Ce protocole décrit un flux de travail détaillé pour la génération et ex vivo de caractérisation des virus oncolytiques pour l’expression des immunomodulateurs, en utilisant le codage bispécifiques lymphocytes T recruteurs comme un exemple de virus de la rougeole. Application et l’adaptation à d’autres plates-formes de vecteur et les transgènes vont accélérer le développement de nouveaux immunovirotherapeutics pour la traduction clinique.
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Article de méthode
Paramyxovirus pour tumeur ciblées Immunomodulation : conception et évaluation Ex Vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
Immunothérapie des cancers réussie a le potentiel pour obtenir un contrôle tumoral à long terme. Malgré des succès cliniques récentes, il reste un besoin urgent de traitements sûrs et efficaces adaptés aux profils immunitaire de chaque tumeur. Virus oncolytiques permettent l’induction de la réponse immunitaire anti-tumorale ainsi que l’expression des gènes de tumeur restreints. Ce protocole décrit l’analyse de génération et ex vivo des immunomodulateurs oncolytiques vecteurs. En se concentrant sur les virus de la rougeole vaccin encodage bispécifiques lymphocytes T recruteurs à titre d’exemple, la méthodologie générale peut être adaptée à d’autres espèces de virus et de transgènes. Le flux de travail présenté comprend la conception, clonage, sauvetage et la propagation des virus recombinants. Dosages pour analyser la cinétique de la réplication et l’activité lytique du vecteur, ainsi que des fonctionnalités de l’isolé immunomodulateur ex vivo sont inclus, ce qui facilite la génération de nouveaux agents de développement dans les modèles précliniques et finalement traduction clinique.
Introduction
Virus oncolytiques (OVs) sont développés comme des thérapies de lutte contre le cancer qui spécifiquement répliquer au sein et tuer les cellules de la tumeur tout en conservant les tissus sains intacts. Il est devenu commun de comprendre cette virothérapie oncolytiques (OVT), dans la plupart des cas, ne repose pas uniquement sur la lyse tumorale complète en réplication efficace et la diffusion du virus, mais exige des mécanismes supplémentaires d’action pour la réussite du traitement, y compris vasculaire et stromales ciblage et, surtout, la stimulation immunitaire1,2,3,....
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Protocole
Remarque : [O], [P] et [M] indiquent les paragraphes applicables à : OVs en général, (la plupart) paramyxovirus ou MV, respectivement. [B] indique les sections spécifiques pour BTE transgènes.
1 clonage de transgènes codant immunomodulateur en vecteurs de Virus de la rougeole
-
[O] conception insérez la séquence.
- [O] choisir un immunomodulateur d’intérêt basé sur la recherche dans la littérature ou sur exploratoire des données tels que les écrans génétiques41 et dérivent la séquence d’ADNc pertinents des bases de données appropriées telles que GenBank, l’European A....
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Résultats
La figure 1 illustre le mécanisme d’action du virus de la rougeole oncolytiques encodage bispécifiques recruteurs de lymphocytes T. Un organigramme illustrant le flux de travail de ce protocole est présenté à la Figure 2. Figure 3 illustre un exemple d’un génome de virus de la rougeole oncolytiques modifiés. Cela fournit une représentation visuelle des changements spécifiques appliq.......
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Discussion
Oncolytique immunothérapie (i.e., OVT en combinaison avec l’immunomodulation) est très prometteur pour le traitement du cancer, exigeant davantage développement et optimisation de virus oncolytiques codant des protéines immunomodulatrices. Ce protocole décrit les méthodes pour générer et valider ces vecteurs pour contrôle ultérieur dans des modèles précliniques appropriés et potentielle future traduction clinique en nouveaux traitements contre le cancer.
Nombreuses plates-formes de vi.......
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Déclarations de divulgation
C.E. Engeland est répertorié comme co-inventeur d’un brevet en ce qui concerne les virus à ARN pour Cancer Immunovirotherapy appartenant à l’Université de Heidelberg. J.P.W. Heidbuechel n’a rien à divulguer.
Remerciements
Ces méthodes ont été établies dans le groupe virothérapie dirigé par Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts au Centre National pour les maladies tumorales à Heidelberg. Nous sommes reconnaissants envers lui et tous les membres de l’équipe du laboratoire, en particulier le Dr Tobias Speck, le Dr Rūta Veinalde, Judith Förster, les Birgit Hoyler et que les Jessica Albert. Ce travail a été soutenu par l’autre Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 à C.E. Engeland) et l’allemand National Science Foundation (DFG, accorder EN 1119/2-1 à Engeland C.E.). J.P.W. Heidbuechel reçoit une allocation de la Helmholtz International Graduate School for Ca....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Rapid DNA Dephos & Kit de ligature | Roche Life Science, Mannheim, Allemagne | 4898117001 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit Thermo | Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne | A9539-500G | |
| QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN | , Hilden, Allemagne | 28704 | |
| NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, Allemagne | C3019I | |
| LB moyen d’après Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | X964.1 | |
| Ampicilline | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Allemagne | 27104 | |
| Enzyme de restriction HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Francfort-sur-le-Main, Allemagne | R3104S | |
| Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Allemagne | 31966-021 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, Mannheim, Allemagne | E2311 | peut être remplacé par le réactif de transfection de choix |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne | K0129 | |
| Cellules Vero | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
| B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | disponible sur demande | |
| Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Allemagne | ACC 342 | |
| Opti-MEM (milieu sans sérum) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Allemagne | 31985070 | |
| Cellule colorimétrique Le kit de viabilité III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Allemagne | PK-CA20-300-1000 | comprend le réactif XTT |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de DulbeccoGibco | Life Technologies, Darmstadt, Allemagne | 14190-094 | |
| Colonnes de centrifugation QIAquick Ni-NTA | QIAGEN, Hilden, Allemagne | 31014 | |
| Chlorure de sodium | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | 3957.3 | |
| Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Allemagne | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 ; kDa | Merck, Darmstadt, Allemagne | UFC901024 | |
| BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
| IgG à partir de sérum humain | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-092-257 | RRID : |
| AB_871939 Souris IgG1, contrôle des isotypes kappa, conjugué à la phycoérythrine, clone MOPC-21 anticorps | BD Biosciences, Heidelberg, Allemagne | 555749 | RRID : AB_396091 |
| Anticorps anti-HA-biotine, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne | 12158167001 | RRID : AB_390915 |
| Microbilles anti-biotine | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-090-485 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-042-201 | |
| Séparateur MiniMACS | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne | 130-042-303 | |
| Tampon RIPA | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pennsylvanie, États-Unis | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 Essai de cytotoxicité non radioactive | Promega, Mannheim, Allemagne | G1780 | comprend une solution de lyse 10x, une solution de substrat (mélange de substrat et tampon de dosage) et une solution d’arrêt |
| Élévateur de cellules | Corning, Reynosa, Mexique | 3008 | |
| Boîtes de 10 cm | Corning, Oneonta, NY, États-Unis | 430167 Boîtes de | |
| 15 cm | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Allemagne | 639160 | |
| Plaques à 96 puits, Fond en U | TPP, Trasadingen, Suisse | 92097 | |
| Plaques à 96 puits, fond plat | Neolab, Heidelberg, Allemagne | 353072 | |
| Plaques à 6 puits | Neolab, Heidelberg, Allemagne | 353046 | |
| Plaques à 12 puits | Neolab, Heidelberg, Allemagne | 353043 | |
| Tubes de 50 mL | nerbe plus, Winsen/Luhe, Allemagne | 02-572-3001 | |
| Fioles de culture cellulaire T175 | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
| 0.22 & micro ; m filters | Merck, Darmstadt, Allemagne | SLGPM33RS |
Références
- Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
- Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of....
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Réimpressions et autorisations
