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Summary

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Abstract

Les vaccins sont une merveille médical de 20^ème siècle. Ils ont fortement réduit la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses et a contribué à une augmentation frappante de l’espérance de vie dans le monde entier. Déterminer l’efficacité du vaccin reste néanmoins un défi. Des preuves nouvelles suggèrent que le vaccin acellulaire (aPV) pour Bordetella pertussis (b. pertussis) induit l’immunité sous-optimale. Par conséquent, un défi majeur est de concevoir un vaccin de nouvelle génération qui induit une immunité protectrice sans les effets secondaires d’un vaccin à germes entiers (PVS). Nous décrivons ici un protocole que nous avons utilisé pour tester l’efficacité d’un adjuvant prometteur, roman qui biaise la réponse immunitaire à un phénotype Th1/Th17 protectrice et favorise un meilleur dégagement d’un défi de b. pertussis dans le tractus respiratoire murin. Cet article décrit le protocole de vaccination de souris, l’inoculation bactérienne, tissu récolte et analyse des réponses immunitaires. En utilisant cette méthode, au sein de notre modèle, nous avons avec succès élucidé les mécanismes cruciaux induites par un vaccin acellulaire contre la coqueluche prometteuse génération. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel modèle de maladies infectieuses afin de déterminer l’efficacité du vaccin.

Introduction

Les vaccins représentent l’une des plus grandes réalisations du XXe siècle la santé publique, mais nous ne comprenons toujours pas entièrement les mécanismes par lesquels vaccins efficaces stimulent l’immunité protectrice. L’identification des signatures moléculaires (e.g., marqueurs d’activation cellulaire, expansion des sous-types cellulaires et des caractéristiques de l’expression génique) induite après vaccination fournit une multitude d’informations pour prévoir et générant un efficace réponse immunitaire. La complexité des réponses de l’hôte-pathogène ne peut être reproduite adéquatement à l’aide du systèmes in vitro cell culture¹. Les modèles in vivo vaccin visent à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires chez l’hôte. Cela procure un avantage lorsque caractérisant le vaccin antigène traitement et présentation, la sécrétion de cytokines différentielle et expansion des cellules immunitaires. Le protocole décrit ici fournit une méthode détaillée pour déterminer l’efficacité du vaccin par l’évaluation de la réponse immunitaire systémique et locale et quantification de la charge pathogène dans les tissus d’intérêt. L’exemple fourni ici teste l’efficacité d’un vaccin expérimental pour l’agent pathogène Bordetella pertussis (b. pertussis).

B. pertussis est une bactérie Gram-négative qui est l’agent étiologique de la maladie respiratoire coqueluche (pertussis)^2,3. Contact étroit avec des personnes infectées (symptomatiques ou asymptomatiques) conduit à la transmission, la colonisation et la maladie. Malgré le vaccin global significatif couverture⁴, la coqueluche est considéré comme une résurgence de la maladie dans de nombreux pays dans le monde entier et est des principales causes évitables chez les enfants morts^{5,6,7, 8}. en 2015, b. pertussis et la coqueluche ont été inclus dans l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) émergents liste pathogène/maladies infectieuses, en insistant sur la nécessité pour le développement d’un meilleur vaccin qui confère immunité protectrice longue durée de vie.

Une région active d’enquête pour contrôler la recrudescence de la coqueluche est actuellement, développement d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche de prochaine génération (aPV) avec une combinaison optimale de nouveaux adjuvants et antigènes pour imiter la réponse immunitaire provoquée par la cellule entière coqueluche vaccin (PVS)⁹. En utilisant le protocole décrit, nous avons récemment rapporté que la modification des aPV cours approuvé par la FDA par l’ajout d’un nouvel adjuvant, facteur de colonisation Bordetella A (BcfA), donné lieu à une réduction plus efficace de la charge bactérienne de b. pertussis de poumons de souris^10,11. Cette protection accrue a été accompagnée par l’inclinaison d’une réponse immunitaire Th1/Th2 induite par l’alun au plus protecteur du profil immunitaire Th1/Th17¹⁰. Ce protocole est détaillé et complet, permettant à l’enquêteur se renseigner maximale durant l’évaluation simultanée de l’hôte et de la réponse immunitaire à une variété de pathogènes.

Le protocole décrit ici suit le calendrier de vaccination représentatif, illustré à la Figure 1, pour assurer des réponses immunitaires hôte optimale.

Protocol

Toutes les expériences avec des animaux vivants ont été effectuées selon un protocole approuvé par The Ohio State University IACUC conformément aux lignes directrices IACUC. Les souris C57BL/6 ont été utilisés dans toutes les vaccinations et les infections. Les souris mâles et femelles sont utilisées dans chaque groupe selon les lignes directrices des NIH. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs de puissance basés sur les différences prédites de résultat parmi les groupes expérimentaux. Par exemple, 8 souris par groupe donnera 80 % de la puissance à α = 0,05 (2 côtés) pour un 2-sample t– test pour détecter les différences dans le résultat visé de 1,33 écarts-types (SDs).

1. l’immunisation de souris

1. Préparer un mélange maître vaccin dans un tampon physiologique stérile comme une solution saline ou DPS.
   Remarque : Le volume total du mélange devrait inclure 10 % plus que requis pour la vaccination de l’ensemble du groupe. Les concentrations de la composition du vaccin sont détaillées ci-dessous aux étapes 1.1.1 et 1.1.2. Transporter les éléments pour le vivarium sur la glace.
   1. Pour les études de b. pertussis , comprennent les groupes suivants de vaccin : aPV et aPV + BcfA. En outre, utiliser alun, antigènes vaccinaux seuls (FHA et Prn) et souris (non immunisés) naïves comme groupe témoin.
      NOTE : aPV est 1/5^ème à la dose humaine d’une aPV approuvé par la FDA, qui se compose de l’anatoxine tétanique, anatoxine diphtérique réduite, anatoxine coquelucheuse (AC), hémagglutinine filamenteuse (FHA) et la pertactine (Prn) adsorbée sur sels d’aluminium. Une seule dose humaine de VP de la coqueluche actuelle est de 0,5 mL, 1/5^ème d’une dose est donc 0,1 mL. Volumes d’aPV + BcfA sont de 0,1 mL de la VP (1/5^ème la dose humaine) + 0,046 mL de BcfA (30 µg) par souris. Le volume maximum qui peut être livré en toute sécurité à un muscle est de 0,1 mL. Parce que l’aPV + BcfA vaccin volume est supérieure à 0,1 mL, le vaccin doit être livré dans les deux épaules, répartis à peu près également, afin d’être administré de façon sécuritaire.
   2. Pour préparer un vaccin expérimental, pour une dose mélanger 1 µg de FHA et 0,5 µg de Prn avec 50 µg de gel d’hydroxyde d’aluminium dans du PBS stérile. Permettre l’aPV expérimentale de mélanger sur un rouleau de laboratoire pendant 15 min à température ambiante (RT). Ensuite, faites tourner le tube à 18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et remettre en suspension le contenu dans 1 mL de PBS stérile.
2. Dans le vivarium, mis en place la machine d’anesthésie (Figure 2).
   Remarque : Assurez-vous qu’un niveau adéquat d’oxygène et isoflurane dans leurs réservoirs respectifs avant l’utilisation. Peser la cuve de charognard isoflurane et le remplacer si son poids augmente de 50 g.
3. Nettoyez l’enceinte de sécurité biologique (BSC) et placer la chambre induction propre à l’intérieur de la BSC. Bancher l’anesthésie et charognard de la machine d’anesthésie à la chambre de l’induction. Ouvrir l’oxygène réservoir via le régulateur afin d’assurer l’oxygène circule et définir le niveau de 1,5 à 2 L/min.
4. Placez les souris d’âge désiré (6 à 12 semaines) dans la chambre de l’induction. Allumez l’isoflurane à 2,5 à 3 % pour anesthésier légèrement les souris. Surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils ne se déplacent pas dans la chambre et sa respiration s’est ralentie.
5. Vérifier le niveau d’induction par orteil-pincement, observe depuis n’importe quel mouvement réflexif. S’il n’y a aucune, les souris sont prêts à injecter.
   Remarque : Dans cette expérience, la cage entière d’animaux ont été anesthésiés à la fois. On peut choisir à anesthésier les animaux individuellement pour injection ou à injecter les animaux sans anesthésie. Aucune de ces méthodes est approprié.
6. Pendant ce temps, préparer 1 mL seringues à insuline (28 1/2) avec 0,1 mL de vaccin chaque. Lorsque les animaux est pleinement induites, retirer un animal de la chambre et poser la souris sur le ventre sur une serviette ou un banc de garniture.
7. Administrer le vaccin par voie intramusculaire. Avec la seringue à un angle de 45° et l’angle de biseau vers le haut, insérez la seringue ~ 5 mm dans le deltoïde de la souris et injecter le vaccin.
   Remarque : La biche trimestre/flanc peut être utilisé comme un site d’injection au lieu du deltoïde.
8. Après l’injection, garder l’aiguille insérée dans le muscle pour environ 5-10 s. Une fois que le volume est livré, tourner la seringue à 180° pour que le biseau fait face loin pour créer un joint et empêcher la fuite du vaccin. Ensuite, tirer lentement l’aiguille sur le site d’injection.
9. Retourner la souris à la cage. Répétez la procédure avec tous les animaux dans le groupe désigné.
10. Désactiver l’isoflurane et rincer la chambre induction avec de l’oxygène avant d’anesthésier la cage suivante de souris.
11. Surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils sont tous alerte et émouvant dans la cage. Retourner la cage à l’emplacement du logement.
12. Animaux de surveiller toutes les 12 h après vaccination, vers le haut à 48 h, pour des symptômes cliniques de morbidité comme couche rude/hirsutes, slow gait ou travaillé respiration. Si les symptômes persistent, conférer avec le vétérinaire institutionnel et retirer les souris de l’étude si nécessaire.
13. Quatre semaines après la vaccination initiale, poussée souris par anesthésier et l’administration intramusculaire dans le deltoïde droit de la souris avec la même formule de vaccin qui a été donnée précédemment.
14. Encore une fois, surveiller les animaux pour aucun symptôme clinique. Animaux de la maison pendant 2 semaines supplémentaires et continuer avec l’infection.

2. croissance des souches de b. pertussis et préparation de l’Inoculum Infection

1. De stocks congelés [cryoconservés à-80 ° C à 15 % de glycérol, gelé de croissance planctonique dans Stainer-Scholte (SS) media¹²], strie à b. pertussis sur¹³ géloses de Bordet-Gengou (BG) additionné de mouton défibriné de 10 % sang et 100 µg/mL de streptomycine (10 % BG + Sm) pour la sélection. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 4 jours.
2. Prélever environ 8-10 colonies individuelles des ou des souche s de la plaque et l’inoculer 3 mL de médias SS additionné de 22,8 mM L-cystéine, sulfate ferreux 3,6 mM, niacine 3,3 mM, 48,8 mM glutathion, acide ascorbique 227 mM, heptakis 1 mg/mL et 100 µg/mL de streptomycine. Cultiver la culture à 37 ° C dans un fût de rouleau à 60 tr/min pendant 16 à 24 heures.
3. Le lendemain, diluer la culture primaire 1:600, 1 : 120, 1 : 300, 1/60, 01:30 et 01:15 dans 3 mL de supplémenté SS media. Incuber la culture à 37 ° C dans le fût de rouleau à 60 tr/min pendant 16 à 24 heures.
4. Effectuer des mesures de densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) pour les cultures bactériennes. À l’aide des cuvettes de spectrophotomètre, diluer les cultures 01:10 en ajoutant 0,1 mL de la culture liquide à 0,9 mL de PBS stérile.
5. Sélectionnez une culture avec OD₆₀₀≈ 0,8 et 1,2. Calculer le volume nécessaire pour obtenir 1 OD (Figure 3). Tournez en bas le volume dans un tube de microtubes de 1,5 mL à 6000 x g pendant 5 min à 25 ° C. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire bactérienne dans 1 mL de PBS stérile pour obtenir une densité de 1 OD/mL [1-3 x 10⁹ colonies formant des unités (UFC) par millilitre].
6. Pour préparer un inoculum de ~ 5 x 10⁵ à 1,5 x 10⁶ UFC/souris dans 40-50 µL, vortex et en série, diluer la solution bactérienne (de l’étape 2.5) 100 fois dans 1 mL de PBS stérile pour atteindre environ 1-3 x 10⁷ UFC/mL (Figure 4A). Le transport de l’inoculum pour le vivarium sur la glace.

3. modèle d’Infection intranasale murin

1. Dans le vivarium, définir des conditions d’oxygène et anesthésie comme décrit aux points 1.3 et 1.4. Comme indiqué au point 1.5, placez les souris dans la chambre à anesthésier. Surveiller les animaux jusqu’à ce que l’anesthésie prend effet.
2. Lorsque les souris sont anesthésiés, retirer un animal à la fois de la chambre de l’induction. Soulevez la souris par la peau du thorax dorsal, derrière les omoplates et le cou. Positionner le poteau de la souris pour accéder au nez.
3. À l’aide d’une pointe de pipette 200 µL, appliquer lentement de 40-50 µL de l’inoculum bactérien pour les narines de la souris (20-25 µL dans chaque nare). Maintenez la souris jusqu’à ce que l’inoculum entière a été inhalée par l’animal. Si certains des bulles inoculum dehors, collecter les bulles et re-inculquer dans les narines. Livrer une quantité égale de PBS stérile à un groupe de souris comme contrôle négatif.
4. Que fait en étapes 1.10-1.12, retourner les animaux inoculés à leur cage et surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils soient alerte et émouvant. Ramenez la cage sur son espace de logement original sur la grille. Rincer la chambre induction avec l’oxygène pour enlever l’isoflurane résiduelle avant d’anesthésier la prochaine série d’animaux. Surveiller les animaux pour l’infection après 48 h.
5. En laboratoire, plaque de dilutions en série de l’inoculum, dans du PBS stérile, afin de vérifier l’UFC réelles envoyées aux souris. Plaque de 0,1 mL de la dilution 10 % BG + plaques Sm (Figure 4A). Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C et se développer pendant 4 jours. Compter et calculer l’UFC de l’inoculum livrés à la souris (Figure 4B).

4. la récolte de tissus d’origine animale après Infection

1. Se préparer pour la dissection de la souris et la récolte de tissus.
   1. Stériliser tous les outils (grossiers et fins ciseaux, ciseaux courbes, pince fine, pellet pilons et épandeurs triangle) nécessaires pour le traitement des tissus dans un autoclave. Sceller les outils en sachets de stérilisation. Envelopper les verre dounce homogénéisateurs en papillote et ajouter ruban autoclave pour indiquer la stérilité.
   2. Préparer les jours plaques 1ou 2 agar avant la récolte de tissus pour s’assurer que les plaques sont solidifié avant de l’utiliser. Pour b. pertussis, utilisez 10 % BG + plaques SM. Label pour la cloison nasale, trachée et poumons pour chacune des souris avec des dilutions désirées, déterminée empiriquement pour chaque expérience.
   3. Tubes de dilution UFC remplissage et étiquette. Ajouter 0,9 mL de PBS stérile aux tubes de microcentrifuge stérile de 1,5 mL base le nombre sur des organes à des processus et des dilutions par organe.
   4. Tubes de remplissage ou étiquette pour prélèvement tissulaire :
      1. Cloison nasale et la trachée : remplir un tube de microtubes stériles de 1,5 mL avec 0,3 mL de caséine stérile de 1 % dans du PBS (Ca^{2 +} et Mg^{2 +}-libre). Conserver à 4 ° C.
      2. Poumons : ajouter 2 mL de caséine stérile de 1 % dans du PBS à un tube conique stérile de 15 mL et conserver à 4 ° C. Pour récolter des poumons pour l’histologie, ajouter 2 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF) et stocker à température ambiante.
      3. Rate : ajouter 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS dans un tube conique de 15 mL. Conserver à 4 ° C.
      4. Sang : étiquette deux séries de tubes de microcentrifuge de stériles de 1,5 mL, un pour le sang total et un pour le sérum.
   5. Éthanol à 70 % frais devrait être prêts à remplir les béchers et vaporisateurs pour la dissection.
2. Tous les matériaux pour le vivarium sur un chariot de transport sur le jour de la récolte. Nettoyer des BSC et mettre en place la machine d’anesthésie tout comme aux étapes 1.3 et 1.4.
3. Placez les souris pour être disséqués dans la salle d’induction et, avec l’oxygène circulant, allumez l’isoflurane à 5 % et attendre jusqu’à ce que les animaux est inconscients. Retirer les souris un à la fois et doivent disloquer l’animal comme une méthode secondaire pour s’assurer de la mort. Suite à la dislocation cervicale, l’euthanasie doit être confirmé par l’absence d’une fréquence respiratoire et/ou absence du réflexe de retrait (test du pincement orteil).
4. Positionnez la souris, la face ventrale vers le haut, sur le plateau de dissection et Épinglez les bras et les jambes ouvertes. Vaporiser sur le corps de la souris avec l’éthanol à 70 %.
5. À l’aide de pinces, entourez la peau inférieure de l’abdomen, dans le centre du bassin. À l’aide de ciseaux pointus, faites une coupe verticale jusqu’à la mâchoire inférieure. Puis, disséquer la peau de la paroi péritonéale en poussant les deux couches dehors, à l’aide de petits mouvements avec les ciseaux fermés. Placez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ libre pour la récolte d’organes stériles.
6. Saisir le péritoine intact sous la cage thoracique à ou autour de la foie et coupez-le ouvert vers la cage thoracique. Exposer le tractus digestif inférieur et déplacer le côlon gauche révélant la rate. Pince courbée, Empoignez la rate et disséquer loin du tissu conjonctif avec des ciseaux. Place la rate dans un tube conique 15 mL contenant 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS et placer celui-ci sur la glace.
7. Forceps permet de stabiliser la cage thoracique au processus xiphoïde et fend le diaphragme. Poumons doivent dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale. Ciel ouvert la cage thoracique sur les côtés pour enlever la plaque du sein.
8. Isoler et enlever le lobe supérieur du poumon droit¹⁴, coupant les veines et les artères pulmonaires. Placer le lobe dans un tube conique 15 mL contenant 10 % NBF et place le tube à ta pendant au moins 24 heures pour fixer le tissu. Isoler les restants lobes du poumon droit et le poumon gauche. Placer les lobes dans un tube conique 15 mL contenant 2 mL de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
9. Après avoir coupé les veines pulmonaires et des artères de disséquer des poumons, de permettre la cavité thoracique remplir de sang comme la souris exsanguinates. En utilisant un pipetman 1 mL avec embout, recueillir le sang et transférez-le vers le tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL. Placer le tube sur la glace.
10. Puis, de la nuque, enlever les tissus mous (glandes parotides, sublinguales et sous-maxillaires et ganglions lymphatiques) qui couvre la trachée. Ouvrir et retirer les membranes protectrices entourant la trachée. Délicatement, à l’aide de ciseaux et pinces fines, séparer la trachée de le œsophage et tout autre tissu conjonctif du haut des clavicules en bas de la mandibule.
11. À l’aide de pinces, accrochez-vous à la trachée et couper la trachée au dessus de la clavicule. Déroulez la trachée pour maximiser l’élasticité et de couper la trachée au bas de la mandibule droite au-dessus du larynx, isoler autant que possible (~ 1 cm). Placer l’orgue dans un tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL 0,3 ml de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
12. Détacher la souris et le poser sur le ventre, avec la souris vers le chercheur pour un accès clair à la truffe. La tete de la souris avec l’éthanol à 70 % et, à l’aide des mains, saisir la souris directement derrière le crâne.
13. À l’aide de ciseaux, coupez la chair molle du museau, à partir du bas du nez et de déplacement vers le haut. En outre, enlever la fourrure, la peau et les moustaches autour du nez. Puis, avec pinces et ciseaux courbes, insérez le bout des ciseaux nares avec les courbes pointé vers l’extérieur et ouvert le passage nasal vers les yeux, créant une V-comme la formation.
14. À l’aide de pinces fines, recueillir la cloison nasale et des tissus mous au sein de la formation créée. Placer le tissu dans un tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL 0,3 ml de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
15. Jeter la carcasse dans un sac de biohazard. Avant de disséquer le prochain animal, rincer les outils avec de l’eau désionisée et puis placer dans un bécher rempli d’éthanol à 70 %. Supprimez les outils, secouez l’excès éthanol et ensuite procéder à la prochaine dissection
16. Disséquer chaque souris en suivant les étapes 4.3-4.14.
17. Traiter les tissus comme décrit ci-dessous.

5. le traitement de la rate

1. Pour dissocier les rates, placer une passoire de cellule de 70 µm dans un plat de vitroplants de 60 mm. Versez la rate et les médias qui l’accompagne dans le filtre, avec le piston d’une seringue de 3 mL. Soigneusement écraser l’orgue jusqu’à ce qu’il est complètement dissocié et filtré à l’aide de tamis cellulaire.
2. Rincer le filtre avec 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS dans le récipient de culture de tissus. Recueillir la suspension cellulaire et le placer dans son tube de 15 mL original. Centrifuger les tubes à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules.
3. Aspirer ou éliminer le surnageant et lyser les globules rouges par resuspendant le culot dans 2 mL de tampon de potassium (ACK) de chlorure d’ammonium (chlorure d’ammonium 150 mM, 10 mM bicarbonate de potassium, EDTA sodique de 0,1 mM). Incuber pendant 3 min à RT (25 ° C).
4. Remplir les tubes jusqu’à 8 mL avec RPMI + 5 % tubes FBS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4° C. Aspirer ou décanter le liquide surnageant. Resuspendre les granules cellulaires dans 5 mL de RPMI + 5 % FBS et comte les splénocytes à l’aide d’un microscope et un hémocytomètre.
5. Calculer le volume de cellules nécessaires pour stimuler de 2,5 x 10⁶ cellules / puits. Dans une plaque de 48 puits, graines les cellules dans 0,5 mL de médias de lymphocytes (RPMI 1640 + 10 % FBS, 10 gentamicine µg/mL et 50 µM β-mercaptoéthanol) / puits.
6. Basé sur le calcul ci-dessus, placez le volume requis de la suspension cellulaire dans un nouveau tube et pellet-cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C.
7. Resuspendre le culot dans le volume requis de médias de lymphocytes T. Pour un modèle d’infection par b. pertussis , tester la réponse cytokine antigène-spécifiques d’antigènes vaccinaux : pertactine (Prn) et adhérence de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA). Par conséquent, 3 traitements sont nécessaires : 1) aucune stimulation (NS, comme contrôle négatif), 2) Prn et FHA 3). Pour le dosage, 7,5 x 10⁶ cellules dans 1,5 mL de médias de lymphocytes est requis (2. 5 x 10⁶ cellules / 0,5 mL).
8. Aliquote 0,5 mL de la suspension cellulaire dans une plaque de 48 puits.
9. Pour stimuler les cellules, mélanger les antigènes à 2 fois la concentration désirée dans les médias de lymphocytes T. La concentration finale de Prn et FHA = 1 µg/mL et 0,5 µg/mL, respectivement. Par conséquent, mélanger 2 µg/mL Prn ou 1 µg/mL FHA dans 0,5 mL. Puis, aliquote 0,5 mL de milieu stimulation dans chacun désigné bien, diluer le traitement de l’antigène à 1 x dans un volume final de 1 mL dans chaque puits.
10. Incuber les plaques à 37 ° C à 5 % de CO₂. Recueillir les surnageants sur jour 7 et aliquote 0,5 mL de surnageants dans des tubes de microcentrifuge préalablement étiquetées. Stocker les échantillons dans un-20 ° C jusqu’au moment de tester des cytokines spécifiques de l’antigène par ELISA (Figure 6).

6. traitement des poumons

1. Transférer les poumons (dans 2 mL de 1 % de caséine dans du PBS) dans un homogénéisateur de dounce stérile, 15 mL. Utiliser un pilon à homogénéiser les tissus. Dissocier suivant jusqu’à ce qu’aucune grosses particules de tissus. Replacez la suspension homogénéisée dans le tube de 15 mL original.
2. Supprimer un 0,3 mL aliquote pour placage UFC et centrifuger l’homogénat à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. À frais virés et l’aliquote le surnageant en aliquots de 0,5 mL dans microcentrifugeuse préalablement étiquetée de tubes. Stocker les échantillons dans un-20 ° C jusqu’à l’analyse des cytokines par ELISA.
3. Préparer des dilutions choisies par dilution en série de 0,1 mL de la suspension de poumon homogénéisé dans les tubes de dilution (0,9 mL de PBS stérile). Plaque de 0,1 mL de dilutions choisies empiriquement sur préalablement étiquetées BG 10 % + plaques Sm et propagation utilisant épandeur triangle stérile.
4. Incuber les plaques à 37 ° C dans l’air ambiant pendant 4 jours.
5. Compter et calculer CFU/poumon (Figure 6). Brièvement, multipliez récupéré nombre d’UFC par le facteur de dilution de la plaque, puis aussi par le volume total dans lequel l’organe a été traité. Les calculs de l’UFC sont ensuite transformées en Log₁₀ valeurs pour chaque animal et représentées graphiquement.
   1. Plaques avec 30-300 colonies comptent facilement et avec précision. Plaques avec moins de 6 colonies ne doivent pas être utilisés pour les calculs car si nombre de colonie faible introduire erreur¹⁵. Pour obtenir une limite inférieure de détection, le volume total dans lequel un organe a été homogénéisé est divisé par le volume utilisé à repérer sur une plaque à partir de l’homogénat dilué (e.g., volume total de 2 mL divisé par 0,1 mL d’homogénat dilué est égale à la limite inférieure de 20 UFC détectable).

7. le traitement de la cloison nasale et la trachée

1. Homogénéiser les tissus dans le 0,3 mL de 1 % PBS/caséine avec une boulette de pilon homogénéisateurs moteurs sans fil. Homogénéiser les tissus pour 0,5 à 1 min jusqu’à ce que le tissu est en grande partie dissocié. Bactéries doivent être faites dans la suspension.
2. Préparer 10 choisie x dilutions par dilution en série de 0,1 mL de la suspension homogénéisée dans des tubes de dilutions contenant 0,9 mL de PBS stérile. Dot 0,1 mL de chaque dilution sur étiquetés avant 10 % BG + Sm plaques et répandre la suspension à l’aide d’un épandeur de triangle qui a été stérilisé par un lavage de l’éthanol à 70 % et les flammes.
3. Incuber les plaques à 37 ° C dans l’air ambiant pendant 4 jours.
4. Compter et calculer CFU/orgue comme à l’étape 6.5 (Figure 6). Pour obtenir une limite inférieure de détection, le volume total dans lequel un organe a été homogénéisé est divisé par le volume utilisé au point sur une plaque de l’homogénat dilué (e.g., volume total 0,3 mL divisé par 0,1 mL de pur est égal à la limite inférieure de 3 UFC detecta ble).

8. traitement du sang

1. Centrifuger les tubes contenant le sang isolé à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C pour granuler des globules rouges.
2. Décoller délicatement le surnageant de sérum et de la pipette dans un tube de microcentrifuge de sérum préalablement marqué. Stocker les tubes à-20 ° C jusqu’au moment pour une analyse ultérieure en aval (i.e., ELISA Ig totales et spécifiques).

Representative Results

Discussion

Le protocole complet décrit ici afin d’étudier l’immunité induite par le vaccin à l’infection par b. pertussis permettra également l’évaluation des réponses de l’hôte à une variété d’autres pathogènes. Le protocole traite de méthodes pour livrer des immunisations, déterminer qui suit l’efficacité vaccin pathogène défi et dissection parallèle de la fonction immunitaire. Dans l’adaptation du protocole afin d’étudier d’autres agents pathogènes, plusieurs paramètres devront être modifiés. Ceux-ci incluent, mais ne se limitent pas à, le mode d’anesthésie animaux, composition du vaccin, dose et voie d’administration. En outre, la dose et la voie d’administration du pathogène contestée d’intérêt, les tissus sélectionnés pour la récolte et l’évaluation en aval des réponses immunitaires sont des facteurs qui peuvent être modifiés pour la pathogène/maladie d’intérêt.

Le modèle de souris de l’infection à b. pertussis est largement utilisé et est un excellent modèle pour la pathogénie et vaccinologie études^{16,17,18,19,20}. Les modèles murins présentent de nombreuses similitudes avec l’infection humaine, y compris : i) bactéries se limitent aux voies respiratoires et se multiplient rapidement, ii) jeunes animaux d’affichage relativement fortes infestations, iii) bonne correspondance entre les vaccins qui protègent enfants contre la coqueluche et celle de protéger les souris contre l’infection et iv) b. pertussis-anticorps et lymphocytes T spécifiques véhiculent l’immunité protectrice naturelle et induite par le vaccin^{21,22, 23 , 24}. par conséquent, le modèle murin permet l’étude des effets de la vaccination sur la clairance bactérienne²⁵. Un autre avantage de l’utilisation de souris aux infections de b. pertussis modèle est la disponibilité de knockout génétiquement modifié et des animaux transgéniques pour étudier les acteurs critiques induite par le vaccin des réponses immunitaires^19,26.

La plupart des vaccins est administrée par voie parentérale, notamment via la voie intramusculaire (i.m.). Cet itinéraire est préférable car elle suscite l’immunité systémique avec un minimum de réactogénicité locale^27,28,29. Alternatives aux injections intramusculaires incluent sous-cutanée (s.c.) ou intrapéritonéale (i.p.) livraison, qui induisent également des réponses systémiques. Voies sous-cutanée sont également attrayants, car il y a une grande population de résident antigène présentant des cellules (APC) dans le derme avec accès vasculaire et lymphatique systèmes³⁰. Cependant, intradermique n’a pas été exploré pour le vaccin de la coqueluche. Livraison intrapéritonéale de VP expérimental génère l’immunité semblable à la vaccination intramusculaire³¹ et est un itinéraire injection fiable pour les études murines, quoique peu pratique pour une utilisation clinique.

Ce protocole utilise la voie i.m. immunisation, qui offre une protection dans les poumons, mais pas le nasopharynx³². Des études récentes ont montré qu’un vaccin intranasal (i.n.) favorise une réponse immunitaire locale, muqueuse qui protège la partie supérieure et inférieure des voies respiratoires, en particulier le nez, qui sert comme un réservoir de bactéries qui peuvent être transmises par la suite à d’autres hôtes³³. En outre, la vaccination i.n. se révèle pour générer la mémoire résidente de tissu qui n’est pas généré par vaccination systémique^33,,³⁴. Donc, le choix de l’itinéraire de l’administration de vaccin dépend grandement du type de vaccin et nécessaires pour protéger contre les maladies du système immunitaire.

La voie intranasale de livraison bactérienne décrite dans le présent protocole est une méthode largement utilisée pour les pathogènes respiratoires assurant régulièrement et en toute sécurité un inoculum bactérien directement dans les voies respiratoires des souris anesthésiés. Notre protocole utilise une dose de volume élevé (40 à 50 µL) qui est inhalée dans le nasopharynx et les voyages dans les voies respiratoires inférieures. Un inoculum de faible volume (10-20 µL) pourrait coloniser le nasopharynx, mais la colonisation des poumons seront minimes³⁵. Cependant, l’inhalation de b. pertussis-contenant des gouttelettes de l’air est considéré comme le mode naturel d’infection de personnes et de transmission. Cette voie d’administration a été utilisée dans différents modèles animaux^36,37. Pour atteindre des niveaux comparables de l’infection pour diriger l’inoculation i.n., des concentrations beaucoup plus élevées de l’inoculum bactérien (⁹-10 10¹¹ CFU/mL) et délai de livraison sont requis³⁸.

Pour établir la colonisation des voies respiratoires de souris, ce protocole utilise des bactéries fraîches, cultivées dans un milieu liquide pour que les bactéries utilisées pour l’inoculation sont dans la phase virulente et sont répliqués dans le stade de journal. Expérimentateurs permet également un inoculum provenant des stocks préalable titrés, congelés. Cela permet une connaissance de l’UFC, administré à la souris. Cependant, les bactéries présentes dans ces inocule peut-être dans la phase non virulentes, qui peut réduire l’efficacité des voies respiratoires colonisation³⁹. Après l’infection, l’inoculum est plaqué afin de déterminer les bactéries UFC livrés à la souris. Les enquêteurs peuvent aussi choisir de l’inoculum avant l’infection in vivo pour assurer la viabilité de la bactérie et de confirmer la dose de l’inoculum de la plaque.

Après l’infection, CFU bactériennes est énumérés par l’homogénéisation des tissus isolés de souris sacrifiées à un validant prédéterminé. Un inconvénient de cette méthode est son incapacité à suivre cinétiquement pathogène UFC pour un ensemble spécifié de la souris. Chercheurs doivent utiliser plusieurs groupes d’animaux sacrifiés à des intervalles différents pour examiner la restriction bactérienne induite par le vaccin. Le nombre de souris dans chaque expérience variera selon le nombre de points à examiner et la taille de l’effet désiré. Cela peut introduire une variation biologique accrue. Intégration d’un gène rapporteur bioluminescent ou fluorescents dans le pathogène d’intérêt permettra une surveillance non invasive de la croissance et la diffusion in vivo au cours de l’infection,³⁵. Cette méthode réduit la variation biologique et minimise le nombre requis d’animaux de laboratoire, puisque des données longitudinales sont prélevées sur le même groupe d’animaux.

Le protocole de dissociation et homogénéisation tissu utilisé ici pour les tissus des voies respiratoires est également applicable pour le dénombrement de colonies d’autres tissus solides tels que le foie, rein, intestin ou la vessie pour interroger les sites d’infection et diffusion de pathogènes d’intérêt.

Ainsi que l’énumération de l’UFC, ce protocole permet la caractérisation de la réponse immunitaire induite par la vaccination et une infection naturelle. Plus précisément, la quantification des cytokines produit systémique et localement permettent la détermination des profils système immunitaires efficaces, résultant de la vaccination. Cytokines sont des immunomodulateurs qui promouvoir l’afflux cellulaire pour les tissus affectés et l’activation de l’immunité cellulaire, mais aussi de fournir une aide pour la génération de réponses humorales^10,40,41. Les cytokines produites dans divers compartiments de tissus, tels que les poumons et la rate, utilisant ce protocole, sont détectés. Bien que non illustrée ici, le protocole de stimulation est également applicable pour l’évaluation des réponses dans les ganglions lymphatiques de drainage.

Analyse ELISA permet la détection et la quantification des cytokines dans les surnageants de médias ou de suspensions mixtes (i.e., homogénats ou sérum), ce qui donne des informations au niveau des populations et la caractérisation des cytokines spécifiques de l’antigène d’un culture de cellules mixtes à points désignés. En revanche, les méthodes comme ELISPOT ou cytométrie permettre une évaluation du nombre de cellules qui produisent un analyte et le niveau d’expression par la cellule^42,43. Bien que non décrit ici, ces méthodes sont également applicables à la détection des cellules B antigène-spécifiques. La combinaison de l’énumération de l’UFC et tests immunologiques de dresser un tableau complet de la réponse à la vaccination.

Autres analyses qui peuvent être effectuées à l’aide de ce protocole d’infection incluent épigénétiques ou analyse transcriptomique lorsque l’ADN et l’ARN est obtenu à partir de tissus d’intérêt⁴⁴. Ainsi, en tenant compte de la composition du vaccin approprié, vaccination et itinéraire de livraison pathogène, ce protocole est polyvalent dans sa mise en oeuvre et facilement adapté pour différents modèles d’infection. Ces techniques sont également applicables aux maladies non infectieuses (c.-à-d., cancer, sclérose en plaques, l’asthme, maladies auto-immunes) où les vaccins sont utilisés comme une modalité thérapeutique.

Materials

2L induction chamber	Vet Equip	941444
Fluriso	Vet One	V1 501017	any brand is appropriate
Bordet Gengou Agar Base	BD bioscience	248200
Casein	Sigma	C-7078
Casamino acids	VWR	J851-500G	Strainer Scholte (SS) media components
L-Glutamic acid	Research Products Int	G36020-500
L-Proline	Research Products Int	P50200-500
Sodium Chloride	Fisher	BP358-10
Potassium Phosphate monobasic	Fisher	BP362-1
Potassium Chloride	Fisher	P217-500
Magnesium Chloride hexahydrate	Fisher	M2670-500G
Calcium Chloride	Fisher	C75-500
Tris base	Fisher	BP153-1
L-cysteine HCl	Fisher	BP376-100	SS media suplements
Ferrous Sulfate heptahydrate	Sigma	F-7002
Niacin	Research Products Int	N20080-100
Glutathione	Research Products Int	G22010-25
Ascorbic acid	Research Products Int	A50040-500
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093
FBS	Sigma	F2442-500mL	 any US source, non-heat inactivated
gentamicin	ThermoFisher Scientific	15710064
B-mercaptoethanol	Fisher 	BP176-100
15mL dounce tissue grinder	Wheaton	357544	any similar brand is appropriate
Cordless Hand Homogenizer	Kontes/Sigma 	Z359971-1EA	any similar brand is appropriate
Instruments – scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders			any brand is appropriate
3mL syringes	BD bioscience	309657
15mL conical tubes	Fisher 	339651
1.5mL microfuge tubes	Denville	C2170
70um cell strainers	Fisher 	22363548
60mm plates	ThermoFisher Scientific	130181
48-well tissue culture plates	ThermoFisher Scientific	08-772-1C
1mL insulin syringe 28G1/2	Fisher Scientific/Excel Int.	14-841-31
Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-173-21
Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-173-77
Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit	Invitrogen / eBioscience	50-172-09