Article de méthode

À l’aide d’un bactérie pathogène à sonde pour réponses cellulaires et organismique au niveau de l’hôte

DOI :

10.3791/58775

⸱

22 février 2019

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1Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, University of Illinois College of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons les deux tests in vitro et in vivo de l’infection qui peuvent être utilisés pour analyser les activités des facteurs de l’hôte-codage.

Résumé

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Il existe une variété de stratégies de bactéries pathogènes emploient pour survivre et proliférer une fois à l’intérieur de la cellule eucaryote. Les pathogènes dits « cytosoliques » (monocytogenes de Listeria, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensiset Rickettsia SPP.) avoir accès dans le cytosol des cellules infectées par physiquement et par voie enzymatique dégrade la membrane vacuolaire primaire. Une fois dans le cytosol, ces agents pathogènes se multiplient tant que génèrent des forces mécaniques suffisantes pour pénétrer la membrane plasmique de la cellule hôte afin d’infecter de nouvelles cellules. Ici, nous montrons comment cette étape terminale du cycle cellulaire infection de L. monocytogenes (Lm) peut être quantifié par les dosages d’unité formant colonie et cytométrie en flux et donner des exemples de comment les deux effets de facteurs encodés en agent pathogène et hôte ceci processus. Nous montrons également une correspondance étroite de Lm dynamique de l’infection des cellules cultivées infectés in vitro et celles des cellules hépatiques provenant de souris infectés in vivo. Ces dosages selon les fonctions sont relativement simples et peuvent être facilement transposés pour écrans de haut débit basé sur la découverte de modulateurs de la fonction des cellules eucaryotes.

Introduction

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Axée sur l’infection des modèles expérimentaux sont intrinsèquement difficiles en raison de leur dépendance sur les conditions initiales d’état de l’hôte et pathogène, les différentes stratégies d’infection pathogène et la difficulté d’attribuer pathogène et hôte-processus axés sur basé sur les résultats. La bactérie Listeria monocytogenes (Lm) est devenu un pathogène idéal pour sonder les réactions de défense de l’hôte en raison de sa traçabilité génétique et microbiologique, sa stratégie d’infection cellulaire rapide et processive et le relativement claire relation entre les phénotypes de ses niveaux cellulaires et organismique infection. L’infection cellulaire de Lm passe par quatre phases distinctes1: (i) invasion cellulaire qui se termine par Lm être enfermé dans une vacuole ; (ii) Lm-a ordonné la dissolution de la membrane de la vacuole et libération de Lm dans le cytosol ; (iii) réplication d’intracytosolic ; et (iv) la pénétration physique de la membrane plasmique qui entraîne soit l’infection des cellules directement adjacentes (par exemple dans une feuille épithéliale) ou, dans les cellules solitaires, libération de Lm dans le milieu extracellulaire. Chacune de ces phases sont promus par spécifique Lm-codé facteurs (appelés « facteurs de virulence ») qui, lors de la suppression, causer des infections congénitales chez modèles cellulaires et animaux. Cette stratégie d’infection générale a évolué indépendamment par un certain nombre des dits pathogènes « cytosolique »2.

Tests d’unité (CFU) formatrices sont largement utilisés pour évaluer les deux études in vitro (c.-à-d., cellulaire) ainsi qu’in vivo (c.-à-d. organismique) résultats infection. En plus de leur grande sensibilité, notamment pour les infections in vivo, UFC essais fournissent un affichage sans ambiguïté l’invasion de l’agent pathogène et survie intracellulaire/prolifération. CFU dosages ont été largement utilisées pour analyser fois Lm et hôte déterminants de cellules qui ont une incidence d’infection. Aussi instructif que ces études préalables ont été d’analyser l’invasion cellulaire et réplication intracytosolic, UFC dosages ont pas, au meilleur de notre connaissance, été utilisés pour suivre la quatrième phase du processus d’infection Lm : évasion cellulaire. Nous décrivons ici relativement simples moyens d’évacuation comment cellulaire (ci-après dénommée « émergence ») peuvent être contrôlés par dosage de l’UFC (ainsi que par cytométrie en flux) et voir l’exemples de comment ces deux facteurs encodés en agent pathogène et hôte réglementent cette phase de la Lm cycle d’infection. L’analyse de la phase terminale du cycle cellulaire Lm infection peut rendre possible d’identifier l’agent pathogène supplémentaire et des activités et des facteurs d’infection spécifique cellule hôte.

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Protocole

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Souris ont été traitées avec humanité conformément à toutes les directives gouvernementales appropriées pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health et leur utilisation a été approuvées pour cet ensemble de l’étude par les soins animaux institutionnel de l’Université de Miami et le Comité de l’urbanisme (protocole 16-053).

1. préparer des cellules pour une Infection

  1. Propager la lignée de macrophage-comme cellules de souris RAW 264.7 dans les milieux de culture de tissu DMEM additionnés de sérum de veau foetal de 10 % (désormais dénommé DMEM/FCS) à l’aide d’un flacon de 125 mL et un incubateur de culture tissulaire maintenue à 37 °C/5% CO2.
  2. La veille de l’infection, utilisez un grattoir de cellules pour éliminer les cellules de la fiole d’expansion et de s’accumuler dans un tube conique de 15 mL bouchon à vis. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 10 min, décanter le liquide surnageant et suspendre le culot dans 1 mL de DMEM/FCS (sans antibiotiques) et déterminer le titre à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
  3. Ajuster le titre à 2 x 106 cellules/mL et ajouter 0,10 mL (2 x 105 cellules) dans les puits d’un plat de 48 puits vitroplants. S’assurer que la suspension cellulaire couvre toute la surface du puits.
    1. Cellules de plaque dans les puits supplémentaires pour une source plus tard des milieux conditionnés. Aussi placer 0,10 mL de DMEM/FCS dans trois puits supplémentaires pour servir en tant que « aucune cellule contrôle ».
  4. Incuber pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C/5% CO2. Le lendemain, ne pas retirer de l’incubateur, jusqu'à ce que l’inoculum de la bactérie est préparé et prêt à l’emploi.

2. préparation de Listeria monocytogenes (Lm) pour l’infection

  1. Inoculer les 2 mL d’infusion de cerveau-cœur (BHI) avec une seule colonie d’une gélose fraîchement strié (< 2 jours) de Lm et incuber une nuit à 37 ° C sous agitation à 130 tours/min.
  2. Le lendemain, ajouter 0,10 mL de culture durant la nuit à 2 mL préchauffée BHI et continuer en incubation à 37 ° C sous agitation, jusqu'à ce que la densité optique (OD600) se situe entre 0,4 et 0,6.
  3. Définir son titre bactérienne approximative à l’aide d’une formule de conversion empiriquement. Dans notre laboratoire, une culture exponentiellement croissante de Lm en BHI est d’environ 1,3 x 109 colonies formant des unités (UFC) / OD600. Minimiser la durée des cultures bactériennes sont exposés à la température ambiante.
  4. Juste avant l’infection ajuster le titre à 5 x 107 UFC/mL à l’aide de DMEM/FCS préchauffé comme diluant.

3. infection

  1. Travailler rapidement et avec précision, ajouter 20 µL (1 x 106 UFC ; multiplicité d’infection, MOI = 5) de l’inoculum de Lm fraîchement préparés (étape 2.4 ci-dessus) à Herbert George wells en inclinant légèrement le plat et soigneusement en plaçant l’embout de la pipette dans les médias sus-jacente ;
    Remarque : ne pas toucher les parois du puits avec l’embout de la pipette.
  2. Doucement pipette le contenu de chaque puits pour mélange complet ; ne pas secouer ou inclinez significativement la plaque comme cela écartera Lm sur les parois du puits. Retour de Petri cellule à 37 °C/5% CO2 incubateur.
  3. Préparer une solution de gentamicine 10 µg/mL à l’aide de milieux conditionnés des puits non infectés comme diluant.
  4. À 30 minutes après l’infection (mpi), ajouter avec précaution 30 µL de la solution de gentamicine (concentration finale 2,5 µg/mL) et doucement la pipette le contenu de l’avant ainsi que de Petri cellule retour à 37 °C/5% CO2 incubateur.
  5. À 60 mpi, récolter des puits appropriés pour un essai CFU (point de temps de 60 mpi) ou sur analyse FCM (comme décrit ci-dessous dans les sections 4 et 5, respectivement).
  6. Pour les autres cupules, à diverses reprises par la suite soit récolter les cellules comme avant ou, pour le dosage d’émergence de Lm , entièrement supprimer media du puits et le remplacer avec 150 µL de milieux conditionnés sans gentamicine.

4. traitement et analyse des intracellulaire et émergente Lm par UFC dosage de l’échantillonnage

  1. Pour récolter, incliner légèrement le plat et retirez délicatement les médias tout le puits. Ajouter 0,50 mL de l’eau distillée stérile (dsH2O) dans le puits. Après 30 s, l’eau de lysat de transfert (100) à un tube de microtubes de 1,5 mL et vortex vigoureusement pendant 10 s.
  2. Préparer 10-1 et 10-2 dilutions en ajoutant soit 4,5 µL ou 50 µL d’eau lysat de 450 µL de dsH2O et brièvement vortex afin d’assurer un mélange complet.
  3. Répartis 50 µL de la 100, 10-1 ou 10-2 échantillons sur plaques de gélose lysogénie bouillon (LB).
  4. Dosage pour emergent Lm (étape 3.6 ci-dessus), de retirer 10 µL des superposition de médias et de diviser en deux 5 µL d’extraits : une partie aliquote, ajouter 5 µL de DMEM/FCS et à la deuxième portion ajouter 5 µL de DMEM/FCS contenant 5 gentamicine µg/mL. Le contrôle de ce dernier fait la distinction entre extracellulaire Lm (gentamicine sensible) et intracellulaire Lm (gentamicine résistant) dans l’UFC ultérieur de dosage.
  5. Après 5 min à température ambiante, ajouter 90 µL de dsH2O, vortex vigoureusement pendant 10 s et propagation 50 µL sur plaques de gélose LB.
  6. Énumérer les colonies Lm sur plaques de gélose LB après 2 jours d’incubation à 37 ° C.

5. échantillonnage traitement et analyse des intracellulaire et émergente Lm par cytométrie en flux (FCM)

  1. Préparer les 264.7 cellules crues comme décrit aux points 1.1 à 4. Ajuster les cellules à 1 x 106 cellules/mL et ajouter 1 mL (1 x 106 cellules) dans le puits d’un plat de 6 puits culture de tissus.
  2. Préparation des inoculum de bactérie comme indiqué au point 2.1 à 2.3 et infecter les cellules avec le volume d’inoculum correspondant à un MOI de 50 (5 x 107 UFC).
  3. En 1,5 heures après l’infection (hpi), recueillir des médias de la première série de puits et placez dans un tube de microtubes de 1,5 mL avec 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) et le déposer sur la glace jusqu'à ce que tous les puits ont été traitées.
  4. Pour collecter les intracellulaire Lm, ajouter 1 mL de dsH2O au puits et après 60 s, transférer l’eau de lysat pour un tube de microtubes de 1,5 mL avec 500 µL de 4 % PFA. Vortex vigoureusement pendant 10 s et le déposer sur la glace jusqu'à ce que tous les puits ont été traitées. (Traitement de l’échantillon est décrit à l’étape 5.8 ci-dessous.)
  5. Pour les puits restants, retirez les supports et remplacer par 1 mL de DMEM/FCS avec 5 gentamicine µg/mL de tuer extracellulaire Lm et renvoyez les cellules à l’incubateur.
  6. Après 30 min (2 hpi) Retirez les supports et remplacer par DMEM/FCS sans gentamicine.
  7. Après 2 et 4 h (4 à 6 hpi) prendre des deuxième et troisième fois points en recueillant des médias et des lysats sous forme de mesures 5.3 et 5.4.
  8. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 7 min. enlever le surnageant sans culot inquiétante.
  9. Suspendre chaque diabolo cocktail de 50 µL de 4 % de coloration PFA et 15 µL de phalloïdine. Incuber les tubes dans l’obscurité à 4 ° C pendant 20 min.
  10. Après l’incubation, ajouter 1 mL de tampon de FACS à chaque tube et la pipette de haut en bas pour mélanger.
  11. Tissent des tubes à 10 000 x g pendant 7 min. enlever le surnageant sans culot inquiétante.
  12. Suspendre chaque boulette dans 400 µL de tampon de FACS pour une utilisation immédiate, ou 200 µL de tampon de FACS et 200 µL de 4 % PFA si vous entreposez pour une analyse ultérieure.
  13. Exécuter des échantillons sur un écoulement cytometry et analyser les données recueillies.

6. traitement et analyse de la colonisation de la Lm et réactions de l’hôte dans le foie de l’échantillonnage

  1. Préparer le Lm pour l’infection comme indiqué au point 2.1 à 2.3.
  2. Calculer la quantité nécessaire de repiquer pour titre désiré de 3 x 106 UFC/mL.
  3. Juste avant l’infection diluer la quantité de bactéries calculées avec de Hank préchauffé Balanced Salt Solution (HBSS) dans un volume final de 1 mL. Il s’agit de l’inoculum d’entrée qui est injecté dans la souris.
  4. À l’aide d’une seringue à insuline 28 G½ 100U, tirer 100 µL (3 x 105 UFC) d’inoculum d’entrée et éliminez les bulles d’air visibles.
  5. Placez la souris (souche C57BL/6 ; les hommes entre 6 et 12 semaines) dans le dispositif de retenue de tenue et utilisez l’eau chaude (pas plus de 45 ° C) pour dilater la veine caudale, puis injecter l’inoculum d’entrée dans la veine.
  6. Plaque 10-2 et 10-3 dilutions de l’inoculum d’entrée sur des plaques de 10bcm LB agar et incuber une nuit à 37 ° C, afin de déterminer la posologie d’entrée réelle.
  7. À 18 hpi, humainement euthanasier souris (CO2 asphyxie suivie par dislocation cervicale) et à l’aide de péritoine souris ouvert coupe ciseaux stériles pour recueillir le lobe frontal du foie à l’aide de paires distinctes des pinces et ciseaux pour l’extérieur et l’intérieur de la souris. Placer le foie dans une boîte de pétri sur glace de 6 cm.
  8. Couper le foie en petits cubes et les placer dans un flacon en verre avec un bar d’agitation magnétique. Ajouter 2 mL de collagénase de 2 mg/mL D reconstituée en DMEM sans FCS. Incuber les flacons à 37 ° C dans un agitateur magnétique pendant 30−45 min. Une fois que le tissu soit homogène, ajouter 3 mL de DMEM/FCS pour inactiver la collagénase.
  9. Filtrer les cellules à travers un tamis de cellule de 70 µm dans un tube conique, ajoutant plus de DMEM/FCS si nécessaire.
  10. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C pendant 10 min, éliminer le surnageant et suspendre le culot cellulaire dans 500 µL de tampon ACK à lyser les globules rouges.
  11. Incuber les cellules à température ambiante pendant 5 min dans un tampon ACK. Suspendre les cellules dans 1 mL de DMEM/FCS.
  12. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C pendant 10 min, éliminer le surnageant et suspendre dans 1 mL de DMEM/FCS. Ensuite, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
  13. 1 x 106 cellules de transfert à tube microtubes de 1,5 mL et un essorage pour granuler. Puis suspendre dans 1 mL de dsH2O et vortex à lyser les cellules. Plaque 50 µL sur plaques de LB à non dilué et 10-2 dilutions et incuber à 37 ° C, pour énumérer les Lm pour l’analyse de l’UFC.
  14. 1 x 106 cellules de transfert dans des tubes de FACS pour chaque échantillon de tissu selon le nombre de cellules et laver avec 1 mL de tampon de FACS.
  15. Centrifuger les cellules à 800 x g granulés à 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant.
  16. Préparer un cocktail d’anticorps contenant les anticorps d’intérêt basé sur la concentration recommandée pour chaque anticorps et le tampon de FACS. Pour les quantités recommandées utilisées dans l’analyse, consultez la Table des matières .
  17. Suspendre le culot dans 100 µL d’anticorps cocktail et incuber les tubes dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.
  18. Après incubation, ajouter 2 mL de tampon de FACS dans chaque tube et suspendre les cellules.
  19. Centrifuger les cellules à 800 g de granulés à 4 ° C et éliminer le surnageant. Puis suspendre le culot de 400 µL de tampon de FACS pour une utilisation immédiate, ou 200 µL de tampon de FACS et 200 µL de 4 % PFA si stocker pour plus tard.
  20. Analyser les cellules par cytométrie en flux (voir étape 5.13).

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Résultats

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Évaluation du rôle de l’agent pathogène et l’hôte codé des facteurs ayant une incidence de l’infection cellulaire
En utilisant les conditions de l’infection décrites ci-dessus, 0,15 % du type sauvage d’entrée Lm est récupéré après 1,5 h d’incubation co avec les macrophages (Figure 1A). Dans le h 1,5 subséquentes d’incubation co (3 h après l’infection, hpi), on observe une augmentation de 4 fois dans la récupératio...

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Discussion

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En raison de son programme d’infection cellulaire rapide et processive, Lm est un pathogène idéal pour sonder les activités cellulaires qui ont une incidence de l’infection. Un certain nombre de facteurs de l’hôte ont été identifié qui soit positivement, soit négativement affecter Lm infection cellulaire11,12,13,14. Deux de ces facteurs caractérisés dans notre laboratoire, per...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon de lysage ACKGibco  ;
billes de compensation réactives aux amines ArC  ;Life TechnologiesA10346
BHI (Brain Heart Infusion) bouillonEMD Milipore110493
Passoire à cellules, 70 µ ; mVWR10199-656
Collagénase DRoche11088858001
DMEM media  ;Gibco  ;11965-092
Tubes FACS  ;BD Falcon352054
FBS - Inactivé par la chaleur  ;Sigma-AldrichF4135-500ML
Hanks' Solution saline équilibréeSigma-AldrichH6648-6X500ML
LB agarGrow Cells MSMBPE-4040
LIVE/DEAD Kit de teinture de cellules mortes jaunes fixables  ;Life TechnologiesL349S9
Rhodamine Phalloïdine  ;Thermo FischerR415
SP6800 Analyseur spectralSeringue Sony
28 G 1/2" 1ccBD329461
TPP Culture tissulaire 48 Plaques de puits  ;MIDSCITP92048
TPP Culture tissulaire 6 plaques de puits  ;MIDSCITP92406
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
CD11b  ;BiolegendFlurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70
CD11cBiolegendFlurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418
CD45BiolegendFlurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80BiolegendFlurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8
Invitrogenvivant/mortFlurochrome = AmCyN, dilution = 1/100
Ly6CBiolegendFlurochrome = PacBlue, dilution = 1/200, clone = HK1.4
MHC IIBiolegendFlurochrome = AF 700, dilution = 1/200, clone = M5/114.15.2
NK 1.1BiolegendFlurochrome = BV 605, dilution = 1/100, clone = PK136
A1049201

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Listeria monocytogenesEfflux de pathog nesUnit formant colonieCytom trie en fluxEssai de protection la gentamicineProlif ration intracellulaireInfection de cellules h tesPathog nes cytosoliquesEssai d efflux cellulaireCriblage haut d bit

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