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Induction of Intestinal Graft - versus - host Disease and son évaluation endoscopique Mini souris vivantes

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DOI :

10.3791/58871

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11 février 2019

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1Department of Internal Medicine 1, University Erlangen-Nürnberg, University Hospital Erlangen, 2Institute of Pathology, Department of Nephropathology, University Hospital Erlangen, 3Deutsches Zentrum Immuntherapie (DZI), University Hospital Erlangen

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole qui décrit l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permet répétitives évaluations mini-endoscopique du côlon distal in situ pour la présence, les caractéristiques et gravité de l’inflammation du côlon dans live souris souffrant d’intestinal graft - versus - host disease.

Résumé

Aiguë graft - versus - host disease (GvHD) représente la complication la plus sévère que les patients subissant déjà visage (allo-HCT) la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques et est souvent associée à un mauvais pronostic clinique. Certain temps, par exemple, des manifestations de greffon contre l’hôte de la peau sont généralement sensibles aux traitements immunitaire-suppressive reconnus et, par conséquent, ne prennent un cours fatal, la présence et l’intensité de la GVH intestinale, en particulier des pièces milieu-à-bas du tube digestif, fortement influencer le résultat et globalement la survie des patients atteints aiguë GvHD. options thérapeutiques sont essentiellement limitées aux agents immunitaire-suppressive classiques produisant seulement des effets modérés-atténuer les maladies. Ainsi, une connaissance détaillée sur la cascade immunitaire tissu-résident, les changements dans le microbiote intestinal et la réaction stromale avant, après et après l’apparition de GVH intestinale sont nécessaires d’urgence pour comprendre les événements et les mécanismes qui sous-tendent sa pathogénie et d’élaborer des options thérapeutiques innovantes. Modèles murins de greffon contre l’hôte sont souvent employées pour identifier et évaluer fonctionnellement les molécules et les voies présumément conduite GVH intestinale. Cependant, moyens spécifiquement, surveiller et évaluer l’inflammation intestinale dans le temps ne manquent essentiellement puisque les scores établis pour évaluer et GVH aiguë de grade sont systématiquement composées de divers paramètres qui reflètent plutôt la GvHD systémique manifestations. L’évaluation détaillée de la GVH intestinale a été limitée aux études en utilisant des souris euthanasiés, excluant ainsi essentiellement longitudinal (c.-à-d., cinétique) analyses du compartiment colique sous une condition expérimentale donnée (p. ex., médiée par les anticorps blocage d’une cytokine pro-inflammatoire) à des souris vivantes (c.-à-d. in vivo). L’évaluation in situe mini-endoscopique du côlon distal des souris traitées allo-HCT décrite ici permet une) une évaluation macroscopique détaillée des différents aspects de l’inflammation intestinale et b) la possibilité de recueillir des échantillons de tissus pour des analyses en aval à divers moments au cours de la période d’observation. Globalement, l’approche endoscopique mini fournit une avancée majeure dans le suivi non invasif préclinique et évaluation de GVH intestinale.

Introduction

Malignités hématopoïétiques qui résultent directement du compartiment de cellules souches hématopoïétiques et incontrôlée, progresse rapidement et graves troubles immunitaire sont souvent des indications pour effectuer des allo-HCT1,2. Cependant, bien que représentant l’apparition de la réponse de graft-versus-tumeur bénéfique pronostique, lymphocytes du donneur sont fréquemment induisant et promouvoir une attaque immunitaire indésirable des composants des tissus sains dans le destinataire allo-HCT , un processus qui est appelé graft - versus - host disease3. Manifestations dans le tube digestif, le soi-disant GVH intestinale, représentent la complication la plus redoutée du greffon contre l’hôte aiguë, des formes sévères qui sont systématiquement associées à une mortalité élevée1,2,4.

Modèles dans l’ensemble, murins de allo-HCT sont devenus des outils précieux pour identifier et étudier les mécanismes à médiation immunitaire qui sous-tendent la pathogénie du greffon contre l’hôte5. Cependant, cinétique évaluation de, par exemple, les effets bénéfiques de nouvelles interventions thérapeutiques au fil du temps chez les souris vivent régulièrement repose sur la détermination du greffon contre l’hôte clinique scores6. Alors que ces scores sont adaptés afin de tenir compte, par exemple, la global de morbidité (c'est-à-dire la GvHD systémique), clinique scores manque la sensibilité en miroir avec fiabilité les manifestations spécifiques d’organes (par exemple, dans le tube digestif). Par conséquent, conclusions, par exemple en ce qui concerne les effets de protection intestinale d’une intervention thérapeutique donnée, qui reposent sur ces notation systèmes habituellement tombent à courtes.

Malgré des avancées importantes grâce à l’invention de nouveaux corps modalités en combinaison avec l’utilisation de deux souris génétique bioluminescent ou fluorescent modèles7,8, directement et spécifiquement des méthodes d’imagerie évaluer l’intestin manifestation du greffon contre l’hôte chez les souris vivantes font défaut. Par conséquent, la raison d’être du protocole de l’évaluation endoscopique du phénotype GVH intestinale décrit dans la section suivante est de surmonter cet obstacle. En outre, la motivation est également de réduire le nombre de souris expérimental puisque, jusqu'à présent, une évaluation détaillée des caractéristiques morphologiques, cellulaires et moléculaires (p. ex., par histopathologie ou en biologie moléculaire) de GVH intestinale manifestation a finalement exigé le sacrifice de la souris de laboratoire.

Notre institution a précédemment rapporté sur la méthodologie d’une évaluation des mini-endoscopique des manifestations du côlon au cours de colite syngénique modèles9. Dans le protocole présenté ici, nous avons affiné et adapté le coloscopique marquant la matrice axée sur l’alloresponse ulcéro-hémorragique dans des souris vivantes avec GVH intestinale après transplantation d’alloréactives HCT et donateurs des lymphocytes dans une MHC classe j’ai totalement incompatibles réglage . Nous avons identifié quatre paramètres appropriés pour tenir compte des lésions coliques intestinales axés sur le greffon contre l’hôte. En outre, nous avons établi un système qui permet un classement affiné de n’importe quel déterminant unique, résultant en une nouvelle partition qui facilement informe le lecteur sur la sévérité de la GVH intestinale présente une souris donnée à un moment donné. Les analyses histopathologiques confirment qu’un score endoscopique dépassant un certain seuil est fiable prédire une inflammation des tissus grade modéré à élevé. Il appert donc qu’évaluation endoscopique mini pour représenter un substitut de travail pour l’histopathologie de l’étalon-or qui exige régulièrement le sacrifice des souris expérimentales. Ce qui est important, ce protocole peut être appliqué à pratiquement n’importe quel moment donné et peut être utilisé à plusieurs reprises au cours de la maladie10,11. En outre, contrairement à l’utilisation d’approches axées sur la bioluminescence, aucune mesure de travail intense et longue comme intercrossing génétiquement des souris modifiées n’est nécessaires et, par conséquent, la méthodologie peut être appliquée sur pratiquement n’importe quelle lignée de souris de intérêt.

Pris ensemble, étant donné le point de vue clinique néfaste des allo-HCT diabétiques GVH intestinale sévère, progrès scientifique rapide et mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie immunitaire sont urgent. De même, considérations éthiques importantes exigent que le gain de la connaissance devrait être réalisé avec l’utilisation du nombre minimal des souris de laboratoire. Ainsi, tous les deux reconnu réclamations sur la communauté de recherche explorant la GVH intestinale peuvent être avancées en mettant en œuvre des évaluations endoscopique mini séries du côlon dans la chaîne de travail expérimental pour surveiller et GVH intestinale chez des souris expérimentale direct de grade modèles, tel que décrit et validés dans le protocole présenté ici.

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Protocole

Les méthodes expérimentales décrites ici ont été approuvés par le gouvernement de Mittelfranken, Bavière, Allemagne.

1. GvHD induction

  1. Jour 0 : Irradiation corporelle totale des souris destinataires
    1. Utiliser des femelles CD45.2+ H2kd+ BALB/c souris qui sont vieux comme bénéficiaires d’au moins 10 semaines.
    2. Pesez et consignez le poids des souris avant induction de greffon contre l’hôte destinataires.
      Remarque : S’assurer que le destinataire a un poids minimal de 20 g. Le poids de corps initial servira de la valeur de référence pour calculer la perte de poids de la souris individuelle au cours de l’induction du greffon contre l’hôte et la progression.
    3. Placez la souris jusqu'à cinq dans le conteneur de l’irradiateur de rayons x.
    4. Irradier les souris par irradiation corporelle totale avec une dose unique de 8 Gy de rayons x. Utiliser Cs137 comme une source de rayonnement.
  2. Jour 1 : Reconstitution des souris irradiées avec T-cell-appauvri la moelle osseuse
    REMARQUE :La transplantation de cellules de moelle allogénique, comme décrits et détaillés au chapitre 1.2, devrait avoir lieu dans les 24 h après l’irradiation. Effectuer les procédures décrites ci-dessous dans une culture de tissu stérile hotte et utilisent des réactifs filtrées. Utilisation allogénique CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl souris comme donneurs de T-cellule-appauvri la moelle osseuse.
    1. Euthanasier CD45.1/Ly5.1 B6. Souris SJL qui fera don allogénique de moelle osseuse de cellules conformément aux orientations institutionnelles, 12 à 24 h après l’irradiation des souris BALB/c bénéficiaires. Pour ce faire, anesthésier la B6 CD45.1/Ly5.1. Souris SJL par inhalation d’isoflurane 5 %. Continuer avec l’isoflurane exposition pendant 1 min après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale.
    2. Désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
    3. Position de la souris sur un endroit propre travail gaine afin que la souris est dans une position couchée, avec sa croupe face à l’expérimentateur. Soulevez la fourrure avec la pointe d’une pince de Semken avec une longueur de 13 cm avec embouts dentelée courbe le talon d’Achille. Inciser la peau entre la pince et le talon avec des ciseaux fins durci 8,5 cm avec pointes droites.
    4. S’allongent l’incision lutris (c.-à-d. du talon sur la jambe et la cuisse à la région de la hanche). Retirez la peau et la fourrure de la patte à l’aide de la pince.
    5. Effectuez la même procédure sur l’autre patte.
    6. Supprimer les membres postérieurs en sectionnant les articulations de la hanche adjacentes.
    7. Découper les pattes arrière. Couper à travers l’articulation du genou. Stocker la cuisse et la tige de chaque patte ensemble dans une boîte de pétri 92 mm rempli de tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique sur la glace.
    8. Nettoyer soigneusement les os du fémur et du tibia en supprimant autant le tissu musculaire que possible de chaque cuisse et la jambe. Transférer les os fémur et tibia dans un tube de 50 mL rempli de milieu RPMI 1640 stérile et de la place sur la glace humide jusqu'à ce que tous les os du tibia et du fémur recueillies à l’étape 1.2.7 sont nettoyés de tissu musculaire.
    9. Pour isoler la moelle osseuse, transférer un os du fémur ou du tibia à la fois (ce qui a été nettoyée comme décrit dans étape 1.2.8) du tube 50 mL pour une boîte de pétri (d’un diamètre de 92 mm) rempli de milieu RPMI 1640. Couper les extrémités du fémur ou du tibia avec un scalpel pour accéder à la cavité de l’OS contenant de la moelle osseuse.
    10. Préparer un tube de prélèvement de 50 mL à 5 mL du milieu RPMI 1640. Insérer une aiguille 26 G attachée à une seringue de 1 mL contenant 1 mL de milieu RPMI 1640 dans la cavité osseuse et rincez la moelle osseuse hors de la cavité dans le tube de prélèvement en poussant le piston.
    11. Répétez l’étape 1.2.10 jusqu'à ce que l’OS semble clair et brillant (c.-à-d., la cavité osseuse est visiblement dépourvue de rougeâtre de la moelle osseuse). Jeter l’OS vide.
    12. Répétez les étapes 1.2.9 - 1.2.11, à l’aide de tous les os du fémur et du tibia de l’étape 1.2.8, et collecter toutes les pièces récupérées la moelle osseuse dans le même tube de prélèvement de 50 mL de l’étape 1.2.10. Maintenir le tube de prélèvement sur la glace humide jusqu'à ce que tous les os de l’étape 1.2.8 ont été traitées en conséquence.
    13. Créer une suspension de cellules individuelles en doucement pipettant également les pièces de la moelle osseuse rouge, friable, monter et descendre. Filtrer la suspension de cellules individuelles de la moelle osseuse à travers une passoire de cellule d’écran maille de 40 µm placée sur un nouveau tube de prélèvement de 50 mL.
    14. Centrifuger le tube de prélèvement de 50 mL contenant la suspension monocellulaire de moelle osseuse à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    15. Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse ACK (EDTA 1 mM Na210 mM KHCO3144 mM NH4Cl ; pH 7,2) pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min à température ambiante. Par la suite, immédiatement ajouter 10 mL de solution de PBS à la suspension cellulaire.
    16. Centrifuger la suspension à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 mL de solution de PBS.
    17. Compter les cellules de la moelle osseuse, en utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 6 x 106 cellules pour analyse en cytométrie en flux vérifier la pureté des cellules après purification cellulaire (voir étape 1.2.20).
    18. Pour l’épuisement de cellules de T de la suspension de cellules individuelles de la moelle osseuse, utiliser un kit de purification de cellules disponibles dans le commerce. Magnétiquement appauvrissent les cellules CD90.2+ (c.-à-d., lymphocytes) par les cellules de moelle totale, suivant le protocole du fabricant.
    19. Compter les cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse qui ont été isolés comme indiqué au point 1.2.18, utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 1 x 106 cellules pour analyse en cytométrie en flux à exécuter plus tard, on tel que décrit à l’étape 1.2.20.
      Remarque : Le rendement des cellules en moyenne provenant de souris un donateur est généralement de 2 x 107 à 3.4 x 107 cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse.
    20. Confirmer un épuisement de lymphocytes réussi par cytométrie en flux. 1 x 106 cellules, préservé de la marches 1.2.17 (cellules de la moelle osseuse avant la séparation de la cellule magnétique) et 1.2.19 (cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse après la séparation de la cellule magnétique), avec les anticorps suivants : α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 () GK1.5) et α-CD8α (53-6,7). Utilisez le reste des cellules de l’étape 1.2.17 comme un contrôle non coloré et des contrôles de coloration unique, de mettre en place le cytomètre en flux.
      1. 1 x 106 cellules de transfert de chaque échantillon dans un puits d’une plaque de 96 puits avec fond V pour effectuer la cytométrie en flux flux procédure de coloration.
      2. Tournez en bas des cellules dans la plaque à 96 puits (étape 1.2.20.1) à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS (PBS additionné de 3 % filtré sérum bovin).
      3. Centrifuger les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
      4. Ajouter une quantité appropriée de l’anticorps de choix (à comparer avec l’étape 1.2.20) pour les échantillons pour une coloration unique dans 100 µL de tampon de FACS.
      5. Préparer un mélange de tous les anticorps (master mix) contenant les montants appropriés et suffisants pour colorer séparément les aliquotes de cellules de moelle osseuse préservés du prieur (voir étape 1.2.17) et après (voir étape 1.2.19) magnétique épuisement de lymphocytes T. Ajouter 100 µL du mélange maître pour les deux parties aliquotes.
      6. Ajouter 100 µL de tampon de FACS à l’échantillon non coloré.
      7. Incuber les cellules au sein de la plaque à 96 puits pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité.
      8. Ajouter 100 µL de tampon de FACS et centrifuger des cellules dans la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS.
      9. Centrifuger les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules 250 µL de tampon de FACS.
      10. Transférer les échantillons dans un tube à fond rond 5 mL en polystyrène et analysez-les avec un instrument de cytomètre de flux qui est capable de détecter les molécules fluorescentes qui ont été utilisées pour étiqueter les anticorps utilisés pour caractériser les échantillons de cellules (voir étape 1.2.20).
      11. Comparer la composition cellulaire avant et après la séparation de la cellule magnétique.
        Remarque : Une pureté d’environ 95 % CD45.1+CD3– (c.-à-d., T-cell-appauvri la moelle osseuse) cellules à l’intérieur de la porte direct est habituellement obtenue.
    21. Laver les suspensions de cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse 2 x avec la solution de PBS (450 x g pendant 5 min à 4 ° C) et, enfin, remettre en suspension les cellules dans une solution de PBS, ajuster la concentration en cellules à 5 x 107 cellules/mL. Garder les cellules sur la glace humide jusqu'à ce que l’injection.
    22. Injecter des cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse dans les souris bénéficiaires, qui ont été irradiés à la veille (voir section 1.1).
      1. Placez la souris expérimentale dans une enceinte étanche et induire l’anesthésie par inhalation de jusqu'à 4 % isoflurane, jusqu'à ce que la souris est inconsciente. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
      2. Injecter 5 x 106 cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse (c.-à-d. 100 µL de 5 x 107 cellules/mL) contenant une solution de PBS à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille 30 G par voie intraveineuse dans l’espace rétrooculaire contenant le sinus veineux.
  3. Jour 2 : Transfert des cellules T
    Remarque : Effectuer les procédures décrites ci-dessous sous une hotte de vitroplants stérile et utilisent des réactifs filtrées. Utilisez CD45.2 C57Bl/6 (sauvage ; Souris WT) comme donneurs de cellules alloréactives T. L’utilisation de systèmes de marqueurs congéniques permet la distinction entre le destinataire (CD45.2+ H2kd+ Balb/c souris) et types de donneurs de cellules hématopoïétiques (les cellules de la moelle osseuse : CD45.1+ H2kb+ B6. Souris SJL ; les cellules T allogéniques : CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6 souris).
    1. Euthanasier les souris C57Bl/6 conformément à l’application des lignes directrices et les autorités. Par conséquent, anesthésier les souris par inhalation à une concentration de 5 % isoflurane. Continuer l’exposition isoflurane jusqu'à 1 min après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale. Désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
    2. Placez une passoire avec un grillage de 40 µm sur un tube de prélèvement de 50 mL. Enlever la rate et le placer sur la crépine.
    3. Avec un piston de la seringue, fragmenter la rate dans la passoire. Laver le filtre et le piston de la seringue avec du PBS pour recueillir tous les splénocytes.
    4. Centrifuger les cellules dans le tube de prélèvement de 50 mL à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
    5. Remettre en suspension les splénocytes dans 3 mL de tampon de lyse ACK à lyser les globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min. par la suite, ajouter 10 mL de PBS et centrifuger les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les splénocytes dans du PBS.
    6. Compter les cellules de la rate, utilisant un hémocytomètre. Détourner une partie aliquote de 6 x 106 cellules pour analyse en cytométrie en flux, afin d’évaluer l’ampleur de la purification à l’étape 1.3.9.
    7. Pour un total CD3+ lymphocytes indépendamment des splénocytes totales, utiliser un kit de purification de cellules disponibles dans le commerce. Isoler les cellules spléniques de T, suivant le protocole du fabricant.
    8. Compter le CD3 splénique+ T cellules isolées comme décrit dans l’étape 1.3.7, utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 1 x 106 T cells pour analyse en cytométrie en flux.
      Remarque : Le rendement sur la moyenne de T splénique des cellules par donneur souris isolée par des plages de séparation de cellules magnétiques de 1,3 x 107 2 x 107 cellules.
    9. Confirmer le succès de l’isolement de cellules T par cytométrie en flux. Pour une description détaillée du protocole de coloration, conférer et suivez les étapes 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Tache 1 x 106 splénocytes des étapes 1.3.6 (avant la séparation de la cellule magnétique) et 1.3.8 (après la séparation de la cellule magnétique) avec les anticorps suivants : α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) et le α-CD8α (53-6,7).
      2. Utiliser le reste des cellules de l’étape 1.3.6 comme un contrôle non colorée et pour une coloration unique avec les anticorps respectives, de mettre en place le cytomètre en flux.
      3. Comparer la composition cellulaire avant et après la séparation des cellules magnétiques.
        Remarque : Une pureté ≥ 95 % de CD45.2+CD3+ T des cellules à l’intérieur de la porte direct lymphocyte devraient être accomplis.
    10. Laver le T cells 2 x avec PBS (450 x g pendant 5 min à 4 ° C) et, enfin, remettre en suspension les cellules dans une solution de PBS, ajuster la concentration en cellules à 7 x 106 cellules/mL. Conserver les cellules sur la glace jusqu'à l’injection.
    11. Injecter alloréactives, les cellules T spléniques (voir étape 1.3.10) à des souris BALB/c irradiés qui ont déjà reçu CD45.1+ des cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse (voir étape 1.2.22).
      1. Induire l’anesthésie en plaçant la souris expérimentale dans une enceinte étanche dans laquelle il est exposé à un maximum de 4 % isoflurane jusqu'à ce qu’il perd de sa conscience. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
      2. Injecter de 0,7 x 106 alloréactives CD3+ T des cellules à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille 30 G   (c.-à-d., 100 µL de 7 x 106 cellules/mL) contenant une solution de PBS (voir étape 1.3.10), par voie intraveineuse dans le rétrooculaire espace des souris, pour induire la GvHD. désigner ces souris comme le groupe expérimental.
      3. Injecter 100 µL de PBS seul, un autre groupe de souris par voie intraveineuse dans l’espace rétrooculaire et désigner ce groupe comme le groupe de contrôle, par la suite appelé « non-T-cell-transplantés (pas) des souris ».

2. évaluation du greffon contre l’hôte systémique

Remarque : Exécutez cette procédure dans un environnement semi stérile dans une pièce expérimentale sous licence et équipé pour la manutention des souris vivantes au sein de l’animalerie.

  1. Suivez l’évolution clinique du greffon contre l’hôte chez les souris individuels ; plus précisément, évaluer et marquer les souris expérimentales 3 x par semaine pour la présence de symptômes cliniques de greffon contre l’hôte, basée sur un système de notation décrite ci-dessous et adapté d’un système de notation établi précédemment par Cook et al.,6.
    1. Peser chaque souris individuellement, enregistre le poids et on calcule la perte de poids de corps d’organisation en ce qui concerne le poids du corps qui a été déterminé avant le début de l’expérience (correspondant à 100 %) au jour 0 (étape 1.1.2). Marquer une perte de poids inférieur à 10 % du poids départ avec grade 0, une perte de poids de 10 % à 25 % avec grade 1 et une perte de poids de plus de 25 % avec grade 3.
    2. Marquer le niveau d’activité de chaque souris, souris discriminantes avec un niveau d’activité normal (score = 0) des souris avec un niveau d’activité modérément diminuée (score = 1) et la souris avec un comportement stationnaire sauf s’ils sont stimulés à l’extérieur (score = 2).
    3. Marquer la texture de fourrure, ainsi une discrimination une fourrure normale, brillante et kempt (score = 0) d’une fourrure modérément froissée (score = 1) et la présence de taches chauves (score = 2).
    4. Marquer la texture de la peau, une discrimination peau normale (score = 0) de taches sporadiques de mise à l’échelle de la peau (par exemple, à la queue et les pattes) (score = 1) et évidente mise à l’échelle et les zones de peau sensible (score = 2).
    5. Analyser la cohérence des fractions de selles sécrétées. Marquer des selles avec une normale (c'est-à-dire, consistance dure) avec grade 0, tabouret tabouret déformable et doux avec grade 1 et selles sans aucune cohérence et, par conséquent, avec une diarrhée sévère avec grade 2.
    6. Pour résumer tous les paramètres séparément a reçu un score clinique maximale de 12 par la souris.
  2. Examiner et évaluer les critères de cesser l’expérience par le niveau de gravité de la maladie actuelle de la souris individuel, conformément aux orientations institutionnelles s’appliquant et autorisé le protocole animale.

3. Evaluation des GVH intestinale

  1. La notation des lésions liées à greffon contre l’hôte par mini-endoscopie de la région distale du côlon
    REMARQUE :Exécutez cette fonction dans un environnement semi-stériles dans une pièce expérimentale sous licence et équipé pour la manutention des souris vivantes au sein de l’animalerie. Utiliser un poste de travail mini-endoscopique qui est approuvé pour l’utilisation de petits animaux.
    1. Préparer le dispositif endoscopique en couvrant le télescope avec (de 1,9 mm de diamètre) et d’une longueur de 10 cm avec la gaine de l’examen endoscopique. Nettoyer et stériliser l’endoscope avec l’eau et l’éthanol.
    2. Allumez l’ordinateur, la source de lumière au xénon ajustable et le module de caméra et définir le focus de façon que les objets à proximité de la lentille donnent une image claire.
    3. Branchez la pompe à air à la gaine endoscopique. Afin de visualiser le flux d’air, trempez l’extrémité de l’endoscope dans un bécher de verre rempli d’eau. Réguler le flux d’air en ajustant la valve entre la pompe à air et la gaine endoscopique. Ajustez-le sur un flux d’air lente et constante, reflété par un petit nombre constamment croissant bulles.
    4. Placez une souris dans une chambre étanche. Induire l’anesthésie par inhalation de jusqu'à 4 % isoflurane jusqu'à ce que la souris est inconsciente. Confirmer l’analgésie et un état absent des réflexes en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
    5. Utiliser une machine anesthésie vétérinaire approprié, conformément au protocole d’animaux utilisé. Transférer la souris de la chambre à l’espace de travail de la coloscopie. Ici, position de la souris anesthésiée, avec son nez à la pointe (qui est reliée à l’appareil d’anesthésie), sur un endroit propre travail gaine afin que la souris se trouve dans une position couchée, face à l’expérimentateur avec sa croupe.
    6. Pour maintenir l’anesthésie au cours de la coloscopie, réduire la concentration d’isoflurane à environ 2 %. Surveiller la respiration de la souris et de réponse à la stimulation pendant la coloscopie et ajuster la concentration d’isoflurane au vaporisateur si nécessaire. Couvrir les yeux de la souris avec les onguents pour les empêcher de pénétrer sec.
    7. Contrôler l’efficacité de l’anesthésie en pinçant entre les orteils de la souris. Dans le cas d’absence de réactivité, passez à l’étape 3.1.8.
    8. Soulevez la queue juste au-dessus de la racine de la queue d’une main et introduire l’endoscope, placé dans l’autre main, par l’intermédiaire de l’anus dans le rectum.
    9. Alors que le flux d’air gonfle le lumen colorectal, lentement et soigneusement passer l’endoscope avec impatience en direction aborale.
    10. Placez l’endoscope dans le milieu de la lumière colique et maintenir cette position afin de minimiser le contact avec la paroi du côlon et d’éviter de faire des rayures plus profondes blessures liées au mur (p. ex., entraînant un saignement), ou même mur de perforation (voir étape 3.1.17) . Contrôler cette étape en regardant en permanence le flux vidéo (c.-à-d. en vertu de visualisation constante du compartiment du côlon).
    11. Si les selles contractent la vue, retirer l’endoscope et effectuer un lavement par le rinçage par voie rectale avec jusqu'à 2 mL de solution saline, à l’aide d’une pipette Pasteur douce. Utiliser comme peu de liquide que possible, pour éviter une dilution involontaire des matières fécales et d’autres effets secondaires une incidence négative sur les caractéristiques de la surface de la muqueuse et, finalement, les résultats de notation.
    12. Essayez de placer régulièrement l’endoscope dans un sens (p. ex., distinctes) site anatomique dans le côlon distal de standardiser la notation de l’inflammation du côlon et d’optimiser la comparabilité de la notation des résultats entre les souris et à travers des expériences.
      Remarque : Normalement, avec l’endoscope rigide, une profondeur maximale de 4 cm peut être atteint par voie rectale. Entre 2 et 4 cm d’aborally, le côlon régulièrement se transforme en une flexion qui ne peut pas être passée avec le coloscope rigide. La région du côlon distalement adjacente à la flexion comme le score par défaut place d’aménagement.
    13. Commencer à enregistrer le flux vidéo et commencer avec la notation de l’inflammation.
    14. Évaluer l’inflammation liées à greffon contre l’hôte du côlon en marquant les paramètres expliqués et décrits dans le tableau 1 et la Figure 3.
      1. Déplacer l’endoscope à la notation place doucement et légèrement arrière - et vers l’avant pour évaluer les différents paramètres.
      2. Évaluer le paramètre « translucidité », ainsi que la consistance des selles « », en positionnant l’endoscope dans une plus grande distance par rapport à la paroi du côlon.
      3. Évaluer les paramètres « granularité » et « vascularisation » en positionnant l’endoscope à proximité de la paroi colique. Pour cette tâche, soigneusement tendez bien dosé la paroi colique avec l’extrémité de l’endoscope.
    15. Une fois terminé le processus de notation, arrêter l’enregistrement.
      Remarque : Par la suite, le clip vidéo enregistré peut être utilisé au total ou utilisé pour générer des images représentant des critères évalués par mini-endoscopie dans l’ensemble contribuant à l’inflammation du côlon (c'est-à-dire, les captures d’écran).
    16. Retirer délicatement l’endoscope.
    17. Cessez d’isoflurane exposition en transférant la souris dans une cage séparée dans laquelle il est exposé à l’air ambiant. Chauffer la souris avec une lampe de lumière rouge et observez la souris jusqu'à ce qu’il récupère de l’anesthésique et reprend conscience complète.
      Remarque : En raison de l’inflation d’air du côlon au cours de l’endoscopie, la région abdominale de la souris peut sembler soufflée vers le haut directement par la suite. Tandis que ceci est normal et de nature transitoire, prolongée de signes d’inflation massive et même progressive de l’abdomen et l’échec de la récupération de la souris peuvent indiquer une perforation involontaire du côlon (dans ce cas, la souris doit être euthanasié immédiatement).
    18. Lors de la restauration complète, placez votre souris dans sa cage respective.
    19. Démarche facultative : il est également possible de prendre des biopsies tissulaires guidée par vue. Procédez comme suit.
      Remarque : La coloscopie sera effectuée de la même manière comme indiqué aux paragraphes 3.1.1 - 3.1.18, avec les modifications suivantes.
      1. À l’étape 3.1.1, utiliser une gaine d’examen endoscopique avec un canal de travail intégré, au lieu d’une gaine simple examen sans chaînes de travail, destiné à couvrir le télescope. Introduire une pince à biopsie dans le canal de travail jusqu'à ce que sa pointe est visible en face de l’endoscope à l’écran vidéo, parce que cela empêche en grande partie des blessures non intentionnelles à l’intestin.
      2. Procédez comme 3.1.2 - 3.1.11. Introduire l’endoscope dans le côlon et Poussez délicatement vers l’avant à l’endroit d’intérêt.
      3. Employer l’aide d’un second expérimentateur pour la tâche de prendre des biopsies tissulaires du côlon. Poser le second expérimentateur pour naviguer dans l’extrémité de la pince à biopsie à la région du côlon de choix en appuyant sur la pince dans le canal opérateur lentement vers l’avant jusqu'à ce que les mâchoires de la pince peuvent être ouvert. Regarder sans cesse le flux vidéo au cours de cette procédure pour minimiser le risque de blesser la paroi colique.
      4. Récupérer un échantillon de tissu de la paroi colique en ouvrant et en fermant les mâchoires de la pince à biopsie avec soin.
        Remarque : Faites-le avec prudence afin d’éviter la perforation de la paroi colique. Dans les rares cas d’une perforation du côlon, immédiatement sacrifier la souris touchée par l’application des mesures, conformément aux orientations institutionnelles et sous l’administration continue d’anesthésiques.
      5. Tirer vers l’arrière et enlever la pince fermée sur la chaîne de travail. Retirer l’échantillon des mâchoires de la pince à biopsie par trempage et secouant délicatement la pince ouverte en solution de PBS stérile. Par la suite, choisir des conditions de stockage appropriées pour l’échantillon de tissu, selon les analyses prévues en aval. Après la désinfection avec l’éthanol à 70 %, la pince peut être réutilisée pour prendre de nouvelles biopsies.
      6. Après la prise de biopsies, retirer l’endoscope et terminer la colonoscopie comme décrit aux étapes 3.1.16 - 3.1.18.
  2. Analyse histopathologique
    1. Entre 26 et 30 après l’irradiation aux rayons x jours, euthanasier les souris de allo-HCT bénéficiaires conformément à l’application des autorités et des lignes directrices. Pour ce faire, anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane 5 %. Continuer avec l’exposition isoflurane pendant 1 minute après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale. Bien désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec l’éthanol à 70 %.
    2. Ouvrir la cavité abdominale et retirer le côlon. Transférer dans un plat de pétri (d’un diamètre de 92 mm) avec du PBS.
    3. Remplir un bec doseur de 5 mL de PBS. Avec l’aide d’une pince de Semken avec une longueur de 13 cm avec embouts dentelée courbe, glisser la partie distale du côlon (environ 5 mm) sur l’extrémité de la pointe du distributeur. Avec précaution, fixer le côlon avec la pince à l’extrémité du distributeur et vider le colon avec du PBS en appuyant sur le piston de la pointe du distributeur pour enlever les matières fécales dans l’intestin.
    4. Découper un segment du côlon situé à environ 5 mm de l’anus, à l’aide d’un scalpel.
    5. Difficulté le spécimen d’intestin réséquée en formaldéhyde de 4,5 % du jour au lendemain. Avant d’embarquer dans la paraffine, placez le tissu en position verticale.
    6. Couper 3 µm coupes de tissus inclus en paraffine côlon et tacher les à l’hématoxyline et éosine (HE), à l’aide de protocoles standards de coloration.
    7. Préparer les coupes colorées HE des échantillons de tissus de colon.
    8. Adapté de la matrice de notation rapportée par Kaplan et al.12, score histopathologique l’activité inflammatoire selon une méthode semi-quantitative, avec des scores de 0-3 : aucune inflammation (score = 0), légère inflammation (score = 1), modèrent l’inflammation (score = 2), et une inflammation sévère (score = 3).
      Remarque : Idéalement, utiliser pour cette tâche l’expertise d’un pathologiste expérimenté dans l’évaluation de GVH intestinale murine et aveugle de la nature de l’expérimental et les groupes témoins.

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Résultats

Le protocole actuel, qui décrit l’évaluation mini-endoscopique des lésions intestinales de greffon contre l’hôte associée à du côlon distal, a été établi et validé chez la souris préalablement soumis à l’induction systémique d’un modèle de greffon contre l’hôte aiguë sévère. Dans cette étude, nous avons utilisé un CMH de classe j’ai totalement incompatibles système modèle dans lesquelles BALB/c souris ont été mortellement irradiés, suivie par la transplantation de moelle allogénique T-cel...

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Discussion

Le protocole décrit la méthode d’induction et évaluation mini-endoscopique du côlon phénotype observé au cours de la GVH intestinale. Il a pour objectif plus large de permettre aux scientifiques d’étudier la GVH intestinale longitudinalement et non invasive au cours de toute maladie (c'est-à-dire, dès le début de la manifestation du côlon et de la progression jusqu'à l’activité maximale de la maladie).

Cependant, il y a certaines étapes critiques et des limitations importantes inhérentes aux m...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le centres de collaboration de le recherche (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, 324392634 # ; projet B03) (de K.H.) et CRC 1181 (CRC-DFG, projet B05) (K.H.), tous deux financement par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, fondation de recherche allemande).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Biobeam 2000 Irradiateur gammaGamma-Service Meical GmbH
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich Co., LLC.D8662-6x500ML
Pince Semken (longueur : 13 cm ; pointes dentelées et incurvées)Fine Science Tools11009-13
Ciseaux fins trempés (longueur : 8,5 cm ; pointes droites ; tranchant : 24 mm)Fine Science Tools14090-09
RPMI-1640 MediumSigma-Aldrich Co. LLC.R8758-500ML  ;
Aiguille hypodermique (26 G)B. Braun Melsungen AG4657683
seringue de 1 mLB. Braun Melsungen AG9166017V
Tube de 50 mLSarstedt Ag & Co.KG62 547 254
Passoire à cellules avec une matrice de 40 & micro ; Moustiquaire à maillesm BD Falcon352340
Chlorure d’ammonium (NH4Cl)Sigma-Aldrich Co. LLC.11209ingrédient du tampon de lyse ACK
Acide éthylènediaminetétraacétique sel disodique dihydraté (Na2EDTA)Carl Roth GmbH & Co.KG8043.2ingrédient du tampon de lyse ACK
Bicarbonate de potassium (KHCO3)Merck KGaA1 048 540 500ingrédient du tampon de lyse ACK
CD90.2 Microbilles, sourisMiltenyi Biotec GmbH130-049-101Séparation de cellules magnétiques pour isoler les cellules de moelle osseuse appauvries en lymphocytes T
Pan T Cell Isolation Kit II, sourisMiltenyi Biotec GmbH130-095-130Séparation de cellules magnétiques pour isoler les lymphocytes T spléniques
Alexa Fluor 700 anti-souris CD45.2 Anticorps (clone : 104 ; lot : B252126 ; RRID : AB_493731)Biolegend109822
Pacific Blue anticorps anti-souris CD3 (clone : 17A2 ; lot : B227246 ; RRID : AB_493645)Biolegend100214
FITC anti-souris CD4 Anticorps (clone : GK1.5 ; lot : B225057 ; RRID : AB_312691)Biolegend100406
Anticorps anti-souris CD45.1 PE/Cy7 (clone : A20 ; lot : B217246 ; RRID : AB_1134168)Biolegend110730
APC/Cy7 anticorps anti-souris CD8a (clone : 53-6,7, lot : B247008 ; RRID : AB_312753)Biolegend100714
Sérum bovin filtréPan BiotecP40-47500ingrédient du tampon FACS  ;
Plaques en V en polystyrène 96 puitsGreiner Bio-One651201
Tube à fond rond en polystyrène (5 mL)Falcon352052
BD LSRFortessa II cytomètre en fluxBD Bioscience Co.
Seringue à insuline avec intérieur stérile (30 G)BD324826
Oxy Vet Oxymat 3Eickemeyerpour anesthésie
NarkoVet  ;Chambre enEickemeyer 213062
Eickemeyer214620
Télescope droitKARL STORZ SE & Co KG64301 AAfait partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Gaine de protection et d’examenKARL STORZ SE & Co KG61029 Cfait partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Gaine d’examen avec canal de travailKARL STORZ SE & Co KG61029 Dfait partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Pince à biopsieKARL STORZ SE & Co KG61071 ZJ  ;partie du dispositif expérimental de coloscopie
  ; 175 Watt SCB XenonSource lumineuseKARL STORZ SE & Co KG20132120partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Câble d’éclairage à fibre optiqueKARL STORZ SE & Co KG495 NLfait partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Image 1 S3 Tête de caméraKARL STORZ SE & Co KG22220030partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Image 1 Unité de commande de caméra SCBKARL STORZ SE & Co KG22200020partie du dispositif expérimental pour la coloscopie
LCDOlympusOEV181Hpartie du dispositif expérimental pour la coloscopie
Forane / IsofluranAbbVie Inc.B506
Solution de formaldéhyde 37 %Carl Roth GmbH & Co.KG7398.1
5,0 mL Distributeur d’embouts  ;Eppendorf AG30089456
Concentrateur d’oxygène plexiglas Moniteur

Références

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Mots-clés

GvHD intestinaleHCT allog niqueisolation de la moelle osseused pl tion des lymphocytes Tanalyse par cytom trie en fluxscore endoscopiqueinflammation coliquecorr lation histopathologiquesuivi non invasif

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