Enregistrements simultanés des potentiels corticaux champ Local et Electrocorticograms en réponse à des Stimuli nociceptifs Laser de bouger librement des Rats

Summary

Nous avons développé une technique qui enregistre simultanément les expression et potentiels de champs locaux en réponse à des stimuli nociceptifs laser de bouger librement des rats. Cette technique aide à établir une relation directe de signaux électrocorticale au niveau macroscopique et mésoscopique qui facilite l’étude de traitement dans le cerveau de l’information nociceptive.

Abstract

Électrocorticale réponses, induites par des impulsions de chaleur laser qui activent sélectivement les terminaisons nerveuses libres nociceptives, sont largement utilisés dans de nombreuses études animales et humaines pour enquêter sur le traitement cortical de l’information nociceptive. Ces potentiels de cerveau induite par laser (LEPs) se composent de plusieurs réponses transitoires qui sont temps-verrouillé à l’apparition de stimuli de laser. Toutefois, les propriétés fonctionnelles des réponses LEP sont encore largement inconnues, en raison de l’absence d’une technique d’échantillonnage qui permet d’enregistrer simultanément des activités neuronales à la surface du cortex (c.-à-d., électrocardiographique [ECoG] et le cuir chevelu électroencéphalogramme [cuir chevelu EEG]) et à l’intérieur du cerveau (c.-à-d., potentiel de champ local [PDD]). Pour résoudre ce problème, nous vous présentons un protocole animaux librement mobiles chez des rats. Ce protocole est composé de trois procédures principales : (1) animale préparation et interventions chirurgicales, (2) un enregistrement simultané de l’ECoG et LFP en réponse à des stimuli nociceptifs laser et d’extraction de données (3), analyse et fonctionnalité. Plus précisément, avec l’aide d’une coque de protection 3D-imprimés, ECoG et le PDD électrodes implantées sur le crâne de rat ont été solidement maintenues ensemble. Au cours de la collecte de données, impulsions laser ont été livrées sur ses pattes de rat par des fentes dans le fond de la chambre lorsque l’animal était dans l’immobilité spontanée. Un bruit blanc continu a été joué afin d’éviter l’activation du système auditif par les ultrasons générés par rayon laser. En conséquence, seules les réponses nociceptives ont été sélectivement enregistrés. En utilisant les méthodes analytiques standards (par exemple, filtrage passe-bande, époque d’extraction et correction de la ligne de base) pour extraire les réponses axées sur la stimulation cérébrale, nous avons obtenu des résultats que LEPs avec un rapport signal sur bruit élevé ont été en même temps enregistré par électrodes ECoG et LFP. Cette méthodologie permet l’enregistrement simultané des activités ECoG et LFP, qui fournit un pont des signaux de l’électrocorticale, au niveau macroscopique et mésoscopique, facilitant ainsi l’enquête relative au traitement de l’information nociceptive dans le cerveau.

Introduction

EEG est une technique d’enregistrement des potentiels électriques et activités cérébrales oscillatoire générées par les activités synchronisées de milliers de neurones dans le cerveau. Il est populairement utilisé dans de nombreuses études fondamentales et applications cliniques^1,2. Par exemple, les réponses EEG à laser intense chaleur impulsions (c.-à-d.LEPs) sont largement adoptés pour enquêter sur le traitement centraux et périphérique d’entrée sensorielle nociceptive^3,4,5. Chez l’homme, LEPs consistent principalement en trois flèches distinctes : la composante précoce (N1) qui est somatotopique organisée et susceptible de refléter l’activité du cortex somatosensoriel primaire (S1)⁶et les composants de fin (N2 et P2) qui sont au centre distribuées et plus susceptibles de refléter l’activité du cortex somatosensoriel secondaire, insula et le cortex cingulaire antérieur^7,8. Dans les précédentes études^9,10, nous avons démontré que rat LEPs, échantillonnée en utilisant ECoG (un type d’EEG intracrânien) d’électrodes placées directement sur la surface exposée du cerveau, aussi se composent de trois flèches distinctes ( c'est-à-dire, somatotopique organisé N1 et N2 centralement distribués et P2). La polarité, l’ordre et la topographie des composants LEP rat sont semblables aux humains LEPs¹¹. Toutefois, en raison de la résolution spatiale limitée du cuir chevelu EEG et sous-dural ECoG enregistrements¹², ainsi que de la nature imprécise de l’EEG source analyse techniques¹³, la contribution détaillée des activités neuronales aux composants LEP fait beaucoup débat. Par exemple, il est peu clair si et la mesure dans laquelle S1 contribue à la première partie de la réponse corticale (N1) provoquée par des stimuli de laser⁶.

Différente de la technique d’enregistrement à des enregistrements macroscopiques niveau, directs intracrâniennes, l’utilisation de tableaux microwire, aidés par un appareil stéréotaxique et microdrives^14,15 pourrait mesurer les activités neuronales (p. ex., LFPs ) des régions spécifiques. LFPs reflètent principalement la sommation des potentiels post-synaptiques inhibitrices ou excitateurs des populations neuronales local¹⁶. Étant donné que les activités neuronales LFP retenus dans l’échantillon représentent les processus neuronaux qui se produisent dans des centaines de micromètres autour de l’électrode d’enregistrement, cette technique d’enregistrement est employé couramment pour enquêter sur les informations de transformation du cerveau à l’échelle mésoscopique. Toutefois, il ne met l’accent sur les modifications locales précises des activités du cerveau et ne peut pas répondre à la question de comment sont intégrés les signaux provenant de plusieurs régions (par exemple, comment les composants de la LEP sont intégrés à plusieurs régions du cerveau).

Il est à noter que l’enregistrement simultané de l’ECoG et LFPs corticales de bouger librement des rats puisse faciliter les recherches de corticales informatiques à la fois macroscopique et mésoscopique niveaux. En outre, cette méthode fournit une excellente occasion d’examiner la mesure dans laquelle les activités neuronales des régions cérébrales prédéfinis contribuent aux LEPs. En effet, plusieurs études antérieures ont évalué la cohérence entre les pointes, LFP corticale, ECoG signaux et^17,18 et démontré que la LFP^19,20 adjacent à l’électrode EEG contribue à la formation des réponses axées sur la stimulation cérébrale. Cependant, la technique existante est habituellement utilisée pour enregistrer les réponses du cerveau des animaux anesthésiés en raison de l’absence d’une coque de protection pour empêcher les électrodes ne soit endommagé par la collision. En d’autres termes, il manque encore la technique qui pourrait construire le pont d’électrocorticale de signaux dans les mésoscopique (LFP corticale) et macroscopiques (EEG et ECoG) en se déplaçant librement des rats.

Pour résoudre ce problème, nous avons développé une technique qui a pu enregistrer un ECoG et LFPs corticales dans plusieurs régions du cerveau en même temps de se déplaçant librement des rats. Cette technique aide à établir la relation directe de signaux de l’électrocorticale, au niveau macroscopique et mésoscopique, facilitant ainsi l’enquête de traitement dans le cerveau de l’information nociceptive.

Protocol

Rats Sprague-Dawley mâles adultes (pesant 400-450 g) ont été utilisées pour l’expérience. Toutes les procédures chirurgicales et expérimentales suivi le Guide d’entretien et d’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health. Les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de recherche à l’Institut de psychologie, Académie chinoise des Sciences.

1. Implantation de l’électrode

1. Anesthésier le rat dans une chambre avec 5 % isoflurane et un débit d’air de 1 L/min avant la chirurgie.
2. En utilisant un appareil stéréotaxique, fixer la tête du rat avec son nez placé dans le masque d’anesthésie. Administrer l’isoflurane via le masque anesthésique à une concentration de 2 % avec un débit d’air de 0,5 L/min pour maintenir la profondeur anesthésique pendant la chirurgie. Notez que la tolérance chirurgicale est réalisée lorsque le rat ne répond pas aux orteils-pincement.
3. Appliquer pommade ophtalmique sur les yeux afin d’éviter un séchage cornéenne.
4. Raser le dessus du cuir chevelu rat à l’aide d’un rasoir standard.
5. Stériliser le cuir chevelu à l’aide de l’alcool médical iodophore désinfectant solution et 75 % pour éliminer l’iode.
6. Injecter le cuir chevelu pour l’analgésie locale de lidocaïne (2 %). Administrer de l’atropine (0,2 mL i.p.) pour inhiber l’hypersécrétion respiratoire.
7. Faire une incision médiane d’environ 2-3 cm sur le cuir chevelu à l’aide d’un scalpel. Couper et enlever une partie du cuir chevelu le long de la ligne médiane et exposent le crâne. Utilisez l’electrocoagulator pour arrêter le saignement, lorsque cela est nécessaire.
8. Marquer l’emplacement des électrodes ECoG selon les coordonnées stéréotaxiques prédéfinies (placées selon la position de Bregma) et l’emplacement des électrodes de référence et au sol sur la ligne médiane (placée à 2 et 4 mm direction caudale pour le Lambda, respectivement).
9. Percer des trous (diamètre : 0. 5 mm) pour les vis de l’ECoG, en utilisant une perceuse crânienne sur le crâne dans les sites marqués, sans détruire la dure-mère.
10. Une vis en acier inoxydable (diamètre extérieur : 0,6 mm), qui relie le fil de cuivre enduit isolation, dans le trou d’une profondeur d’environ 1 mm sans pénétrer la dure-mère sous-jacente. Ces vis servent de ECoG, référence et électrode de masse pendant l’expérience.
11. Placer une coque protectrice à la base sur le crâne. Fixer le fond avec ses vis adjacentes sur le crâne à l’aide d’acrylique dentaire. Utilisez le coton médical qui pourrait être retiré par la suite afin de protéger la zone qui est destinée à être utilisé pour l’implantation de fil de profondeur du couvert.
    Remarque : La coque de protection est un produit sur-mesure imprimés 3D polylactique, qui se compose de trois parties : un socle, un mur et une casquette. Le mur est couvert par des cônes en cuivre pour construire une cage de Faraday.
12. Marquer les emplacements des électrodes fil profondeur selon les coordonnées stéréotaxiques prédéfinies.
13. Percer de petits trous (diamètre : 0. 2 mm) sur le crâne autour des sites marqués pour l’implantation de fil et retirer délicatement le lambeau osseux pour exposer la dure-mère. Laver la craniotomie fréquemment, à l’aide de sérum physiologique. La figure 1 décrit la mise en place avant l’implantation des électrodes fil profondeur.
14. À l’aide d’une aiguille, soulever et couper le dura sans endommager la surface du néocortex, les vaisseaux et la pie-mère.
15. Abaissez les électrodes de fil de profondeur à la surface du néocortex et, puis, lentement, pénètrent dans le cerveau à la profondeur de la cible. Arrêter fréquemment en descendant les électrodes pour la résilience de la corticale. Dans la présente étude, la profondeur de l’extrémité du fil est de 0,5 mm sous la surface corticale.
16. Sceller la craniotomie avec un mélange d’huile de paraffine et de cire pour s’assurer que les électrodes de fil de profondeur peuvent être déplacés pour des manipulations expérimentales ultérieures.
17. Fixer l’appareil électrode à l’aide d’acrylique dentaire sur le crâne.
18. Soudez chaque fil de cuivre qui se connecte à la vis ECoG sur le canal correspondant sur le module de connecteur. Couvrir les taches résiduelles argile pour éviter le contact éventuel entre les différents canaux de soudage.
19. Assembler la paroi de la coque de protection à la base et souder les électrodes de référence et au sol pour les canaux correspondants.
20. Fixation du capuchon de la coque de protection à l’aide de cassettes pour éviter la contamination.
21. Injecter le rat avec de la pénicilline (60 000 U, i.p.) immédiatement après la chirurgie pour prévenir les infections post-opératoires.
22. Single-maison du rat dans une température et humidité-contrôlée cage et gardez-le dans un cycle jour/nuit de 12 h après la chirurgie, avec de la nourriture et d’eau ad libitum pendant au moins une semaine avant l’expérience de la LEP.
    Remarque : Pour enregistrer simultanément ECoG et activités corticales de LFP, un appareil a été utilisé ici qui a été assemblé avec deux types d’électrodes reliées à un module de connecteur, qui contenait plusieurs microdrives attachés pour les tableaux de fil de tungstène. Les broches en or ont été utilisés pour connecter les fils de tungstène à la carte d’interface électrode (BEI) du module connecteur en appuyant sur les fils dans de petits trous métalliques de la BEI. Deux trous de métal sur la BEI ont été soudées avec des fils de cuivre revêtus, et l’extrémité libre de chaque fil de cuivre a été soudée avec du fil de cuivre correspondant relié à vis ECoG. Les détails de fabrication ont été décrites ailleurs²¹.

2. collecte des données

1. Chatouiller le rat au moins 1 x par jour pendant trois jours consécutifs avant l’expérience pour s’assurer que le rat devient familier avec l' expérimentateur²².
2. Placez le rat dans la chambre de comportement pendant au moins 1 h avant l’expérience pour assurer que le rat ambiant dans l’environnement de l’enregistrement.
   Remarque : La chambre est un cube en plastique d’une longueur de côté de 30 cm. Le fond de la chambre est fait d’une grille de fer avec des écarts de ~ 8 mm.
3. Connecter la tête d’enregistrement avec le module électrode doucement, pour éviter d’effrayer le rat et endommager le module de l’électrode.
4. Mettre en place le générateur laser, raccorder la fibre optique et ajuster la taille de tache du laser selon le manuel de l’opérateur de l’équipement. Connecter la sortie numérique de la génératrice de déclencheur au port d’entrée numérique de la carte d’enregistrement.
   Remarque : prendre soin de ne pas pour boucler la fibre optique excessivement pour éviter la rupture de la fibre. Avant l’enregistrement, s’assurer que les signaux de déclenchement sont affichés et enregistrés par le logiciel d’enregistrement. Dans ce protocole, des stimuli de chaleur radiant sont générés par un infrarouge neodymium yttrium aluminium perovskite (Nd : YAP) laser avec une longueur d’onde de 1,34 μm. Le diamètre de la taille du spot laser est fixé à environ 5 mm de lentilles de focalisation. Un laser à He-Ne a souligné la zone stimulée, ce qui est définie selon l’objectif de l’expérience. En outre, l’énergie de stimulation des impulsions laser est déterminée selon le protocole expérimental. La durée de l’impulsion laser est 4 ms.
5. Réglez la vidéo sous l’angle de la chambre expérimentale pour enregistrer en continu les comportements nociceptifs du rat lorsque sa patte reçoit des stimuli nociceptifs laser. Ajustez la position et l’orientation de la caméra pour s’assurer que les comportements nociceptives sont complètement enregistrés tout au long de l’expérience.
   Remarque : Une caméra haute vitesse dispositif à couplage de charge (CCD) est fortement recommandée, car il peut fournir les signaux d’exploitation à la carte principale du système d’enregistrement à enregistrer l’heure de début et la durée du comportement nociceptive précisément. Comportements nociceptives sont évalués par l’expérimentateur après chaque impulsion laser, selon des critères définis précédemment basés sur les mouvements des animaux^23,24, comme suit : aucun mouvement (score = 0), tourner la tête (y compris les secousses ou élévation de la tête ; score = 1), broncher (c'est-à-dire, un petit corps de brusque secousses mouvement ; score = 2), retrait (c.-à-d., rétraction de la patte de l’impulsion laser ; score = 3), mouvement léchant et confiné (score = 4).
6. Livrer en cours bruit blanc (50 dB SPL) via un haut-parleur en haut de la chambre.
   Remarque : Comme indiqué dans précédentes études^10,25, stimulation laser livrée sur la peau génère des ultrasons qui peuvent être détectées par le système auditif de rat. Pour cette raison, un bruit blanc en cours est joué tout au long de l’expérience afin d’éviter l’activation du système auditif en réponse à ultrasons générés par rayon laser. Cette procédure permet l’enregistrement sélectif des réponses de cerveau liées à l’activation du système nociceptif.
7. Collecter les données électrophysiologiques de l’ECoG et les fils-électrodes profondeur, en utilisant le système d’enregistrement selon le manuel de l’opérateur de l’équipement.
   Remarque : Les signaux d’utilisation de la caméra et le déclenchement de signaux d’impulsions laser sont échantillonnées simultanément les données électrophysiologiques de la même fréquence d’échantillonnage (toutes les données sont amplifiées et numérisés à l’aide d’une fréquence d’échantillonnage de 20 000 Hz), qui veille à ce que toutes les données sont synchronisées dans le temps.
8. Livrer les impulsions de laser à la plantaire de la patte du rat à travers les ouvertures dans le fond de la chambre.
   Remarque : L’impulsion laser est livrée uniquement lorsque le rat est l’immobilité spontanée pendant plus de 2 s basée sur l’observation de l’expérimentateur, pour minimiser la contamination de signal des artefacts liés à la circulation. Pour éviter la fatigue des nocicepteurs ou sensibilisation, la cible du rayon laser est déplacée manuellement après chaque stimulus, et l’intervalle interstimulu n’est jamais moins de 40 s. ECoG et LFP signaux peuvent être enregistrés plusieurs fois de chaque rat. Le rat doit être placé dans la chambre expérimentale 1 h avant chaque session d’enregistrement. Sessions d’enregistrement après tout, le rat a été profondément anesthésié et perfusé transcardially solution saline tamponnée au phosphate glacée suivie de paraformaldéhyde à 4 %. Le cerveau a été séparée du crâne et sectionné afin d’identifier les emplacements des électrodes.

3. analyse des données

1. Filtrer les données continues avec un filtre passe-bande entre 1 et 30 Hz.
2. Époque les données à l’aide d’une fenêtre d’analyse de 3 s, étendue de 1 s avant à 2 s après l’apparition de stimuli de laser. Correction de base est effectuée en soustrayant l’amplitude moyenne dans l’intervalle prestimulus.
3. Manuellement, rejeter les époques qui sont contaminées par des artefacts bruts.
4. Calculer les formes d’onde moyenne de LEP qui sont temps-verrouillé à l’apparition de stimuli laser pour chaque condition expérimentale.
5. Calculer que la cohérence de transformation par ondelettes (WTC) de formes d’onde LEP enregistré de ECoGs et de la profondeur de fils-électrodes.
   NOTE : WTC est une technique pour réaliser la cohérence entre les paires d’électrodes en fonction du temps et de fréquence. Le WTC entre deux signaux peut être calculé pour n’importe quel point du temps-fréquence, qui a l’avantage de générer des valeurs de cohérence pour l’ensemble du spectre de temps-fréquence. Les détails de la méthodologie ont été décrites ailleurs²⁶.

Results

Dans l’expérience de représentant, les données électrophysiologiques des cinq rats ont été enregistrées. Les stimuli laser ont été livrés à la patte droite de chaque rat 20 fois avec > interstimulus intervalles de 40 s. Le cerveau induite par laser, les réponses ont été enregistrées en utilisant les vis ECoG et profondeur fils et les fils de profondeur ont été implantés dans les bilatérales cortex somatosensoriel primaire (S1) et cortex primaire de moteur (M1).

Discussion

Dans la présente étude, nous avons décrit une technique pour enregistrer simultanément des ECoGs et des réponses LFP corticales déclenchées par des stimuli nociceptifs laser de bouger librement des rats. Les résultats ont montré que les réponses LEP peuvent détecter clairement après l’apparition de stimuli laser en signaux ECoG et le PDD. L’enregistrement simultané de l’ECoG et signaux corticaux de LFP permettra aux scientifiques d’étudier leurs relations pour mieux comprendre la contribution des activités neuronales aux...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rats Sprague-Drawley mâles	Vital River
Isoflurane	RWD Life Science Système
d’anesthésie à l’isoflurane pour petits animaux	RWD Life Science		Y compris l’anesthésie masque à gaz pour rats
Appareil stéréotaxique	RWD Life Science
L’appareil avec électrodes			combinées ECoG et LFPL’appareil est fait maison, qui assemble l’ECoG et les électrodes de fil de profondeur à un module de connexion
		de protection imprimée en 3D	La texture de la coque est polylactique, et la coque est faite maison et contient trois parties : une base, une paroi et un capuchon. La paroi est recouverte de cônes en cuivre pour construire comme une cage de Faraday
des fils de tungstène (diamètre : 50 mm)	California Fine Wires Company		Les électrodes pour l’enregistrement LFP cortical
; Vis en acier inoxydable (diamètre : 0,6 mm)			Les électrodes pour l’enregistrement ECoG
Foret crânien électrique	RWD Life Science
; Mèche (diamètre : 0,5 mm)	RWD Life Science		La perceuse est utilisée pour percer les trous des vis ECoG
; Mèche (diamètre : 0,2 mm)	RWD Life Science		La perceuse est utilisée pour percer les trous des fils profonds  ;
Poudre arylique dentaire	SNC dentaire
Liquide arylique dentaire	SNC
	Fisher Scientific		Le mélange est utilisé pour sceller la craniotomie afin d’assurer le mouvement suivant des réseaux de micro-fils
Huile minérale	Fisher Scientific
Électrocoagulateur  ;	Bovie medical Corporation
RHD2132 Cartes d’amplification  ;	Intan Technologies		Un
		d’acquisition	données
néodyme yttrium aluminium pérovskite (Nd :YAP) générateur laser	Ingénierie
Matlab R2016b	The MathWorks  ;