Autoradiographie comme une méthode Simple et puissante pour la visualisation et la caractérisation des cibles pharmacologiques

Résumé

La méthode d’autoradiographie est systématiquement utilisée pour étudier la liaison des radioligands sections de tissu pour la détermination de la pharmacologie qualitative ou quantitative.

Résumé

In vitro autoradiographie a pour but de visualiser la répartition anatomique d’une protéine d’intérêt dans les tissus des animaux de laboratoire ainsi que les êtres humains. La méthode est basée sur la liaison spécifique d’un radioligand vers sa cible biologique. C’est pourquoi, coupes de tissus congelés sont incubés avec solution radioligand, et la liaison à la cible est ensuite localisée par la détection de la radioactivité, par exemple, en utilisant le film photosensible ou plaques-images au phosphore. Autoradiogrammes numériques qui en résulte affichent une résolution spatiale remarquable, ce qui permet la quantification et la localisation des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. En outre, quantification permet la caractérisation pharmacologique de l’affinité du ligand au moyen des constantes de dissociation (K_d), les constantes d’inhibition (K_j’ai) ainsi que la densité des sites de fixation (B_max) dans les tissus choisis. Ainsi, la méthode fournit des informations sur la localisation de la cible tant de sélectivité de ligand. Ici, la technique est illustrée avec caractérisation autoradiographique de l’acide de haute affinité gamma-hydroxybutyrique (GHB) accepteurs dans le tissu de cerveau des mammifères, avec un accent particulier sur les considérations d’ordre méthodologiques concernant l’essai de liaison paramètres, le choix de la méthode de détection et de radioligand.

Introduction

Autoradiographie est une méthode qui fournit des images de désintégration radioactive. La technique est couramment utilisée pour étudier la distribution tissulaire d’une protéine d’intérêt en vitro basée sur une interaction pharmacologique spécifique entre un composé radiomarqué et sa cible. Ceci fournit des informations directes sur la sélectivité du ligand pour la cible. In vitro autoradiographie peut également être utilisé pour la détermination quantitative des paramètres de liaison pharmacologique des radioligands, tels que la constante de dissociation (K_d) et la densité des sites de fixation (B_max), ainsi que pour détermine....

Protocole

Tous les animaux de manutention a été réalisée en conformité avec les directives de l’inspection d’expérimentation animale danois.

Remarque : Le protocole décrit ici couvre la préparation du tissu (c.-à-d., tissu de cerveau de souris), l’essai in vitro autoradiographique avec suffisamment de détails pour mettre en place la méthode dans un nouveau laboratoire, l’exposition aux images de plaques au phosphore ainsi que analyse densitométrique subséquente d’autoradiogrammes (Figure 2) dans le but de localiser et quantifier des radioligands dans des structures anatomiques distinctes. Pour comparais....

Résultats

En utilisant le protocole décrit, la répartition anatomique des sites de liaison de haute affinité GHB a été visualisée avec l’analogue GHB radiomarqué [³H] HOCPCA dans le cerveau de souris, qui a été coupé en sections coronales, sagittales et horizontales (Figure 3 ). Des niveaux élevés de liaison ont été observés dans l’hippocampe et le cortex, une liaison plus faible dans le striatum et aucune liaison n’a été détectés dans le cervelet, correspon.......

Discussion

La qualité d’un test autoradiographique est le plus souvent déterminée par la sensibilité au radioligand. Un facteur important est le radio-isotope sélectionné, qui est indiqué par la disponibilité de ligands connus ou de la faisabilité des techniques spécifiques de l’étiquetage à céder des ligands avec une activité spécifique appropriée (c'est-à-dire, la quantité de radioactivité par mole d’unité un radioligand)²³et avec une quantité limitée de dégradation chimique. Un grand nombre de ra.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol absolu	Merck Millipore	107017
Acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Plaque d’imagerie	GE Healthcare Life Science	28956481	20x40 cm - Sensible au tritium
Acétate de violet de crésyle	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (milieu de montage non aqueux pour la microscopie)	Merck Composé Millipore	100579
O.C.T., 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Lames Superfrost Plus Lames	microscope	VWR	631-9483
Kit de coloration manuelle des lames	Sakura Finetek Danemark ApS	4451
Tritium Standard sur verre	Produits chimiques radiomarqués américains, Inc.	ART 0123
Substitut de xylène	Sigma-Aldrich	A5597

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