Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.
Article de méthode
* These authors contributed equally
Nous présentons ici un protocole par étapes pour étudier la respiration mitochondriale et la fonction glycolytique chez Candida Albicans à l’aide d’un analyseur de flux supplémentaires.
Les mitochondries sont des organites essentiels pour le métabolisme cellulaire et la survie. Une variété d’événements importants se déroulent dans les mitochondries, telles que la respiration cellulaire, métabolisme oxydatif, transduction du signal et l’apoptose. Par conséquent, dysfonctionnement mitochondrial est signalé à jouer un rôle important dans la tolérance des médicaments antifongiques et la virulence des champignons pathogènes. Des données récentes ont également conduit à la reconnaissance de l’importance des mitochondries comme un important contributeur à la pathogénèse fongique. Malgré l’importance des mitochondries en biologie fongique, des méthodes normalisées pour comprendre sa fonction sont peu développés. Nous présentons ici une procédure afin d’étudier le taux de consommation d’oxygène basale (OCR), une mesure de la respiration mitochondriale et taux d’acidification extracellulaire (ECAR), une mesure de la fonction glycolytique chez les souches de c. albicans . La méthode décrite ci-après peut être appliquée à n’importe quel Candidaspp. souches sans la nécessité de purifier les mitochondries des cellules fongiques intacts. En outre, ce protocole peut également être personnalisé pour dépister les inhibiteurs de la fonction mitochondriale chez les souches de c. albicans .
Infections fongiques invasives tuent plus 1,5 millions de personnes par an dans le monde entier. Ce chiffre est en hausse en raison d’une augmentation du nombre de personnes vivant avec l’immunité compromise, y compris les nourrissons prématurés âgés, receveurs et cancer patients1. C. albicans est un pathogène opportuniste qui fait partie de la microflore humaine. Il habite également les surfaces muqueuses et le système gastro-intestinal comme un organisme commensal. C. albicans produit une maladie systémique grave chez les personnes ayant des déficiences immunitaires, qui ont subi une chirurgie, ou qui ont été traités avec lo....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Remarque : Le protocole détaillé par étape du dosage est décrit ci-dessous, et le protocole schématique est illustré à la Figure 1.
1. les souches de c. albicans et de conditions de croissance
2. préparation des réa....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
L’objectif de ce protocole consiste à déterminer les fonctions bioénergétiques c. albicans , évaluée par l’analyseur de flux supplémentaires. Un mutant de c. albicans dépourvus de protéines mitochondriales Mam33 est également inclus avec sa souche de complément, mam33Δ/Δ::MAM33 pour étudier les effets de la suppression d’une protéine mitochondriale sur OCR et ECAR. MAM33 code pour une protéine de la matrice acides mitochondriale putatif et sa fonction à.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
La bioénergétique test flux supplémentaire est un outil excellent pour donner lecture de la fonction mitochondriale en mesurant la phosphorylation oxydative (OXPHOS)-dépendante d’oxygéne en temps réel. En outre, une fonction glycolytique qui est mesurée sous forme d’un taux d’acidification extracellulaire (modification du pH extracellulaire) peut également être étudiée en même temps dans l’analyse en temps réel.
Électrodéposition réussie de c. albicans dans la plaque de test est une d.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Les auteurs n’ont rien à divulguer
Recherche dans le laboratoire de NC est soutenue par une subvention du National Institutes of Health (NIH) R01AI24499 et une subvention de la Fondation New Jersey de la santé (NJHF), #PC40-18.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Corning | MT50020PB | |
| Antimycine A | Sigma | A8674 | |
| KCN | |||
| Kit de stress Mito | Agilent | 103015-100 | |
| Oligomycine | Calbiochem | 495455 | |
| pH-mètre | Accumet | AR20 | |
| Rouge phénolique | Sigma | P5530 | |
| Poly-D lysine | Sigma | P6407 | |
| Rotenone | Santa cruz | 203242 | |
| Seahorse XF24 FluxPak | Agilent | 100850-001 | |
| SHAM | |||
| Chlorure de sodium | Amresco ; | 241 | |
| Pastilles d’hydroxye de sodium | J.T Baker | 3722 | |
| Eau de qualité culture tissulaire | Gibco | 1523-0147 | |
| Solution d’étalonnage de test XF | Agilent | 100840-000 | |
| Extrait de levure Peptone Dextrose | Fisher scientific,BP2469 | ||
| Extrait de levure Peptone Dextrose Agar | Sigma | A1296 | |
| Extrait de levure Peptone Glycérol | Sigma | G2025 |
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demander une autorisation