspension. Remuer doucement le RAD16-j’ai suspension peptide et cellulaire avec l’embout de la pipette. Lorsque la suspension cellulaire et hydrogel sont mélangés ensemble, Pipetez doucement le mélange une couple de fois.
  3. Sortez de l’échafaud DPP par le transporteur de tissu et aspirer doucement le milieu de culture avec un embout de la pipette.
    Remarque : Assurez-vous que l’échafaud DPP est complètement réhydraté avant d’ajouter le mélange de la cellule-hydrogel.
  4. Aspirer le mélange et ajouter uniformément à l’échafaud DPP.
    Remarque : Le volume total du mélange serait d’environ 40-50 µL. Il est recommandé d’ajouter le mélange 10 µL à la fois du centre vers l’extérieur de l’échafaudage.
  5. Ajouter 1 mL de milieu de culture vers le bas de la porteuse de tissu. Mettre la plaque de cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min.
  6. Retirez la plaque de cellules de l’incubateur. Doucement, ajouter 4 mL de milieu de culture dans la boîte de Petri et plonger la feuille de la cellule. Mettre la plaque de cellules dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h de culture statique.

5. la Culture in Vitro d’une feuille de cellules multicouches 3D à l’aide d’un système dynamique de la Culture

Remarque : Voir la Figure 1 pour une représentation schématique du système dynamique 3D.

  1. Préparation du système de perfusion dynamique, y compris une pompe péristaltique, équipement de commutation de gaz, une bouteille de verre de 500 mL, un conteneur de culture de perfusion et les tubes conjonctives. Assemblage du système de perfusion dynamique tel qu’illustré à la Figure 2.
  2. Ajouter 200 mL de milieu de culture à la bouteille en verre stérile. Insérer la plaque de cellules dans la chambre du conteneur de culture.
    Remarque : Faites attention à la direction de la surface supérieure de la feuille de la cellule.
  3. Ajouter 3 mL de milieu de culture dans le conteneur de tissu et fermer le récipient. Mettre le système de perfusion dynamique dans l’incubateur et démarrer la pompe. Régler le débit de la pompe péristaltique à 8 mL/min. Culture la plaque de cellules dans le système de perfusion dynamique pendant 48 h.

6. l’obtention de la plaque de cellules multicouches MSC

  1. Stériliser les instruments et les composants de support tissulaires à 121 ° C pendant 30 min, y compris les tubes centrifuges de 1,5 mL, pinces et pinces crantées.
  2. Retirez le conduit d’entrée de la bouteille en verre pour arrêter la fourniture de milieu de culture pour le conteneur.
    Remarque : Arrêter la pompe péristaltique lorsque le récipient de culture est vide.
  3. Sortez la plaque du récipient de culture de cellules et le mettre dans une boîte de Petri.
  4. Utilisez une pince pour immobiliser le transporteur de tissus et d’utiliser une autre pince crantée pour détacher la bague de serrage blanc du fond noir. Enfin, obtenir la plaque de cellules BMSC multicouche.
  5. Pour la conservation courte, chaque feuille de la cellule peut être transférée dans un tube centrifuge de 1,5 mL avec la pince. L’échafaudage DPP doit être fixé à la paroi interne du tube centrifuge, et la feuille de la cellule doit se propager autant que possible dans le tube à centrifuger.
  6. Doucement, ajouter 1 mL de milieu de culture dans le tube centrifuge de plonger la feuille de la cellule. Fermer le bouchon du tube centrifuge et stocker la plaque de cellules à 4 ° C.
    Remarque : La feuille de la cellule doit être transplantée ou analysée dès que possible. Il est recommandé d’utiliser la plaque de cellules moins de 4 h.

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Résultats

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Le schéma de la construction de feuille de plusieurs couches de cellules souches est illustré à la Figure 1. Préparer l’échafaud de feuille cellulaire par la méthode de DÉCELLULARISATION PLA2 est la première étape. Basé sur l’échafaud, une structure de cellule 3D temporaire est construite en mélangeant les cellules souches à l’hydrogel de peptide RAD16-1. Afin d’obtenir une feuille de plusieurs couches de cellules avec des cellules souches favorabl...

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Discussion

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Le présent protocole rapporte une méthode efficace pour la construction d’une feuille MSC multicouche. Cette feuille de cellules présente une résistance mécanique optimale, la densité de semis cellulaire élevée et bioactivité favorable des cellules souches. En utilisant BMSC à titre d’exemple, la structure cellulaire 3D est rapidement construite avec RAD16-j’ai peptide hydrogel. Après cultivée dans le système de perfusion dynamique, la feuille BMSC multicouche est obtenue avec succès et le BMSC maintenir une forte expres...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéro de licence 31771064) ; la Science et la technologie de planification projet la Province du Guangdong (subvention numéros 2013B010404030, 2014A010105029 et 2016A020214012) ; la Science et la technologie de planification projet de Guangzhou (numéro de licence 201607010063) ; et l’Innovation de premier cycle et le programme de formation de l’esprit d’entreprise (numéro de licence 201610559028) ; la National Science Foundation des jeunes scientifiques de la Chine (nombre 31800819 de subventions).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Phospholipase A2Sigma-AldrichP6534
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750-100G
Tampon phosphateGibco BRL89033
Pénicilline streptomycine / amphotéricine  ;Gibco BRL15640055
Tampon bicarbonateSigma-AldrichC3041
Concentrateur de tableChangzhou Aohua Instrument Co.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Corning Cellgro10-014-CVR
Sérum de bovin fœtal sud-américain  ;Gibco BRL10270-106/P30-3302
L-GlutamineCorning Cellgro25-005-CI
0,25 % Trypsine/2,21 mM EDTACorning Cellgro25-053-CI
Enceinte de biosécuritéEsco,SingaporeAC2-2S1
Incubateur à température constante  ;Esco,SingaporeCLS-170B-8
Tube à centrifuger  ;Corning430790
EP tubeAxygen31617934
Machine centrifugeTOMOS1-16R  ;
SaccharoseSigma-AldrichS9378-500G
Pura Matrix  ;BD354250
Système de culture par perfusion dynamiqueMinucells et MinutissueD-93077
Pompe péristaltiqueIsmatecIPC N8
Tube de pompeIsmatecNr.1306
MINUSHEET 1300  ;de Ratisbonne  ;
Système deRatisbonne  ;
MINUSHEET 0006Échangeur de gaz de Ratisbonne  ;
MINUSHEET 0002Ratisbonne500 mL bouteille en verre  ;
Conteneur de culture par perfusionMINUSHEET 1301
KT20183Composants du transporteur de tissus perfusion dynamique MINUSHEET

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Mesenchymal Stem Cell Sheet3D Dynamic Culture SystemDecellularized Porcine PericardiumBone Marrow Mesenchymal Stem CellsRAD16 I Peptide HydrogelDynamic Perfusion SystemCell Sheet ScaffoldStem Cell BioactivityMultilayered Cell StructureStem Cell Viability

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