Mesure du métabolisme énergétique chez Explanté tissu rétinien en utilisant l’analyse de Flux extracellulaire

Résumé

Cette technique décrit enregistrement en temps réel de la consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire dans les tissus rétiniens explantés souris à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire.

Résumé

Vision de l’acuité élevée est un processus fortement consommateurs d’énergie, et la rétine a développé plusieurs adaptations uniques pour répondre précisément à ces exigences tout en conservant la transparence de l’axe visuel. Perturbations à cet équilibre délicat causent des maladies aveuglantes, telles que la rétinopathie diabétique. Par conséquent, la compréhension des changements de métabolisme énergétique de la rétine au cours de la maladie est impérative pour le développement de thérapies rationnelles pour diverses causes de perte de vison. L’avènement récent des analyseurs de flux extracellulaire disponible dans le commerce a fait l’étude du métabolisme énergétique rétinien plus accessible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un tel analyseur pour mesurer la contribution à l’approvisionnement énergétique rétinien par l’intermédiaire de ses bras deux principe - la phosphorylation oxydative et la glycolyse - en quantifiant les changements dans les taux de consommation d’oxygène (OCR) et extracellulaire taux d’acidification (ECAR) comme proxy pour ces voies. Cette technique est facilement réalisée dans le tissu rétinien explanté, facilitant l’évaluation des réponses à plusieurs agents pharmacologiques dans une expérience simple. Métaboliques signatures dans la rétine des animaux dépourvus de signalisation de photorécepteur tige sont comparés aux contrôles de type sauvage à l’aide de cette méthode. Une limitation majeure de cette technique est le manque de capacité d’établir une distinction entre l’utilisation de l’énergie lumière adaptés et adapté à l’obscurité, un facteur physiologique important dans le tissu rétinien.

Introduction

La rétine est parmi les plus énergivores tissus dans le système nerveux central¹. Comme la plupart des tissus, il génère l’adénosine triphosphate (ATP) via la glycolyse dans le cytosol ou via la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. L’avantage énergétique de la phosphorylation oxydative au cours de la glycolyse pour produire de l’ATP d’une molécule de glucose est clair : 36 molécules d’ATP générées par l’ancien vs 2 molécules d’ATP générée à partir de ce dernier. En conséquence, les neurones rétiniens dépendent principalement de la respiration mitochondriale pour l’approvisionnement en énergie et cela se reflète par leur forte densité des mitochondries,². Pourtant, la rétine aussi repose largement sur machines glycolytique même lorsque l’oxygène est abondante. Ce processus de glycolyse aérobie a été initialement décrite dans les cellules cancéreuses par Otto Warburg³, qui une fois a noté que la rétine est le seul post-mitotique tissu capable de cette forme de métabolisme⁴. Depuis ces premières observations, plusieurs tissus post-mitotiques ont été décrites pour se livrer à des degrés divers de la glycolyse en plus de la phosphorylation oxydative à répondre à leurs demandes d’ATP.

Phototransduction, pigment visuel recyclage, biosynthèse des segments externes des photorécepteurs et l’activité synaptique sont tous les processus exigeants de l’énergie dans les photorécepteurs, la sous-classe neuronale prédominante dans la rétine. Mais la nécessité de transporter activement des ions contre leur électriques et des gradients de concentration est de loin le plus énergiquement de votre processus en neurones¹. Photorécepteurs sont des neurones particulières en ce sens qu’ils sont dépolarisés en l’absence de stimulation (c'est-à-dire, dans l’obscurité), alors qu’un stimulus lumineux déclenche la fermeture du chenal et l’Hyperpolarisation ultérieure. Par conséquent, dans l’obscurité, la rétine consomme de grandes quantités d’ATP pour maintenir sa dépolarisation ou « courant d’obscurité » comme on l’appelle communément. D’un point de vue adaptatif, un défi majeur dans la fourniture de ces énormes quantités d’ATP est la nécessité pour les organismes à maintenir une clarté visuelle par le biais de l’axe optique. L’architecture rétinienne inversé vu dans créatures modernes est la solution dominante, car il maintient le réseau capillaire dense fournissant des photorécepteurs de la voie de la lumière. Mais cette merveille du génie biologique naturel met la rétine à bord d’un précipice en termes de réserve métabolique. Même les petites insultes à la rétine peuvent potentiellement perturber l’équilibre délicat de l’approvisionnement énergétique de la demande, et la dysfonction visuelle ou cécité franche peut s’ensuivre rapidement.

Étant donné l’unique avec les besoins énergétiques de la rétine neuronale, couplée à sa restriction serrée d’approvisionnement vasculaire, une mesure précise de la consommation d’ATP dans la rétine et ses changements au cours de la maladie pourrait avoir de profondes implications dans la compréhension et le traitement aveuglante d’affections comme la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Traditionnellement, ces mesures nécessitent des équipements coûteux, conçus avec la plupart des études qui sortent d’une poignée de laboratoires entièrement dédié aux mesures de l’activité métabolique^{2,5,6, 7,8}. Les techniques comprennent des essais individuels pour les métabolites spécifiques, études par traceurs utilisant les précurseurs marqués radio, consommation d’oxygène d’enregistrement à l’aide d’électrodes de Clark et métabolomique profilage⁹.

Grâce aux progrès des technologies de haut débit et une disponibilité accrue des appareils commerciaux, techniques au métabolisme rétinien record sont toujours plus accessible et abordable. La méthode décrite ici permet de mesurer tant la phosphorylation oxydative et la glycolyse dans l’utilisation de la rétine explantées tissus et un flux extracellulaire disponible dans le commerce analyseur^9,10,11,12. Cet analyseur enregistre séparément les taux de consommation d’oxygène (OCR) et le taux d’acidification extracellulaire (ECAR), servant d’indicateurs indirects de la phosphorylation oxydative et de la glycolyse, respectivement¹³. Ces mesures sont effectuées par une sonde immergée dans un microchamber créé sur le tissu d’intérêt. Cette adaptation de méthodes publiées antérieurement utilise une plaque de capture initialement conçue pour le pancréas, îlots de Langerhans pour enregistrer l’activité métabolique en petites sections circulaires de rétine de souris. Des expositions pharmacologiques multiples peuvent être livrées au tissu au cours d’un enregistrement unique, car le système contient 4 ports d’injection pour chaque échantillon bien. Grâce à ce système avec des protocoles distincts optimisés pour les enregistrements ECAR et OCR, les réponses des rétines sauvage peuvent être comparés aux rétines manque tbl1xr1 (Gnat1^{- / -}), des causes de cécité nocturne stationnaire congénitale en les humains¹⁴.

Protocole

Protocoles de suivi de l’Association pour la recherche en Vision et ophtalmologie énoncé sur l’utilisation des animaux et ont été approuvés par l’Université de Washington.

1. la préparation animaux

1. Garder animaux dans le logement standard avec un 12 heures sombres au cycle de lumière de 12 heures. Begin expériences à normalisés afin d’éviter les effets circadiennes, généralement le matin, peu après les lumières sont allumées.

2. préparation de la solution

1. Préparer la base médias en dissolvant 8,4 mg de poudre médias bidistillée H₂O (ddH₂O) et ajuster le pH à 7,4 avec HCl ou NaOH, pour un volume final de 1 L. filtre stériliser cette solution avec un filtre de vitroplants de 0,22 µm.
   1. Ajouter 1 M de glucose et de pyruvate de sodium 100 mM aux médias pour atteindre la concentration finale de 5 mM de glucose et de pyruvate de 1 mM.
   2. Place une portion de 50 mL de base médias dans un bain-marie à 37 ° C.
2. Préparer la solution de lyse, pour le dosage de tissus à la fin de l’analyse de flux, en ajoutant tris base à 10 mM, éther de polyéthylèneglycol tert-octylphényle à 0,2 % (v/v) et EDTA 1 mm, tous en FD₂Mix O. jusqu'à ce que tous les composants complètement dissous et ajuster pH 8.0.
3. Pour le protocole de stress mitochondrial, préparation d’un stock de 11 µM de l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP Synthase, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparation d’un stock de 11 µM de cyanure de carbonyle - 4-(trifluorométhoxy) phénylhydrazone (FCCP), un agent découplant, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de 1 µM dans le puits. Préparer un cocktail des inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons, la roténone et l’antimycine A (RAA) en ajoutant la roténone à 11 µM et l’antimycine A à 22 µM, dissous dans la base médias pour cibler une concentration finale de roténone 1 µM et 2 µM antimycine A dans le bien.
4. Pour le protocole de la glycolyse, préparation d’un stock de 220 mM de glucose dissous dans les médias de base, de cibler une concentration finale de 20 mM dans le puits. Aussi, préparer un stock de 1,1 M de 2-désoxyglucose (2-DG), un inhibiteur compétitif de la glucose et antagoniste de la glycolyse, en dissolvant dans les médias de base. Cela s’adressera à une concentration finale de 100 mM 2-DG dans le puits.

3. instrument Calibration

1. Pour calibrer les instruments pour une analyse de flux extracellulaire, ajouter 1 mL de solution d’étalonnage pour chaque puits de la cartouche de capteur (total de 24 puits) et incuber à 37 ° C dans un CO₂-libre incubateur pendant la nuit (ou au moins 8 h).
2. Charger des additifs pour le stress mitochondrial ou le protocole de la glycolyse dans chaque port de l’injecteur, A à D, de la cartouche de sonde, ajustement pour les changements de volume dans le puits.
   Remarque : À titre d’exemple, un essai typique comprend 45 µL d’un additif dans le premier port de l’injecteur, 49,5 µL dans le second, 54,5 µL dans la troisième et 60 µL dans le dernier, en supposant un volume bien initial de 450 µL.
3. Pendant les premières expériences de plusieurs, charger base médias dans port A de mesurer combien le tissu mouvement/artefact se produit après une injection de port.
4. Laissez la plaque de capteur chargé à incuber à 37 ° C dans une étuve à non-CO₂ pendant au moins 60 min.

4. isolement des frais souris tissu rétinien

Remarque : Cette étape est une adaptation de la technique du Dr Barry Winkler¹⁵.

1. Après avoir fait une anesthésie profonde à l’aide d’un cocktail de kétamine/xylazine standard, euthanasier souris par dislocation cervicale.
2. Utilisez une paire de pinces courbes moyennes pour saisir le monde postérieur au nerf optique et exercez une légère pression vers l’avant à proptose l’oeil (Figure 1 a).
   1. Avec une lame de rasoir propre, créer une incision de limbe à Limbe à travers la cornée à l’aide d’un pass unique et délibéré de la lame.
   2. À l’aide de très bien, angle pince McPherson-style, pincer le globe postérieur pour exprimer l’objectif et les membranes hyaloïde antérieures hors de l’incision cornéenne. Jetez ces tissus.
   3. Répétez la manœuvre pincement avec une pince pour exprimer la rétine neurale.
   4. À l’aide de la pince comme une cuillère pour soulever la rétine, plutôt que de saisir le tissu, transférer la rétine loin de l’incision cornéenne et déposez directement dans les médias chauds dans un plat de 3 cm ou une plaque de cluster 6 puits culture de tissus.
3. Utiliser deux paires de pinces de type McPherson fine, inclinée à disséquer doucement restant vitré de la rétine. C’est mieux fait en saisissant le corps vitré à la périphérie de la rétine coupe et en tirant vers le centre, avec un disinsertion final du corps vitré du centre dans son ensemble. À l’aide de la pince, retirez tout épithélium pigmentaire rétinien résiduel de la surface des photorécepteurs de la rétine.
   1. Couper un embout P1000 avec une lame de rasoir pour créer une ouverture d’environ 4 mm afin d’éviter un traumatisme abusif le tissu rétinien délicat lors des manoeuvres de transfert.
   2. Transvaser le tissu rétinien isolé dans les supports neufs en utilisant un embout de pipette P1000 coupé.
   3. Couper les poinçons de 1 mm de la rétine autour du nerf optique avec une biopsie de 1 mm punch équipé d’un piston pour déloger le tissu dans le cas où il se loge dans le trou (Figure 1 b). Définissez les poinçons rétiniennes côté dans les médias propres détenus dans un bloc de 37 ° C ou coussin chauffant.

5. protocole

1. Transfert individuels poinçons à une îlot de 24 puits capture microplaque utilisant un embout P1000 coupé, aspirer 450 µL de médias ainsi que le tissu.
2. Utiliser correctement, pinces droites pour manipuler doucement les coups de poing au centre de la microplaque. Garder les poinçons orientées dans le même sens (p. ex., ganglion cell côté vers le haut).
   1. Reposer la plaque de capture sur un coussin chauffant ou chauffage bloc réglé à 37 ° C que ces étapes sont répétées pour les échantillons restants.
      Remarque : Pour chaque expérience, mis de côté 3-4 puits vides avec 450 µL de base médias pour servir de témoins négatifs. Dans les autres puits de 20-21, tester chaque réplicat biologique en trois exemplaires. Par conséquent, chaque plaque 24 puits permettra pour l’enregistrement de 6-7 différents animaux ou des conditions de traitement.
3. En évitant les bulles d’air, position doucement l’îlot prendre des inserts en mesh dans chaque puits à l’aide de pinces et de sécuriser les inserts avec une tige métallique ou avec un embout P1000 coupe (Figure 1 C).
   Remarque : Éviter la circulation excessive des tissus au cours de cette étape de maintenir la position de punch rétinienne au sein du centre de l’échantillon microchamber. Bulles d’air gravement faussent la lecture OCR. Bien que le microchamber a une profondeur suffisante pour accueillir la rétine de souris typique (Figure 1), parfois d’usinage-défauts dans les inserts en mesh peuvent causer les tissus deviennent trop compressée lors de l’insertion de l’écran. Si cela se produit, simplement prendre note des tissus broyés et exclure que l’échantillon de l’analyse finale.
4. Incuber la plaque de tissu dans un 37 ° C CO₂-incubateur libre pendant au moins 60 min.
5. L’analyseur de flux extracellulaire à l’aide de Mix, attendre, mesure du programme et répétez les commandes. À titre d’exemple, une expérience typique avec tissu rétinien peut inclure ce qui suit : mélanger 2 minutes, attendre 2 minutes et mesurer 5 minutes. Répétez l’expérience avec ces trois étapes entre 5 - 8 fois (cycles) pour un enregistrement de base et après l’injection de chaque composé testé pendant la course.
6. Appuyez sur le bouton de démarrage de programme sur l’analyseur de flux extracellulaire et suivez les instructions à l’écran pour insérer la cartouche de sonde pour l’étalonnage.
7. À la fin de l’étalonnage, suivez les instructions à l’écran pour remplacer la plaque calibrant avec la plaque contenant les échantillons rétiniennes.
8. Autoriser le programme à exécuter, comme programmé. À la fin de la course, suivez les instructions à l’écran pour éjecter la plaque de tissu. Afficher les résultats de la course et stocker le fichier de données.
9. Avec une aiguille de calibre 20 tordue et forceps, supprimer tous les inserts en mesh provenant des puits, abandonnant le poinçon rétiniens.
10. Aspirer les médias du tissu avec précaution et laver le tissu deux fois avec 0,5 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Aspirer le PBS après le lavage.
11. Ajouter 100 µL de tampon de lyse dans chaque puits et la pipette up et down pour homogénéiser les tissus.
12. Quantifier les niveaux d’entrée basés sur l’ADN double brin (dsDNA) total ou de la teneur totale en protéines.
    Remarque : Ce qui suit est basé sur un test ADN double brin disponibles dans le commerce.
13. Diluer les échantillons lysés 1:1 en ajoutant 100 µL de tampon Tris-EDTA (TE) et transférer 100 µL de l’échantillon dilué dans une plaque 96 puits.
    1. Ajouter 100 µL de tampon de détection dans chaque puits. Après le mélange pendant 2-5 minutes, quantifier la fluorescence après excitation à 480 nm et d’émission à 520 nm, en comparant à une courbe d’étalonnage.
    2. Normaliser le traçage de flux extracellulaire brutes à la teneur en ADN dans le puits.
       Remarque : Dans les résultats présentés ici, les échantillons sont normalisées à 50 ng dsDNA - une quantité typique dans un coup de poing rétinienne de 1 mm. Par conséquent, les valeurs absolues présentées ici peut être comparés à études présentant des données « par punch rétinienne ». Normaliser les tracés d’un étalon interne, telles que la ligne de base run à une concentration de glucose de 5 mM.

Résultats

En utilisant les techniques décrites (résumées dans la Figure 1), les explants rétiniennes de 8 semaines sauvage (WT) souris ont été comparés aux appariés selon l’âge et le fond de tbl1xr1 souris null (Gnat1^{- / -}). Parce que Gnat1^{- / -} les animaux n’ont pas les machines à fermer canaux ioniques en réponse à des stimuli lumineux sensibles au nucléotide cyclique, les photorécepteurs de la tige restent dépolarisée...

Discussion

OCR et ECAR sont facilement mesurable en tissu rétinien explanté, à l’aide d’un bioanalyzer en utilisant les techniques décrites. Cette méthode diffère de celles des autres groupes en plusieurs étapes cruciales. Les tissus rétiniens sont isolées à travers une large incision cornéenne sans enucleating du globe, qui avaient été initialement décrit par Winkler,¹⁵. Cette méthode d’isolement rétinienne permet un transfert rapid de le œil de la vie dans la plaque de capture de tissu (souvent dans les 5 ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF24	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (comprend : microplaque de capture d’îlots, cartouche de capteur et solution d’étalonnage)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Comprend une microplaque de capture d’îlots, une cartouche de capteur et une solution d’étalonnage
RPMI 1640 Média (milieu en poudre)	Millipore-Sigma	R1383	Milieux RPMI 1640 avec L-Glutamine et sans glucose ni bicarbonate de sodium
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtré, pour la préparation des milieux
Pyruvate de sodium	Corning	25000CI	100 mM pyruvate de sodium
Antimycine-A	Millipore-Sigma	A8674	Composant du protocole de stress mitochondrial
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Composant du protocole de stress mitochondrial
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Composant du protocole de stress mitochondrial
2-désoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Composant du protocole de glycolyse
1 mm Biopsie cutanée poinçons avec piston	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Outil d’explantation de tissu rétinien
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Outil d’implantation de tissu rétinien
Dumont Medical #5/45 Forceps - Incliné à 45 degrés	Outils de science fine	11253-25	Outil d’implantation de tissu rétinien
Dumont #7 Forceps - Outils de	science fine	11271-30	Outil d’implantation de tissu rétinien
Quant-iT Picogreen dsDNA Kit de dosage	Fisher Scientific	P7589	Essai de
normalisation de chargementBase Trizma (base Tris)	Millipore-Sigma	T6066	Composant du tampon de lyse
Triton X-100 (polyéthylène glycol tert-octylphényl éther)	Millipore-Sigma	X100	Composant du tampon de lyse
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Composant du tampon de lyse
C57BL/6J souris  ;	Jackson Laboratories	; Souches 000664	Animaux
Gnat1-/- et Gnat1+/+  ;	Vladimir Kefalov, Ph. D. ; École de médecine de l’Université de Washington	Animaux