Haut débit en évaluation in Vitro de latence en inversant les Agents sur le VIH Transcription et épissage

Résumé

Un protocole de haut débit pour l’évaluation fonctionnelle de la réactivation efficace du VIH et de la clairance du provirus latentes est décrite et appliqué en testant l’impact des interventions sur la transcription de VIH et d’épissage. Des résultats représentatifs de l’effet de latence inversant agents sur LTR axée sur la transcription et épissage sont fournis.

Résumé

Le VIH reste incurable en raison de l’existence d’un réservoir de cellules qui recèle une forme stable et latente du virus, qui reste invisible pour le système immunitaire et n’est pas ciblée par l’antirétroviraux actuels (cART). Transcription et épissage ont démontré que renforcer la latence du VIH-1 au repos des cellules T CD4 +. Inversion de la latence de l’utilisation d’agents de renversement de latence (ALE) dans l’approche de « choc et d’abattage » a été largement étudiée dans le but de purger ce réservoir mais n’a jusqu'à présent pas montré aucun succès dans les essais cliniques en raison du manque de développement des petits adéquate molécules qui peuvent perturber efficacement de ce réservoir. Le protocole présenté ici fournit une méthode pour efficacement et de façon fiable évaluer les agents de renversement de latence (alr) sur la transcription du VIH et l’épissage. Cette approche repose sur l’utilisation d’un journaliste bicolore axée sur le LTR qui permet de mesurer simultanément les effets d’un LRA transcription et épissage par cytométrie en flux. Le protocole décrit ici est suffisant pour les cellules adhérentes, mais aussi les cellules en suspension. Il est utile pour tester un grand nombre de médicaments dans un système à haut débit. La méthode est techniquement simple à mettre en œuvre et économique. En outre, l’utilisation de la cytométrie permet l’évaluation de la viabilité cellulaire et toxicité des médicaments donc en même temps.

Introduction

Malgré un traitement antirétroviral à long terme efficace, le VIH persiste dans un état latent comme un provirus intégré dans la mémoire de cellules T CD4 +¹. La structure de la chromatine du VIH-1 5 « promoteur de longue répétition terminale (LTR) et des modifications épigénétiques telles que la méthylation des histones et désacétylation par ADN méthyltransférases (DNMT) et les histones désacétylases (HDAC) sont des mécanismes importants conduisant à la répression transcriptionnelle et donc post-intégration latence^2,3. Une grande variété d’agents d’inversion (ALE) de la latence a été é....

Protocole

Remarque : Procédures de clonage, séquençage et transformation sont traitées ailleurs^18,19. Les protocoles aux présentes commencent de la transfection des vecteurs d’expression chez les mammifères (Figure 3).

1. la transfection de cellules HEK293T avec bicolore journaliste construire

1. Cultiver des cellules HEK293T au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % (v/v) sérum fœtal (SVF), la pénicilline (100 U/mL) et la streptomycine (100 μg/mL) dans un 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C. Après décongélation,....

Résultats

Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 5 pour l’expression de HIV-1 unspliced (EGFP) et épissé (DsRed) produits après le traitement par l’inhibiteur de la côté du JQ1. Fois JQ1(+) et Tat a augmenté significativement le pourcentage de cellules exprimant EGFP (2.18 et 4.13 FC au DMSO respectivement ; n = 3) indicatifs des transcriptions unspliced. Par ailleurs, JQ1(+) a considérablement augmenté le pourcentage de cellules exprimant DsRed (46,6 FC a.......

Discussion

Compte tenu de la difficulté de mesurer une réactivation du virus ex vivo, un large éventail d’in vitro modèles ont été développés au fil du temps afin d’étudier la latence du VIH, y compris de manière latente infectée lignées de cellules T (J-Lats, ACH2, U1), modèles primaires de l’infection latente de repos) O ' Doherty, Lewin, Greene et Spina modèles) ou des cellules T CD4 + pré-activé (Samir, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modèles) avec simple ronde ou réplication journaliste compétente virus^22<.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
< forte > culture cellulaire
cellules HEK293T (cellules rénales embryonnaires humaines)	ATCC	CRL-3216	Réplique les vecteurs porteurs de la région de réplication SV40.
Milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM 1x + GlutaMAX-I)	Gibco	10569-010	+ 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/L de pyruvate de sodium
Sérum fœtal bovin	Gibco	10099-141	Origine Australie
Pénicilline-Streptomycine	Sigma	P4458
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190-136
Coloration au bleu de trypan, 0,4 %	Gibco	15250
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Gibco	25300054
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Réactif de transfection lipidique
Opti-MEM I (1x) milieu sérique réduit	Gibco	31985-070	Milieu sans sérum
NucleoBond Xtra Maxi	Marcherey-Nagel	740414.50
Plasmide pEGFP-N1	Clontech (TaKaRa)	6085-1	Expression de l’EGFP dans les cellules de mammifères, CMVIE promoteur.
pDsRed-Express-N1	Clontech (TaKaRa)	632429	Expression de DsRed-Express dans des cellules de mammifères, CMVIE promoteur.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed	Addgene	115775
pCMV-RevNL4.3	Addgene	115776
pCMV-Tat101AD8-Flag	Addgene	115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Millipore	67-68-5
JQ1(+)	Cayman Chemical	11187	Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 1 &mu ; M
JQ1(-)	Cayman Chemical	11232	Stock à 10 mM dans DMSO ; concentration de travail 1 &mu ;
M Phorbol Myristate Acétate (PMA)	Sigma-Aldrich	16561-29-8	Stock à 100 &mu ; g/mL dans le DMSO ; concentration de travail 10 nM
Phytohémagglutinine (PHA)	Remel	HA15/R30852701	Stock à 1 &mu ; g/&mu ; L dans PBS ; Concentration de travail 10 &mu ; g/mL
Vorinostat (VOR)	Cayman Chemical	10009929	Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 0,5 &mu ; M
Panobinostat (PAN)	TRC	P180500	Stock à 10 mM dans le DMSO ; concentration de travail 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Prolifération Assay	Promega	63581
Venor GeM Classic	Minerva Biolabs	11-1100	Kit de détection de mycoplasmes, basé sur
PCRName	Company	Numéro de catalogue	Comments
Réactifs de cytométrie en flux
LSR Fortessa	BD Biosciences		Cytomètre en flux (4 lasers-bleu, rouge, violet et jaune)
LSR II	BD Biosciences		Cytomètre en flux (3 lasers-bleu, rouge et violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit	Life Technologies	L34976	Colorant de viabilité : pour une excitation de 633 ou 635 nm, 400 dosages. Les composants A et B sont tous deux fournis dans le kit.
Albumine sérique bovine	Sigma	A2153
EDTA 0.5M pH8	Gibco	15575-038
Solution de formaldéhyde 37/10 (37 %)	Chem-Supply	FA010
BD FACS Diva CS& T Research Beads	BD Biosciences	655050	Perles d’étalonnage
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 pics)	BD Biosciences	559123	3.0 - 3.4 mm
Solution de gaine	Chem-Supply	SA046	90 g de NaCl dans 10 L d’eau
HAZ-Tabs	Guest Medical	H8801	Pastilles de libération de chlore pour la désinfection
Decon 90	Decon Laboratories Limited	N/A	Agents de nettoyage concentrés du cytomètre en flux. Solution de travail Decon 90 5 %.
Hypochlorite de sodium (solution à 12-13 %)	Labco	SODHYPO-5L	Agents nettoyants concentrés de cytomètre en flux. Solution de travail eau de Javel 1 %.
7x	MPBio	IM76670	Agents de nettoyage concentrés de cytomètre en flux. Solution de travail 7x 1 %.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
>Matériaux
Flacons de culture tissulaire (75 cm2, col incliné, capuchon ventilé)	Corning	430641U
Plaques de culture tissulaire (fond plat 96 puits avec couvercle)	Costar	3599
Plaques de culture tissulaire (96 puits à fond en V sans couvercle)	Costar	3896
Tubes à centrifuger (10 mL)	SARSTEDT	62.9924.284	100x16 mm
Tubes à centrifuger (50 mL)	CellStar	227261	30x115 mm
Tubes à centrifuger (1,5 mL)	Corning Axygen	MCT-150-C
Tubes à centrifuger Pipette (25 mL),	Corning	CLS4489-200EA
(10 mL),	Corning	CLS4488-200EA
(5 mL), réservoirs de réactifs stériles	Corning	CLS4487-200EA
(50 mL),	Corning	CLS4470-200EA
5 mL, avec capuchon de crépine	Corning	352235	12 x 75 mm en nylon, 70 mm
en nylon	SEFAR	03-100/32	100 mm
Titertube Micro tubes à essai, en vrac	BIO-RAD	2239391	tubes microfacs
5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, sans capuchon	Corning	352008	12x75 mm style
Snap Caps pour tubes à essai 12x75 mm	Corning	352032
Chambre de comptage, double ligne à filet amélioré Neubauer, ligne claire (hémocytomètre, LO-Laboroptik)	ProSciTech	SVZ4NIOU	3x3 grands carrés de 1 mm2 ; Profondeur 0,100 mm ; volume 0,1 mL ; surface minimale 0,0025 mm2
lamelles (Menzel-Glä ; Ser)	Grale Scientific	HCS2026	Microscope 20 x 26 mm
	Nikon TMS	310528
Centrifuge 5810R 5811000487 réfrigérée	Eppendorf		avec rotor A-4-81 avec adaptateurs pour tubes coniques 15/50 mL Lecteur de
microplaques FLUOstar Omega	BMG Labtech	N/A	Lecteur de plaques pour test de prolifération cellulaire. Filtre 490 nm.
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Softwares
FACS Diva	BD Biosciences		Programme d’acquisition et d’analyse de données de cytomètre en flux, version 8.0.1
FlowJo	FlowJo	FlowJo 10.4.2	Programme d’analyse de données de cytomètre en flux, FlowJo Engine v3.05481
Omega	BMG Labtech		FLUOstar contrôle du lecteur multi-utilisateurs, version 5.11
Omega - Analyse de données	BMG Labtech	MARS	FLUOstar analyse de données, version 3.20R2
Microsoft Excel	Microsoft	Excel :mac 2011	version 14.0.0
Prism	GraphPad	Prism 7	version 7.0c

pipette sérologique stérile pipette sérologique stérile tube à essai stérile en polystyrène