Ingénierie efficace génome de Candida albicans est essentielle à la compréhension de la pathogenèse et le développement d’agents thérapeutiques. Ici, nous avons décrit un protocole pour rapidement et avec précision, modifier le génome de c. albicans en utilisant CRISPR. Le protocole permet aux enquêteurs d’introduire une grande variété de modifications génétiques, y compris les mutations ponctuelles, les insertions et suppressions.
Cette méthode décrit le CRISPR médiée par génome un montage efficace du champignon pathogène humain diploïde Candida albicans. Génome induite par CRISPR édition chez c. albicans nécessite Cas9, guide RNA et modèle de rechange. Un plasmide exprimant un codon de levure optimisé Cas9 (CaCas9) a été généré. Guide des séquences directement en amont d’un PAM site (NGG) sont clonés dans le vecteur d’expression de Cas9. Un modèle de réparation puis fait par primer extension in vitro. Co-transformation de la modèle de la réparation et le vecteur en c. albicans conduit à la modification du génome. Selon le modèle de réparation utilisé, l’enquêteur peut introduire des modifications de nucléotides, les insertions ou les suppressions. Comme c. albicans est diploïde, les mutations sont faites dans les deux allèles d’un gène, pourvu que les allèles A et B héberger pas SNP qui interfère avec guide de ciblage ou réparer l’incorporation de modèle. Familles de gènes multimembre modifiables en parallèle si les séquences conservées appropriés existent dans tous les membres de la famille. Le système de c. albicans CRISPR décrit est flanqué de sites FRT et code flippase. Lors de l’induction de flippase, le marqueur antibiotique (CaCas9) et le guide RNA sont retirés du génome. Cela permet à l’enquêteur d’effectuer des modifications ultérieures dans le génome. C. albicans CRISPR est un outil puissant fongique le génie génétique, et des modifications mineures aux protocoles décrits permettent la modification des autres espèces de champignons dont c. glabrata, N. castellii et S. cerevisiae.
Candida albicans est le plus répandu champignon pathogène humain1,2,3. Comprendre les différences entre c. albicans et de la biologie moléculaire chez les mammifères est essentielle au développement de la prochaine génération de médicaments antifongiques. Cela nécessite des enquêteurs pour pouvoir rapidement et avec précision génétiquement manipuler c. albicans.
La manipulation génétique de c. albicans a toujours été difficile. C. albicans ne maintient pas de plasmides, donc toutes les constructions doivent être incorporées dans le génome. En outre, c. albicans est diploïde ; par conséquent, lorsque assommant un gène ou présentant une mutation, il est important de veiller à ce que les deux copies ont été changé4. En outre, certains loci de c. albicans est hétérozygotes, complique encore interrogatoire génétique5. Pour manipuler génétiquement c. albicans, il est courant d’effectuer plusieurs tours de recombinaison homologue6. Toutefois, la nature diploïde du génome et du développement de la construction laborieuse ont fait cela un processus potentiellement pénible, surtout si plusieurs modifications sont nécessaires. Ces limitations et l’importance médicale de c. albicans exigent l’élaboration de nouvelles technologies qui permettent aux chercheurs de manipuler plus facilement le génome de c. albicans .
Cluster régulièrement dois‑je courtes palindromes répétitions (CRISPR)-édition de génome de médiation est un outil puissant qui permet aux chercheurs de modifier la séquence du génome. CRISPR nécessite trois éléments : 1) la nucléase Cas9 qui Clive l’ADN cible, 2) 20 guide RNA qui cible Cas9 à la séquence d’intérêt de base et 3) réparer l’ADN de modèle qui répare le site de clivage et intègre le changement prévu7, 8. Une fois le guide apporte Cas9 à la séquence du génome de cible, Cas9 nécessite une séquence de motif adjacent (PAM) de protospacer (NGG) directement en amont de la séquence de guide pour cliver l’ ADN9. L’obligation pour le guide de base 20 et séquences de PAM offre un haut degré de spécificité de ciblage et limite le clivage hors cible.
CRISPR systèmes ont été conçus pour modifier le génome d’un ensemble diversifié d’organismes et de s’attaquer à une grande variété de problèmes10. Décrit ici est un protocole CRISPR souple et efficace pour l’édition d’un gène de c. albicans d’intérêt. L’expérience introduit un codon stop à un gène, provoquant la résiliation de la traduction. Autres modifications peuvent être effectuées selon le modèle de réparation qui est introduit. Un fragment marqué avec nourséothricine (Natr) contenant des levures codon optimisé Cas9 (CaCas9) et un guide RNA est intégré dans le génome de c. albicans dans une ville neutre. Co-transformation avec le modèle de réparation codant la mutation désirée conduit à réparer du clivage par recombinaison homologue et la modification du génome efficace. Décrites ci-dessous, c’est l’édition de TPK2, mais tous les c. albicans lecture trames peuvent être ciblés plusieurs fois par CRISPR ouvert. Le système CRISPR est flanqué des sites FRT et peut être enlevé du génome de c. albicans par induction de flippase codé sur le plasmide d’expression CaCas9. Le système de c. albicans CRISPR permet aux enquêteurs avec précision et rapidement modifier le c. albicans génome11,12.
C. albicans CRISPR efficacement modifie le génome de c. albicans . pV1524 code pour une levure Cas9 codon optimisé et est conçu de sorte que les enquêteurs peuvent facilement cloner guide RNA séquences en aval du promoteur (Figure 1) CaSNR52 11. Il faut s’assurer que qu’une seule copie de la séquence du guide a été clonée en vecteurs d’expression CaCas9 en séquençant, comme des copies supplémentaires n’entravera génome édition. Si plusieurs copies du guide sont introduits régulièrement, on devrait abaisser la concentration du recuit guide utilisé dans la ligature. Le vecteur et le protocole décrit permettent de cibler n’importe quel gène de c. albicans . Bien que c. albicans est diploïde, seulement une seule transformation est requise afin de cibler les deux allèles d’un gène. En outre, la nature processive de CRISPR-CaCas9 génome édition permet aux chercheurs de cibler plusieurs membres des familles de gènes. Plusieurs familles de gènes tels que les protéases aspartyl sécrétées (SAPS) et les protéines agglutinin-like sequence (ALS) sont importants pour la virulence de c. albicans . CRISPR génome modification facilitera l’investigation de ces familles de gènes.
Les protocoles décrits ci-dessus introduisent un codon d’arrêt à une trame de lecture ouverte, ce qui entraîne l’équivalent phénotypique d’une valeur null (Figure 2). Une grande variété d’alternances génétiques est possible en modifiant le modèle de la réparation. Non-sens, faux-sens et mutations silencieuses peuvent être insérées par recombinaison avec un modèle de réparation approprié. Incorporation d’un site de restriction rationalise le transformant du dépistage, que ceux sans doivent subir un dépistage en séquençant12,13. En outre, c. albicans CRISPR permet aux chercheurs de générer les insertions et suppressions, ce qui en fait un système idéal pour insérer des balises affinité, effectuer des échanges entre promoteurs et générer des débouchures (Figure 3). Dépistage des transformants correctes de ces mutations est plus laborieuse, comme il se doit séquencer les modifications afin de confirmer l’intégration correcte des modèles de réparation. En outre, Southern blot peut être nécessaire de s’assurer que des copies supplémentaires d’un gène n’ont pas été insérés autres collectivités dans le génome. L’exigence du site NGG PAM places limites légères sur les régions du génome qui peuvent être ciblés. Le développement de systèmes alternatifs de CRISPR qui utilisent des nucléases alternatives telles que Cpf1 ou variations sur le Cas9 système avoir/vouloir soulager bon nombre de ces limites14. À la connaissance des enquêteurs en ce moment, la ces systèmes n’ont pas encore été appliquées à c. albicans.
Le système CRISPR décrit dans le protocole ci-dessus a été développé telle qu’elle peut être appliquée dans une grande variété d’espèces dont l’agent pathogène humain Candida glabrata11, Naumouozyma castelliiet Saccharomyces cerevisiae . Transformation et un montage efficace de ces levures nécessite de légers changements au protocole décrit, mais le cadre pour le montage de ces génomes remplaçant est remarquablement similaire à celle décrite pour c. albicans12. En outre, levure fournissent un excellent mécanisme pour développer le génome procédures d’édition. Chez la levure, lorsque ADE2 subit une mutation, un précurseur de la voie de biosynthèse de l’adénine s’accumule, transformant les cellules rouges. Ce phénotype facilement observable permet aux enquêteurs pour identifier les cellules édités et dépanner rapidement génome édition des protocoles. Combiné avec la boîte à outils de la biologie moléculaire une vaste disponible pour les champignons, les protocoles pour l’édition de nombreuses espèces de levures ont été développés15,16. Telle une large application de technologie d’édition du génome chez les champignons a le potentiel d’impact significatif sur une grande variété de disciplines scientifiques.
CRISPR a grandement amélioré l’efficacité de l’ingénierie du génome chez c. albicans, mais à ce jour CRISPR n’a pas été utilisé pour effectuer des écrans larges de génome chez c. albicans. Les protocoles actuels exigent un modèle de réparation à introduire des mutations, comme la fin non-homologues rejoindre voie chez c. albicans est inefficace12. La génération de réparation modèle oligos pour chaque gène est un obstacle majeur à la réalisation d’écrans de génome. La confluence de la diminution des coûts de la synthèse d’ADN et avances aux technologies CRISPR fera développement de bibliothèques de suppression plus faisable. Par exemple, l’expression d’un modèle de réparation du vecteur CaCas9 ouvre la voie pour le développement de bibliothèques de plasmide durable qui ciblent chaque gène11. Par ailleurs, des protocoles CRISPR Candida transitoires qui ne nécessitent pas de vecteur d’expression CaCas9 intégrer dans le génome de c. albicans ont été développés17. En outre, augmenté guide expression augmentations génome édition efficacité18. Ceux-ci et autres avances aux technologies CRISPR, sont cruciaux pour le développement d’écrans tout le génome de c. albicans19,20,21,22.
Le génome de c. albicans est diploïde, mais A et allèles B ne sont pas toujours identiques5. Cette hétérozygotie fournit les défis et les opportunités. Si on veut cibler les deux allèles, un site PAM, séquence de guide et un modèle de réparation qui agit sur les deux copies du gène doivent être utilisés. Toutefois, selon polymorphismes présents dans un gène, le système CRISPR C.albicans permet enquêteurs de cibler un seul allèle. Cette précision a le potentiel pour permettre aux enquêteurs d’examiner les différences fonctionnelles entre les allèles. Ciblage des allèles spécifiques doit être fait soigneusement, car perte d’hétérozygotie (LOH) à un allèle ou d’un chromosome entier a été observée. Lors de l’édition unique de c. albicans allèles, il faut examiner des séquences d’ADN adjacentes afin de déterminer si un clone a maintenu un profil SNP diploïde. En outre, hors cible effets sont assez faibles pour c. albicans CRISPR, mais le séquençage du génome entier peut être envisagée pour les souches clés.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Dr Gennifer Mager pour lecture et commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le Fonds de démarrage pour le laboratoire Ball State University et NIH-1R15AI130950-01 à D.A.B.
Chemicals | |||
Agar | BD Bacto | 214010 | |
agarose | amresco | 0710-500G | |
Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
LB-Medium | MP | 3002-032 | |
Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
Equipment | |||
Electrophoresis Appartus | |||
Incubator | |||
Microcentifuge | |||
PCR machine | |||
Replica Plating Apparatus | |||
Rollerdrum or shaker | |||
Spectrophotometer | |||
Waterbath |