Analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène

Résumé

Nous présentons un protocole visant à obtenir les signatures de protéomique des macrophages humains et cela s’applique à la détermination de l’impact d’un environnement pauvre en oxygène sur la polarisation de macrophages.

Résumé

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire. Les différentes fonctions de ces cellules sont liées à leurs États d’activation, qui est aussi appelé polarisation. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine de la biologie du macrophage. Il est actuellement reconnu qu’une approche multidimensionnelle est nécessaire pour décrire comment la polarisation est contrôlée par des signaux environnementaux. Dans ce rapport, nous décrivons un protocole visant à obtenir la signature de la protéomique des polarisations différentes dans les macrophages humains. Ce protocole est basé sur une quantification exempte d’étiquette d’expression de protéine macrophage provenant de fractionnés en gel et le contenu de lyse cellulaire Lys C/trypsine-digéré. Nous fournissons également un protocole basé sur la solution en digestion et isoélectrique mise au point de fractionnement à utiliser comme solution de rechange. Parce que la concentration en oxygène est un paramètre environnemental pertinent dans les tissus, nous permet de découvrir la composition de l’atmosphère comment ce protocole ou un environnement pauvre en oxygène influe sur la classification de la polarisation du macrophage.

Introduction

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées impliqués dans un certain nombre de fonctions physiologiques allant de réactions aux agents pathogènes infectieux à l’homéostasie tissulaire, y compris l’enlèvement de cellules apoptotiques et remodelage de la matrice extracellulaire¹. Ces cellules sont caractérisées par une forte plasticité phénotypique² qui se traduit par un nombreux États d’activation possible, qui sont aussi appelés les polarisations. La description moléculaire précise de ces polarisations différentes est une priorité dans le domaine des macrophages biologie³. Il a été prop....

Protocole

Des échantillons de sang humain (LRSC) provenant de donneurs sains, dépersonnalisées proviennent de l’EFS (Français National Blood Service) dans le cadre d’un protocole autorisé (CODECOH DC-2018-3114). Donateurs ont donné le consentement signé pour l’utilisation du sang.

1. médias et préparation du tampon

1. Préparer le milieu de macrophage [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x non essentiels des acides aminés (NEAA)] et elle chauffé à 37 ° C.
2. Préparer le milieu macrophage + 10 % de sérum humain du plasma AB (SAB), filtrer (filtre de 0,22 µm), puis le réchauffer à 37 ° C (dénommé moyen de macrophage + 10 % SAB ci-après).
....

Résultats

À partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenus par centrifugation différentielle, le protocole permet l’obtention d’une population de CD14⁺ monocytes avec une pureté mises en recouvrement de plus de 98 % par cytométrie en flux (Figure 1). Ces monocytes sont différencient secondairement vers diverses polarisations (Figure 2). Quand un fractionnement sur gel est choisi, la migration sur gel SDS-p.......

Discussion

Parce que la protéomique est un outil puissant pour étudier l’expression des différentes protéines d’une cellule entière ou compartiments subcellulaires, optimisation du protocole de la lyse cellulaire et la digestion des protéines a été traitées par un certain nombre d’études. Il y a trois grandes classes de méthodes, qui incluent la digestion en gel (digestion des protéines en gel de polyacrylamide matrice)¹⁷, digestion en solution¹⁸ et filtre assistée par exemple prépara.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hypoxie Poste de travail	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 Cytomètre en flux	BD	Accuri C6
Urée	Agilent Technologies	5188-6435
Acide formique (FA)	ARISTAR	450122M
R-250 Bleu Coomassie	Biorad	1 610 436
Lipopolysaccharide, E.Coli (LPS)	Calbiochem	437627
2D kit de nettoyage	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 moyen, supplément glutamax	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM Solution d’acides aminés non essentiels (NEAA) 100X	Gibco	11140-035
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X	Gibco	14190-094
Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column	Harvard Apparatus	74-4601
EDTA 0.5 M, pH 8.0	Invitrogen	AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12 %	Life Technologies SAS	NP0321 BOX
CD14 Microbilles humaines	Miltenyi Biotec	130-050-201
Colonne de séparation MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF)	Miltenyi Biotec	130-096-485
Interleukine 4 (IL4)	Miltenyi Biotec	130-093-917
Interleukine 13 (IL13)	Miltenyi Biotec	130-112-410
Interféron gamma (INF&gamma ;)	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC (clone TÜ ; K4)	Miltenyi Biotec	130-080-701
Rotateur de tube MACSmix	Miltenyi Biotec	130-090-753
Acide trifluoroacétique (TFA)	Pierce	28904
Trypsine/Lys-C Mix	PROMEGA	V5073
Mini complet, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	11836170001
Density Gradient Solution ( Histopaque 1077)	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax	Sigma Aldrich	A7089-100ML
Sérum humain à partir de plasma AB humain mâle (SAB)	Sigma Aldrich	H4522-100ML
Solution d’albumine sérique bovine (BSA) 30 %	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma-base	Sigma Aldrich	T1503
Glycérol	Sigma Aldrich	49767
&beta ;-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Bleu de bromophénol	Sigma Aldrich	114405
Dodécylsulfate de sodium (SDS) 20 %	Sigma Aldrich	5030
Bicarbonate d’ammonium	Sigma Aldrich	9830
Acétonitrile	Sigma Aldrich	34888
Dithiothreitol	Sigma Aldrich	43819
Iodoacétamide	Sigma Aldrich	57670
Thiourée	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Micro BCA Kit de dosage	ThermoFisher	23235
Pipette en plastique stérile 5 mL	VWR	612-1685
Thermomixeur C Eppendorf VWR		460-0223
Sep-Pak tC18 cartouches en phase inverse, 100 mg	Waters	WAT036820