Multiplexage axé Stimulation ultrason avec la microscopie en Fluorescence

Résumé

Stimulation d’ultrasons pulsés faible intensité (LIPUS) est une modalité pour une stimulation mécanique non invasif des cellules endogènes ou machinés avec une haute résolution spatiale et temporelle. Cet article explique comment implémenter LIPUS à un microscope épifluorescente et comment minimiser les différences d’impédance acoustique sur le chemin de l’échographie pour empêcher des objets mécaniques non désirés.

Résumé

En se concentrant des pulsations d’ultrasons de basse intensité qui pénètrent dans les tissus mous, LIPUS représente une technologie biomédicale prometteuse à distance et en toute sécurité manipuler tir neuronaux, sécrétion hormonale et cellules reprogrammées génétiquement. Cependant, la traduction de cette technologie pour des applications médicales est actuellement entravée par un manque de mécanismes biophysiques qui ciblés sens de tissus et de répondre aux LIPUS. Une méthode adaptée pour identifier ces mécanismes serait d’utiliser des biocapteurs optiques en combinaison avec LIPUS pour déterminer qui sous-tendent les voies de signalisation. Toutefois, appliquer LIPUS à un microscope à fluorescence peut introduire des objets mécaniques indésirables en raison de la présence d’interfaces physiques qui reflètent, d’absorber et de réfraction des ondes acoustiques. Cet article présente une procédure pas à pas pour se lient LIPUS microscopes épifluorescente verticale disponible dans le commerce tout en minimisant l’influence des interfaces physiques le long de la trajectoire acoustique. On décrit une méthode simple pour l’exploitation d’un seul élément transducteur et à intégrer la zone focale du capteur de point focal objectif. L’utilisation de LIPUS est illustrée par un exemple de calcium induite par LIPUS transitoires dans les cellules de glioblastome humain cultivées mesurées à l’aide d’imagerie calcique.

Introduction

De nombreuses maladies nécessitent une forme quelconque d’intervention médicale invasive. Ces procédures sont souvent coûteux, risqué, exigent des périodes de récupération et donc ajouter un fardeau aux systèmes de soins de santé. Modalités thérapeutiques non invasifs sont susceptibles de fournir des solutions de rechange sûres et peu coûteuse pour des procédures chirurgicales conventionnelles. Toutefois, les approches actuelles non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne ou de pharmacothérapie sont souvent limités par des compromis entre la pénétration tissulaire, résolution spatio-temporelle et des effets indésirables hors cible. Dans ce contex....

Protocole

1. croissance des cellules sur Film Polyester acoustiquement Transparent

1. Percer une taille de trou de 12 mm au fond d’une boîte de Petri standard de 35 mm à l’aide d’un foret de presse vertical. Déplacez la perceuse lentement et porter une protection oculaire. Retirez les morceaux de plastique attachés au fond du plat à l’aide d’une lame pour créer une surface lisse sur la face externe (Figure 2).
2. Appliquer une fine couche d’époxy de qualité marine ou de la colle à la surface externe de fond du plat.
3. Placer un film de polyester (2,5 µm d’épaisseur) sur la surface externe bas du plat et appuyez fermement pour ....

Résultats

La figure 5 est un exemple d’expérience LIPUS multiplexé avec imagerie calcique. Cellules de glioblastome (A-172) ont été cultivées sur film polyester EMPM enduit dans le milieu de culture standard (additionné de 10 % de sérum et de 1 % des antibiotiques) et incubés avec le journaliste fluorescent sensible au calcium Fluo-4 AM. Cellules ont été photographiés à l’aide d’un objectif d’immersion X 10 et éclairé par une source de lumière LED blanche et la lumière.......

Discussion

Un avantage principal des ultrasons focalisés est sa capacité à livrer non invasive énergie mécanique ou thermique d’échantillons biologiques avec une grande précision temporelle. Autres techniques destinés à stimuler mécaniquement des cellules habituellement employer envahissantes sondes physiques (p. ex., cellule-piquer) ou requiert l’interaction des faisceaux lasers de haute énergie avec des objets étrangers (p. ex., les pinces optiques). Chauffage magnétique peut chauffer les emplacements spatiaux s.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
microscope droit avec grand volume de travail	Thorlabs	CERNA
microscope droit avec grand volume de travail	Scientifica	SliceScope
composants optomécaniques	Thorlabs	n/a
hydrophone à aiguille	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T série + préamplificateur
hydrophone à aiguille	Précision Acoustique	n/a
hydrophone à fibre optique	ONDA Corporation	Hydrophone à fibre optique série HFO
	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4 canaux 70MHz)
générateur de fonctions	Keysight Technology	33500B (20MHz monocanal)
Amplificateur de puissance RF	Industries de la navigation électronique (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
Amplificateur de puissance RF	Électronique & L’innovation (E& I)
Sonde à ultrasons à immersion	Olympus	ultrasons
immersion	Instrument Benthowave	Transducteur HiFu Série BII-76
Sonde à ultrasons	à immersion Precision Acoustics	Transducteurs piézo-céramiques ou HiFu Sondes
ultrasons à immersion	Ultrasonic-S-lab	Transducteurs HiFu fabriqués sur commande
haute densité Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Film Mylar 2,5 microns	Chemplex	CAT.NO:107

AH/G focalisée Transducteur à à à