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Article de méthode

Évaluations comportementales de Locomotion spontanée dans un modèle murin induite par le MPTP la maladie de Parkinson

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DOI :

10.3791/58653

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7 janvier 2019

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1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai University

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons la mise en place d’un modèle murin de la maladie de Parkinson à l’aide de MPTP et les évaluations comportementales à l’aide de bouteilles et des essais pour mesurer la fonction motrice. Nous utilisons ensuite la L-DOPA à titre d’exemple pour montrer comment appliquer ce modèle dans l’étude des drogues de PD.

Résumé

Maladie de Parkinson (MP) est une maladie courante de troubles neurodégénératifs, provoquant le phénomène des tremblements, la rigidité, la lenteur du mouvement et de la démence. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) peut conduire à certains symptômes de Parkinson en détruisant certains neurones dans la substantia nigra du cerveau. Elle a été ainsi utilisée pour établir des modèles PD dans diverses études sur les animaux. Ici, souris reçoivent des injections de MPTP (20 mg/kg/jour) pendant sept jours et les tests comportements sont effectuées sur le huitième jour. Ce modèle est une adaptation efficace dans l’étude de PD. Les tests comportements ici comprennent le test du cylindre et le test de plein champ. L’expérience de la bouteille est utilisée pour détecter la capacité des animaux à lever leurs pattes avant fois mis dans un environnement différent. Comme le parti démocrate souris modèle show arquées — la souris arches le dos — le nombre de diminution de chargements de patte. Ce test est facile à exécuter. Le test de plein champ est utilisé pour détecter la quantité de temps que passent les souris sur la course, marche et restant immobile. Nous analysons les mouvements des animaux en plein champ à l’aide de logiciels et obtenir des données. Enfin, nous utilisons la L-DOPA, un des plus couramment drogues PD, à titre d’exemple pour montrer comment appliquer ce modèle à l’étude des drogues de PD. Nos résultats indiquent que la neurotoxicité MPTP induit un déficit moteur qui peut être atténué par la L-DOPA.

Introduction

La maladie de Parkinson (MP), une des maladies plus fréquentes chez les personnes âgées, en est une à long terme neurodegenerative disorder1. Les patients présentent toujours le phénomène des tremblements, la rigidité, la lenteur du mouvement et de la démence qui s’aggravent au fil du temps2. D’autres symptômes y compris sensorielle, sommeil et problèmes émotionnels sont aussi couramment observé2. La cause du Parkinson n’est pas encore claire, mais il est généralement admis d’impliquer des facteurs génétiques et environnementaux, qui induisent la perte des neurones dopaminergiques de la substantia nigra3et le développement du corps de Lewy et Lewy neurites dans diverses régions de la cerveau4.

Parmi les études de PD, 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 est adapté largement à recréer certains symptômes de PD sur des modèles expérimentaux. En 1984, Langston et coll. a tout d’abord constaté que des injections de MPTP chez des singes écureuils produisaient parkinsonisme6. Bien que le modèle de rongeur MPTP ne montre pas la présence de corps de Lewy, qui est le biomarqueur de PD, PFMP provoque symptômes de Parkinson en détruisant certains neurones dans la substantia nigra du cerveau7. Comparé à autre modèle de drogue pour PD telles que celles induites par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA)8 et 1-méthyl-4-phénylpyridinium (MPP +)9, injection du MPTP est facile à exécuter et le modèle MPTP prend moins de temps. Souris reçoivent des injections de MPTP (20 à 30 mg/kg/jour) pour sept jours et les tests comportements sont exécutés sur le huitième jour10.

Le test de plein champ11 a été développé par Calvin S. Hall, un américain de12. Dans diverses études, différents types de comportements sont testés. Dans la recherche qui met l’accent sur les maladies de Parkinson, des comportements comme activités de locomotion et la vitesse de locomotion sont testées pour vérifier si la capacité de l’animal de se déplacer est concernée. Par rapport aux autres méthodes utilisées pour tester la mise en place des animaux de PD, test de terrain dégagé est facile à réaliser car le matériel nécessaire est simple, et prototypage et données logiciels d’analyse (p. ex., MATLAB, Excel) peut être utilisé pour collecter et graphique facilement le données. En outre, le coefficient de variation est relativement faible13, ce qui signifie que le résultat de test de terrain dégagé est fiable. Un autre avantage sur les autres méthodes, c’est que les comportements inclus dans cette expérience sont faciles à distinguer ; les souris peuvent être en cours d’exécution, la marche ou immobile. Généralement le test de plein champ peut être utilisé sur les rongeurs lorsque le chercheur doit évaluer la mobilité du sujet.

Le test du cylindre est aussi appelé le test d’utilisation asymétrique des membres antérieurs. Lorsque ce test a été conçu tout d’abord, il a été utilisé pour tester l’utilisation asymétrique de ses pattes avant14 de la rat. Ici, nous utilisons cet essai pour analyser la capacité de l’animal à s’étirer et à utiliser à la fois de ses pattes avant pour explorer de nouveaux environnements. Lorsque la substantia nigra et corpus striatum sont endommagées par le MPTP dans le cerveau, l’animal a tendance à cambrer son dos et devienne moins enclins à s’étirer et explorer le milieu inconnu. Ce test est facile à exécuter et peut donner un résultat préliminaire. Toutefois, ce test a une variabilité interne élevée, elle est généralement utilisée avec ainsi que d’autres expériences de comportement.

Prise de L-DOPA, qui est également connu comme la lévodopa ou L-3, 4-dihydroxyphénylalanine, est un moyen courant pour traiter la maladie de Parkinson depuis une des causes du PD sont la diminution de la dopamine dans le. L-DOPA est le précurseur de la dopamine. Mais contrairement à la dopamine, il peut traverser la barrière hémato - encéphalique, ce qui signifie qu’il sera plus efficace en augmentant la concentration de dopamine dans la région du cerveau. Après qu’il franchit la barrière hémato - encéphalique, L-DOPA est convertie en dopamine par L-amino-acide décarboxylase15.

Here we describe the measurement and analysis of motor function in MPTP-induced-PD model mice using a cylinder test14 and a modified open field test. Nous administrons la L-DOPA à titre d’exemple pour montrer comment appliquer ce modèle dans l’étude des drogues de PD. Nos résultats indiquent que les PFMP induit un déficit moteur qui peut être atténué par la L-DOPA.

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Protocole

Cette étude a été effectuée conformément aux normes internationales, nationales et institutionnelles tenant compte de l’expérimentation animale. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité de l’éthique animale de l’Université de Nankai.

1. PFMP et L-DOPA administration

Remarque : Les souris femelles BALB/c de dix semaines ont été fournies par l’Institut de zoologie de l’Académie chinoise des Sciences. Les souris étaient logés six par cage sous un cycle lumière/obscurité de 12 h (lampes allumées à 08:00-20:00), à une température constante de 21-22 ° C et une humidité relative de 55 % ± 5 %. Chow autoclavés souris standard de la formulation et l’eau même ad libitum a été donné à tous les animaux.

  1. Après une semaine d’acclimatation, diviser les animaux en trois groupes de six souris chaque.
  2. Groupe 1, administrer des injections intrapéritonéales (voir l’étape 1.5) de 250 µL/souris/jour de solution saline du jour 1 au jour 7, puis effectuez l’administration intragastrique (voir étape 1.6) de 250 µL/souris de solution saline sur le jour 8.
  3. Groupe 2, administrer des injections intrapéritonéales de 20 mg/kg/jour de MPTP tous les jours du jour 1 au jour 7 puis exécutez administration intragastrique de 250 µL/souris de solution saline sur le jour 8.
  4. Groupe 3, administrer des injections intrapéritonéales de 20 mg/kg/jour de PFMP du jour 1 au jour 7 puis exécutez administration intragastrique de 5 mg/kg de L-DOPA le jour 8.
  5. Effectuer l’injection intrapéritonéale comme suit.
    1. Charger la drogue dans une seringue stérile 1 mL avec une aiguille de 26 G. Éliminer l’air de la seringue.
    2. SCRUFF la souris avec le ventre vers le haut. Garder la tête, le cou et le corps de la souris dans une ligne droite aussi bien avec la tête fixée.
    3. Angle de l’aiguille pour pénétrer dans le péritoine. Pousser l’aiguille sur une bonne distance jusqu'à ce qu’il y a peu de résistance et ensuite injecter le médicament. Retirer l’aiguille en douceur.
  6. Effectuez l’administration intragastrique comme suit.
    1. Préparer le médicament dans une seringue stérile 1 mL avec une aiguille d’oral-gavage. Éliminer l’air de la seringue.
    2. Maintenez le pointeur de la souris avec le ventre vers le haut. Gardez la tête, le cou et le corps de la souris dans une ligne droite avec la tête fixée.
    3. Maintenir l’aiguille parallèle au corps de la souris et l’insérer dans le coin de la bouche de la souris, en appuyant sur la languette et en poussant vers l’intérieur contre la mâchoire supérieure.
    4. Avec peu de résistance, ce qui montre l’aiguille pénètre dans le œsophage en douceur, poussez doucement l’aiguille à la bonne distance. Avant que la pointe de l’aiguille n’atteigne la partie inférieure de la poitrine, injecter le médicament.
    5. Retirer l’aiguille en douceur.

2. test du cylindre

Remarque : Les tests comportements ont été effectuées le jour 8. L-DOPA a été injecté au troisième groupe de souris 40 min avant les tests comportements. Si les tests comportementaux ne sont pas fait dans la même chambre où les animaux sont logés, les animaux ont besoin d’être acclimatés à la nouvelle salle pendant 30-60 min avant le test.

  1. Effectuez le test 24 h après la dernière dose du MPTP.
  2. Placez une bouteille de verre transparent (hauteur = 19,5 cm, diamètre = 15 cm, poids ≥ 1 kg) au centre d’une table. Entourer la bouteille sur trois côtés avec un carton noir pour réduire l’effet de l’éclairage environnemental. Laisser un côté du cylindre face à la caméra pour l’enregistrement vidéo.
    Remarque : La distance entre le carton et le cylindre doit être environ de 4 à 8 cm.
  3. Joindre une photo (> 1 million-pixels de résolution) à environ 40 à 60 cm de distance du cylindre pour vérifier que le cylindre complet est visible.
    NOTE : C’est ni trop près ni trop loin pour ne pas déranger la souris lors de l’enregistrement de la vidéo de son mouvement.
  4. Mettre une souris dans le cylindre à la fois et de commencer à filmer en même temps. Arrêter de filmer après 3 min.
    NOTE : Au cours de ce processus, essayez d’éviter les bruits ou évitant les légers changements dans l’ordre qui influent sur le comportement de la souris.
  5. Placez votre souris dans la cage après avoir testé.
  6. Nettoyer le cylindre avec de l’eau et ensuite pulvériser 70 % v/v d’éthanol sur la paroi intérieure pour désinfecter il et supprimer les senteurs de souris. Essuyez le cylindre avant une autre souris soit réglée au.
  7. Lire la vidéo à un taux de 0,5 x la vitesse normale et compter le nombre d’ascenseurs patte contre le mur de chaque souris.
    NOTE : Patte ascenseurs se produisent lorsque la souris se cabre sur ses membres postérieurs, soulève les deux pattes avant plus haut niveau de l’épaule et les terres. Un ascenseur de membres antérieurs n’est pas compté. Habituellement, une souris déclenche ses pattes avant afin de toucher les parois du cylindre. Si la souris lève ses pattes avant plus haut niveau de l’épaule plusieurs fois en continu sans y atterrir, il devrait être considéré uniquement comme une seule fois.

3. essai sur le terrain open

  1. Effectuer l’essai ouvert 24h après l’administration de MPTP.
    NOTE : Elle peut être réalisée en même temps de l’essai de cylindre.
  2. Préparer une zone de réaction transparente plein champ (L 45 cm x 45 cm p x H 25 cm) avec couvercle en bois plaque en bas par un tissu noir. Fixer une caméra (> 1 million-pixels de résolution) sur le terrain à une hauteur de 1 m.
    Remarque : La couleur du fond de boîte de plein champ doit être différente de la couleur des souris testées afin d’assurer le contraste des couleurs dans la vidéo.
  3. Ajuster l’appareil pour s’assurer que la zone de réaction de plein champ est en plein centre de la vidéo.
  4. Mettez un test souris dans la boîte et laissez la souris se familiariser avec l’environnement pendant environ 1 min.
  5. Enregistrer une vidéo de 5 min à l’aide de l’appareil photo connecté à l’ordinateur.
  6. Analyser la vidéo en utilisant des outils logiciels (p. ex., MATLAB) pour obtenir le chiffre de trace de circulation, la distribution d’électricité statique (vitesse < 1 cm/s), marche (vitesse 1-20 cm/s) et en cours d’exécution (vitesse > 20 cm/s) du temps, le total parcouru distance et moyenne vitesse de chaque souris testées.
    Remarque : Lors de l’analyse de la vidéo, nous suivons l’ensemble du corps de la souris. La vitesse moyenne d’un corps signifie que la longueur totale du chemin couvert, divisé par le temps écoulé. Donc, si une souris ne bouge pas, sa vitesse instantanée serait considérée comme nulle.
  7. Nettoyer les matières fécales dans la zone de réaction de plein champ. Pulvériser de l’éthanol à 70 % sur la boîte et l’essuyer.

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Résultats

Dans le test du cylindre, la diminution des arrières contre le mur a été observée chez les souris (groupe 2) traités avec PFMP du jour 1 au jour 7 et saline jour 8 par rapport aux souris imprégnées d’une solution saline (groupe 1), alors qu’une augmentation des arrières a été observée chez les souris (groupe 3) traités par MP TP du jour 1 au jour 7 et la L-DOPA sur jour 8 contre les souris (groupe 2) traitement avec PFMP du jour 1 au jour 7 et saline au jour 8 (Figure...

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Discussion

En raison de la destruction des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra du cerveau, PFMP provoque des symptômes de Parkinson-comme chez souris7. L-DOPA est la drogue préférée pour PD depuis son utilisation clinique, car elle contribue à maintenir les activités quotidiennes normales chez les patients atteints de la MP, avec la suppression efficace des anomalies moteurs dont la rigidité et l’akinésie15. Les souris traitées avec PFMP montré des déficiences dans les t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Notre travail est financé par les programmes de formation de premier cycle Tianjin pour l’Innovation et l’entrepreneuriat (Grant no 63183004). Ce projet a été lancé dans l’état clé laboratoire de médicaments biologie chimique à l’Université de Nankai. Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucun conflit d’intérêts.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 % EthanolRuiboxing CompanyRBX-64175
CaméraBASLERacA645-100gm
Test de cylindreFabriqué en interne à l’Université de NankaiN/A
ExcelMicrosoftN/A
LevodopaSigma-Aldrich72816
Matalb 2017aMathworksN/A
SourisInstitut de zoologie, Académie chinoise des sciencesBalb/cSouris femelles adultes (10 semaines)
MPTPYuanye Biological Technology Company Ltd., ShanghaiS31504-500mg
Test en plein champRéalisé en interne à l’Université de NankaiN/A
SeringueSolelybioS-xsgwz-wSeringue d’irrigation
Jiangxi Fenglin Medical Compagnie d’applicationhc3824Injection intrapéritonéale

Références

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