Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Summary

Cet article illustre une méthode puissante pour quantifier les mitochondries ou lysosomes dans les cellules vivantes. La combinaison de colorants spécifiques lysosome ou mitochondries avec des anticorps fluorescent conjugués contre marqueurs de surface permet la quantification de ces organites chez les populations de cellules mixtes, comme les cellules primaires récoltées dans des échantillons de tissus, en utilisant cytométrie en flux multicolore.

Abstract

Les cellules T utilisent différents programmes métaboliques pour correspondre à leurs besoins fonctionnels au cours de la différenciation et la prolifération. Les mitochondries sont des éléments cellulaires essentiels chargés de fournir l’énergie cellulaire ; Cependant, excès mitochondries produisent également des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui pourraient provoquer la mort cellulaire. Par conséquent, le nombre de mitochondries doit sans cesse être ajusté pour répondre aux besoins des cellules. Présent règlement dynamique est obtenue en partie grâce à la fonction de lysosomes qui éliminent les macromolécules et les organites excédent/endommagé. Cellulaire mitochondrial et lysosomal du contenu est donc des indicateurs clés pour évaluer l’adaptation métabolique des cellules. Avec le développement de sondes d’organites, lysosome bien caractérisé ou colorants spécifiques mitochondries sont devenues disponibles en divers formats d’étiqueter les mitochondries et les lysosomes cellulaires. Multicolor cytométrie en flux est un outil commun aux phénotypes cellulaires profil et a la capacité d’être intégrée aux autres épreuves. Nous présentons ici un protocole détaillé de comment combiner des colorants d’organite spécifique avec des marqueurs de surface souillure pour mesurer la quantité des lysosomes et des mitochondries dans les populations de différentes cellules de T sur un cytomètre en flux.

Introduction

L’activation et la prolifération des lymphocytes T sont des étapes cruciales pour le montage des réponses immunitaires réussies. Les progrès récents suggèrent que le métabolisme cellulaire est étroitement liée à la fois le développement et les fonctions des cellules T. Par exemple, les cellules naïves T s’appuient en grande partie sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour répondre à la demande d’énergie au cours de la recirculation parmi les organes lymphoïdes secondaires. Lors de l’activation, naïve T cellules subissent une reprogrammation métaboliques drastiques, y compris l’induction de la glycolyse aérobie pour augmenter la production d’ATP et de remplir les ....

Protocol

La procédure de récolte de tissus de souris décrite ici a été approuvée par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université nationale Yang-Ming.

1. préparation des lymphocytes Suspension des organes lymphoïdes

1. Euthanasier la souris par une méthode approuvée telles que l’inhalation de la CO₂ dans un compartiment transparent acrylique, suivie d’une dislocation cervicale pour s’assurer de la mort.
   NOTE : Conserver le débit de CO₂ pendant un déplacement de 20 % par minute de la chambre et ne dépassant pas 5 psi (livres par pouce carré). Il faut 2-3 min pour une souris de perdre conscie....

Results

Identification de sous-ensembles majeurs des lymphocytes T dans la rate et le thymus

En bref, des suspensions de cellules simples de la rate et le thymus ont été lysées de globules rouges, incubées avec 2.4G2 surnageant, suivies d’organite spécifique colorant et marqueur de surface coloration avec l’anticorps conjugué à fluorescence (tableau 1). La progression du développement des thymocytes peu.......

Discussion

Ce protocole combine organite spécifique colorants et marqueur de surface coloration afin de quantifier la quantité de mitochondries ou lysosomes dans les populations de différentes cellules de T. Cette méthode a été développée pour contourner la limitation de cellule nombre et homogénéité les exigences pour les méthodes traditionnelles, telles que la microscopie électronique et l’analyse par immunotransfert. Il est particulièrement utile dans l’analyse de populations cellulaires rares et examiner simultanément plusieurs.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pince Graefe 10 cm (droite et dentelée)	Ciseaux à iris Dimeda
11 cm (droits avec têtes pointues/pointues)	Tube à centrifuger Dimeda
15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650
Seringue 5 mL	TERUMO  ;
Boîte de Pétri 6 cm	&alpha ;-plus
70 µ ; Crépine à cellules en nylon SPL	Lifesciences	93070
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)   ;   ;	Sigma	A9434
Anti-souris CD25	Biolegend	102007	Clone :PC61
Anti-souris CD4	Biolegend	100453	Clone :GK1.5
Anti-souris CD44	Biolegend	103029	Clone :IM7
Anti-souris CD62L	Biolegend	104407	Clone :MEL-14
Anti-souris CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
TCR&beta anti-souris ;	Biolegend	109233	Clone :H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Tube en polystyrène à fond rond (tube FACS)	BD Biosciences	352052
Sérum de veau fœtal (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl pipérazineéthanesulfonique (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Acides aminés non essentiels (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green	FM Thermo Fisher Scientific	M7514
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122
potassium (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Solution d’iodure de propidium	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 milieu (poudre)	Gibco	31800089
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma	S5761
Pyruvate de sodium (100 mM)	Gibco	11360070