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Article de méthode

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

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DOI :

10.3791/58930

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22 février 2019

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1Department of Microbial Infection & Immunity, The Ohio State University, 2Department of Microbiology, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole élégant pour in vivo l’évaluation du vaccin hôte et l’efficacité des réponses immunitaires. Ce protocole peut être adapté pour des modèles de vaccin qui étudient les virus, bactéries ou parasites pathogènes.

Résumé

Les vaccins sont une merveille médical de 20ème siècle. Ils ont fortement réduit la morbidité et la mortalité causées par les maladies infectieuses et a contribué à une augmentation frappante de l’espérance de vie dans le monde entier. Déterminer l’efficacité du vaccin reste néanmoins un défi. Des preuves nouvelles suggèrent que le vaccin acellulaire (aPV) pour Bordetella pertussis (b. pertussis) induit l’immunité sous-optimale. Par conséquent, un défi majeur est de concevoir un vaccin de nouvelle génération qui induit une immunité protectrice sans les effets secondaires d’un vaccin à germes entiers (PVS). Nous décrivons ici un protocole que nous avons utilisé pour tester l’efficacité d’un adjuvant prometteur, roman qui biaise la réponse immunitaire à un phénotype Th1/Th17 protectrice et favorise un meilleur dégagement d’un défi de b. pertussis dans le tractus respiratoire murin. Cet article décrit le protocole de vaccination de souris, l’inoculation bactérienne, tissu récolte et analyse des réponses immunitaires. En utilisant cette méthode, au sein de notre modèle, nous avons avec succès élucidé les mécanismes cruciaux induites par un vaccin acellulaire contre la coqueluche prometteuse génération. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel modèle de maladies infectieuses afin de déterminer l’efficacité du vaccin.

Introduction

Les vaccins représentent l’une des plus grandes réalisations du XXe siècle la santé publique, mais nous ne comprenons toujours pas entièrement les mécanismes par lesquels vaccins efficaces stimulent l’immunité protectrice. L’identification des signatures moléculaires (e.g., marqueurs d’activation cellulaire, expansion des sous-types cellulaires et des caractéristiques de l’expression génique) induite après vaccination fournit une multitude d’informations pour prévoir et générant un efficace réponse immunitaire. La complexité des réponses de l’hôte-pathogène ne peut être reproduite adéquatement à l’aide du systèmes in vitro cell culture1. Les modèles in vivo vaccin visent à évaluer simultanément plusieurs types de cellules immunitaires chez l’hôte. Cela procure un avantage lorsque caractérisant le vaccin antigène traitement et présentation, la sécrétion de cytokines différentielle et expansion des cellules immunitaires. Le protocole décrit ici fournit une méthode détaillée pour déterminer l’efficacité du vaccin par l’évaluation de la réponse immunitaire systémique et locale et quantification de la charge pathogène dans les tissus d’intérêt. L’exemple fourni ici teste l’efficacité d’un vaccin expérimental pour l’agent pathogène Bordetella pertussis (b. pertussis).

B. pertussis est une bactérie Gram-négative qui est l’agent étiologique de la maladie respiratoire coqueluche (pertussis)2,3. Contact étroit avec des personnes infectées (symptomatiques ou asymptomatiques) conduit à la transmission, la colonisation et la maladie. Malgré le vaccin global significatif couverture4, la coqueluche est considéré comme une résurgence de la maladie dans de nombreux pays dans le monde entier et est des principales causes évitables chez les enfants morts5,6,7, 8. en 2015, b. pertussis et la coqueluche ont été inclus dans l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID) émergents liste pathogène/maladies infectieuses, en insistant sur la nécessité pour le développement d’un meilleur vaccin qui confère immunité protectrice longue durée de vie.

Une région active d’enquête pour contrôler la recrudescence de la coqueluche est actuellement, développement d’un vaccin acellulaire contre la coqueluche de prochaine génération (aPV) avec une combinaison optimale de nouveaux adjuvants et antigènes pour imiter la réponse immunitaire provoquée par la cellule entière coqueluche vaccin (PVS)9. En utilisant le protocole décrit, nous avons récemment rapporté que la modification des aPV cours approuvé par la FDA par l’ajout d’un nouvel adjuvant, facteur de colonisation Bordetella A (BcfA), donné lieu à une réduction plus efficace de la charge bactérienne de b. pertussis de poumons de souris10,11. Cette protection accrue a été accompagnée par l’inclinaison d’une réponse immunitaire Th1/Th2 induite par l’alun au plus protecteur du profil immunitaire Th1/Th1710. Ce protocole est détaillé et complet, permettant à l’enquêteur se renseigner maximale durant l’évaluation simultanée de l’hôte et de la réponse immunitaire à une variété de pathogènes.

Le protocole décrit ici suit le calendrier de vaccination représentatif, illustré à la Figure 1, pour assurer des réponses immunitaires hôte optimale.

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Protocole

Toutes les expériences avec des animaux vivants ont été effectuées selon un protocole approuvé par The Ohio State University IACUC conformément aux lignes directrices IACUC. Les souris C57BL/6 ont été utilisés dans toutes les vaccinations et les infections. Les souris mâles et femelles sont utilisées dans chaque groupe selon les lignes directrices des NIH. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par des calculs de puissance basés sur les différences prédites de résultat parmi les groupes expérimentaux. Par exemple, 8 souris par groupe donnera 80 % de la puissance à α = 0,05 (2 côtés) pour un 2-sample t- test pour détecter les différences dans le résultat visé de 1,33 écarts-types (SDs).

1. l’immunisation de souris

  1. Préparer un mélange maître vaccin dans un tampon physiologique stérile comme une solution saline ou DPS.
    Remarque : Le volume total du mélange devrait inclure 10 % plus que requis pour la vaccination de l’ensemble du groupe. Les concentrations de la composition du vaccin sont détaillées ci-dessous aux étapes 1.1.1 et 1.1.2. Transporter les éléments pour le vivarium sur la glace.
    1. Pour les études de b. pertussis , comprennent les groupes suivants de vaccin : aPV et aPV + BcfA. En outre, utiliser alun, antigènes vaccinaux seuls (FHA et Prn) et souris (non immunisés) naïves comme groupe témoin.
      NOTE : aPV est 1/5ème à la dose humaine d’une aPV approuvé par la FDA, qui se compose de l’anatoxine tétanique, anatoxine diphtérique réduite, anatoxine coquelucheuse (AC), hémagglutinine filamenteuse (FHA) et la pertactine (Prn) adsorbée sur sels d’aluminium. Une seule dose humaine de VP de la coqueluche actuelle est de 0,5 mL, 1/5ème d’une dose est donc 0,1 mL. Volumes d’aPV + BcfA sont de 0,1 mL de la VP (1/5ème la dose humaine) + 0,046 mL de BcfA (30 µg) par souris. Le volume maximum qui peut être livré en toute sécurité à un muscle est de 0,1 mL. Parce que l’aPV + BcfA vaccin volume est supérieure à 0,1 mL, le vaccin doit être livré dans les deux épaules, répartis à peu près également, afin d’être administré de façon sécuritaire.
    2. Pour préparer un vaccin expérimental, pour une dose mélanger 1 µg de FHA et 0,5 µg de Prn avec 50 µg de gel d’hydroxyde d’aluminium dans du PBS stérile. Permettre l’aPV expérimentale de mélanger sur un rouleau de laboratoire pendant 15 min à température ambiante (RT). Ensuite, faites tourner le tube à 18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant et remettre en suspension le contenu dans 1 mL de PBS stérile.
  2. Dans le vivarium, mis en place la machine d’anesthésie (Figure 2).
    Remarque : Assurez-vous qu’un niveau adéquat d’oxygène et isoflurane dans leurs réservoirs respectifs avant l’utilisation. Peser la cuve de charognard isoflurane et le remplacer si son poids augmente de 50 g.
  3. Nettoyez l’enceinte de sécurité biologique (BSC) et placer la chambre induction propre à l’intérieur de la BSC. Bancher l’anesthésie et charognard de la machine d’anesthésie à la chambre de l’induction. Ouvrir l’oxygène réservoir via le régulateur afin d’assurer l’oxygène circule et définir le niveau de 1,5 à 2 L/min.
  4. Placez les souris d’âge désiré (6 à 12 semaines) dans la chambre de l’induction. Allumez l’isoflurane à 2,5 à 3 % pour anesthésier légèrement les souris. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils ne se déplacent pas dans la chambre et sa respiration s’est ralentie.
  5. Vérifier le niveau d’induction par orteil-pincement, observe depuis n’importe quel mouvement réflexif. S’il n’y a aucune, les souris sont prêts à injecter.
    Remarque : Dans cette expérience, la cage entière d’animaux ont été anesthésiés à la fois. On peut choisir à anesthésier les animaux individuellement pour injection ou à injecter les animaux sans anesthésie. Aucune de ces méthodes est approprié.
  6. Pendant ce temps, préparer 1 mL seringues à insuline (28 1/2) avec 0,1 mL de vaccin chaque. Lorsque les animaux est pleinement induites, retirer un animal de la chambre et poser la souris sur le ventre sur une serviette ou un banc de garniture.
  7. Administrer le vaccin par voie intramusculaire. Avec la seringue à un angle de 45° et l’angle de biseau vers le haut, insérez la seringue ~ 5 mm dans le deltoïde de la souris et injecter le vaccin.
    Remarque : La biche trimestre/flanc peut être utilisé comme un site d’injection au lieu du deltoïde.
  8. Après l’injection, garder l’aiguille insérée dans le muscle pour environ 5-10 s. Une fois que le volume est livré, tourner la seringue à 180° pour que le biseau fait face loin pour créer un joint et empêcher la fuite du vaccin. Ensuite, tirer lentement l’aiguille sur le site d’injection.
  9. Retourner la souris à la cage. Répétez la procédure avec tous les animaux dans le groupe désigné.
  10. Désactiver l’isoflurane et rincer la chambre induction avec de l’oxygène avant d’anesthésier la cage suivante de souris.
  11. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils sont tous alerte et émouvant dans la cage. Retourner la cage à l’emplacement du logement.
  12. Animaux de surveiller toutes les 12 h après vaccination, vers le haut à 48 h, pour des symptômes cliniques de morbidité comme couche rude/hirsutes, slow gait ou travaillé respiration. Si les symptômes persistent, conférer avec le vétérinaire institutionnel et retirer les souris de l’étude si nécessaire.
  13. Quatre semaines après la vaccination initiale, poussée souris par anesthésier et l’administration intramusculaire dans le deltoïde droit de la souris avec la même formule de vaccin qui a été donnée précédemment.
  14. Encore une fois, surveiller les animaux pour aucun symptôme clinique. Animaux de la maison pendant 2 semaines supplémentaires et continuer avec l’infection.

2. croissance des souches de b. pertussis et préparation de l’Inoculum Infection

  1. De stocks congelés [cryoconservés à-80 ° C à 15 % de glycérol, gelé de croissance planctonique dans Stainer-Scholte (SS) media12], strie à b. pertussis sur13 géloses de Bordet-Gengou (BG) additionné de mouton défibriné de 10 % sang et 100 µg/mL de streptomycine (10 % BG + Sm) pour la sélection. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 4 jours.
  2. Prélever environ 8-10 colonies individuelles des ou des souche s de la plaque et l’inoculer 3 mL de médias SS additionné de 22,8 mM L-cystéine, sulfate ferreux 3,6 mM, niacine 3,3 mM, 48,8 mM glutathion, acide ascorbique 227 mM, heptakis 1 mg/mL et 100 µg/mL de streptomycine. Cultiver la culture à 37 ° C dans un fût de rouleau à 60 tr/min pendant 16 à 24 heures.
  3. Le lendemain, diluer la culture primaire 1:600, 1 : 120, 1 : 300, 1/60, 01:30 et 01:15 dans 3 mL de supplémenté SS media. Incuber la culture à 37 ° C dans le fût de rouleau à 60 tr/min pendant 16 à 24 heures.
  4. Effectuer des mesures de densité optique à 600 nm (OD600) pour les cultures bactériennes. À l’aide des cuvettes de spectrophotomètre, diluer les cultures 01:10 en ajoutant 0,1 mL de la culture liquide à 0,9 mL de PBS stérile.
  5. Sélectionnez une culture avec OD600≈ 0,8 et 1,2. Calculer le volume nécessaire pour obtenir 1 OD (Figure 3). Tournez en bas le volume dans un tube de microtubes de 1,5 mL à 6000 x g pendant 5 min à 25 ° C. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot cellulaire bactérienne dans 1 mL de PBS stérile pour obtenir une densité de 1 OD/mL [1-3 x 109 colonies formant des unités (UFC) par millilitre].
  6. Pour préparer un inoculum de ~ 5 x 105 à 1,5 x 106 UFC/souris dans 40-50 µL, vortex et en série, diluer la solution bactérienne (de l’étape 2.5) 100 fois dans 1 mL de PBS stérile pour atteindre environ 1-3 x 107 UFC/mL (Figure 4A). Le transport de l’inoculum pour le vivarium sur la glace.

3. modèle d’Infection intranasale murin

  1. Dans le vivarium, définir des conditions d’oxygène et anesthésie comme décrit aux points 1.3 et 1.4. Comme indiqué au point 1.5, placez les souris dans la chambre à anesthésier. Surveiller les animaux jusqu'à ce que l’anesthésie prend effet.
  2. Lorsque les souris sont anesthésiés, retirer un animal à la fois de la chambre de l’induction. Soulevez la souris par la peau du thorax dorsal, derrière les omoplates et le cou. Positionner le poteau de la souris pour accéder au nez.
  3. À l’aide d’une pointe de pipette 200 µL, appliquer lentement de 40-50 µL de l’inoculum bactérien pour les narines de la souris (20-25 µL dans chaque nare). Maintenez la souris jusqu'à ce que l’inoculum entière a été inhalée par l’animal. Si certains des bulles inoculum dehors, collecter les bulles et re-inculquer dans les narines. Livrer une quantité égale de PBS stérile à un groupe de souris comme contrôle négatif.
  4. Que fait en étapes 1.10-1.12, retourner les animaux inoculés à leur cage et surveiller les animaux jusqu'à ce qu’ils soient alerte et émouvant. Ramenez la cage sur son espace de logement original sur la grille. Rincer la chambre induction avec l’oxygène pour enlever l’isoflurane résiduelle avant d’anesthésier la prochaine série d’animaux. Surveiller les animaux pour l’infection après 48 h.
  5. En laboratoire, plaque de dilutions en série de l’inoculum, dans du PBS stérile, afin de vérifier l’UFC réelles envoyées aux souris. Plaque de 0,1 mL de la dilution 10 % BG + plaques Sm (Figure 4A). Placer les plaques dans un incubateur à 37 ° C et se développer pendant 4 jours. Compter et calculer l’UFC de l’inoculum livrés à la souris (Figure 4B).

4. la récolte de tissus d’origine animale après Infection

  1. Se préparer pour la dissection de la souris et la récolte de tissus.
    1. Stériliser tous les outils (grossiers et fins ciseaux, ciseaux courbes, pince fine, pellet pilons et épandeurs triangle) nécessaires pour le traitement des tissus dans un autoclave. Sceller les outils en sachets de stérilisation. Envelopper les verre dounce homogénéisateurs en papillote et ajouter ruban autoclave pour indiquer la stérilité.
    2. Préparer les jours plaques 1ou 2 agar avant la récolte de tissus pour s’assurer que les plaques sont solidifié avant de l’utiliser. Pour b. pertussis, utilisez 10 % BG + plaques SM. Label pour la cloison nasale, trachée et poumons pour chacune des souris avec des dilutions désirées, déterminée empiriquement pour chaque expérience.
    3. Tubes de dilution UFC remplissage et étiquette. Ajouter 0,9 mL de PBS stérile aux tubes de microcentrifuge stérile de 1,5 mL base le nombre sur des organes à des processus et des dilutions par organe.
    4. Tubes de remplissage ou étiquette pour prélèvement tissulaire :
      1. Cloison nasale et la trachée : remplir un tube de microtubes stériles de 1,5 mL avec 0,3 mL de caséine stérile de 1 % dans du PBS (Ca2 + et Mg2 +-libre). Conserver à 4 ° C.
      2. Poumons : ajouter 2 mL de caséine stérile de 1 % dans du PBS à un tube conique stérile de 15 mL et conserver à 4 ° C. Pour récolter des poumons pour l’histologie, ajouter 2 mL de formol tamponné neutre de 10 % (NBF) et stocker à température ambiante.
      3. Rate : ajouter 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS dans un tube conique de 15 mL. Conserver à 4 ° C.
      4. Sang : étiquette deux séries de tubes de microcentrifuge de stériles de 1,5 mL, un pour le sang total et un pour le sérum.
    5. Éthanol à 70 % frais devrait être prêts à remplir les béchers et vaporisateurs pour la dissection.
  2. Tous les matériaux pour le vivarium sur un chariot de transport sur le jour de la récolte. Nettoyer des BSC et mettre en place la machine d’anesthésie tout comme aux étapes 1.3 et 1.4.
  3. Placez les souris pour être disséqués dans la salle d’induction et, avec l’oxygène circulant, allumez l’isoflurane à 5 % et attendre jusqu'à ce que les animaux est inconscients. Retirer les souris un à la fois et doivent disloquer l’animal comme une méthode secondaire pour s’assurer de la mort. Suite à la dislocation cervicale, l’euthanasie doit être confirmé par l’absence d’une fréquence respiratoire et/ou absence du réflexe de retrait (test du pincement orteil).
  4. Positionnez la souris, la face ventrale vers le haut, sur le plateau de dissection et Épinglez les bras et les jambes ouvertes. Vaporiser sur le corps de la souris avec l’éthanol à 70 %.
  5. À l’aide de pinces, entourez la peau inférieure de l’abdomen, dans le centre du bassin. À l’aide de ciseaux pointus, faites une coupe verticale jusqu'à la mâchoire inférieure. Puis, disséquer la peau de la paroi péritonéale en poussant les deux couches dehors, à l’aide de petits mouvements avec les ciseaux fermés. Placez la peau sur les côtés de la carcasse pour créer un champ libre pour la récolte d’organes stériles.
  6. Saisir le péritoine intact sous la cage thoracique à ou autour de la foie et coupez-le ouvert vers la cage thoracique. Exposer le tractus digestif inférieur et déplacer le côlon gauche révélant la rate. Pince courbée, Empoignez la rate et disséquer loin du tissu conjonctif avec des ciseaux. Place la rate dans un tube conique 15 mL contenant 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS et placer celui-ci sur la glace.
  7. Forceps permet de stabiliser la cage thoracique au processus xiphoïde et fend le diaphragme. Poumons doivent dégonfler et tomber vers la colonne vertébrale. Ciel ouvert la cage thoracique sur les côtés pour enlever la plaque du sein.
  8. Isoler et enlever le lobe supérieur du poumon droit14, coupant les veines et les artères pulmonaires. Placer le lobe dans un tube conique 15 mL contenant 10 % NBF et place le tube à ta pendant au moins 24 heures pour fixer le tissu. Isoler les restants lobes du poumon droit et le poumon gauche. Placer les lobes dans un tube conique 15 mL contenant 2 mL de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
  9. Après avoir coupé les veines pulmonaires et des artères de disséquer des poumons, de permettre la cavité thoracique remplir de sang comme la souris exsanguinates. En utilisant un pipetman 1 mL avec embout, recueillir le sang et transférez-le vers le tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL. Placer le tube sur la glace.
  10. Puis, de la nuque, enlever les tissus mous (glandes parotides, sublinguales et sous-maxillaires et ganglions lymphatiques) qui couvre la trachée. Ouvrir et retirer les membranes protectrices entourant la trachée. Délicatement, à l’aide de ciseaux et pinces fines, séparer la trachée de le œsophage et tout autre tissu conjonctif du haut des clavicules en bas de la mandibule.
  11. À l’aide de pinces, accrochez-vous à la trachée et couper la trachée au dessus de la clavicule. Déroulez la trachée pour maximiser l’élasticité et de couper la trachée au bas de la mandibule droite au-dessus du larynx, isoler autant que possible (~ 1 cm). Placer l’orgue dans un tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL 0,3 ml de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
  12. Détacher la souris et le poser sur le ventre, avec la souris vers le chercheur pour un accès clair à la truffe. La tete de la souris avec l’éthanol à 70 % et, à l’aide des mains, saisir la souris directement derrière le crâne.
  13. À l’aide de ciseaux, coupez la chair molle du museau, à partir du bas du nez et de déplacement vers le haut. En outre, enlever la fourrure, la peau et les moustaches autour du nez. Puis, avec pinces et ciseaux courbes, insérez le bout des ciseaux nares avec les courbes pointé vers l’extérieur et ouvert le passage nasal vers les yeux, créant une V-comme la formation.
  14. À l’aide de pinces fines, recueillir la cloison nasale et des tissus mous au sein de la formation créée. Placer le tissu dans un tube de microcentrifuge préalablement étiquetées de 1,5 mL 0,3 ml de 1 % de caséine dans du PBS et placez-le sur la glace.
  15. Jeter la carcasse dans un sac de biohazard. Avant de disséquer le prochain animal, rincer les outils avec de l’eau désionisée et puis placer dans un bécher rempli d’éthanol à 70 %. Supprimez les outils, secouez l’excès éthanol et ensuite procéder à la prochaine dissection
  16. Disséquer chaque souris en suivant les étapes 4.3-4.14.
  17. Traiter les tissus comme décrit ci-dessous.

5. le traitement de la rate

  1. Pour dissocier les rates, placer une passoire de cellule de 70 µm dans un plat de vitroplants de 60 mm. Versez la rate et les médias qui l’accompagne dans le filtre, avec le piston d’une seringue de 3 mL. Soigneusement écraser l’orgue jusqu'à ce qu’il est complètement dissocié et filtré à l’aide de tamis cellulaire.
  2. Rincer le filtre avec 3 mL de milieu RPMI + 5 % FBS dans le récipient de culture de tissus. Recueillir la suspension cellulaire et le placer dans son tube de 15 mL original. Centrifuger les tubes à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules.
  3. Aspirer ou éliminer le surnageant et lyser les globules rouges par resuspendant le culot dans 2 mL de tampon de potassium (ACK) de chlorure d’ammonium (chlorure d’ammonium 150 mM, 10 mM bicarbonate de potassium, EDTA sodique de 0,1 mM). Incuber pendant 3 min à RT (25 ° C).
  4. Remplir les tubes jusqu'à 8 mL avec RPMI + 5 % tubes FBS et centrifuger à 450 x g pendant 5 min à 4° C. Aspirer ou décanter le liquide surnageant. Resuspendre les granules cellulaires dans 5 mL de RPMI + 5 % FBS et comte les splénocytes à l’aide d’un microscope et un hémocytomètre.
  5. Calculer le volume de cellules nécessaires pour stimuler de 2,5 x 106 cellules / puits. Dans une plaque de 48 puits, graines les cellules dans 0,5 mL de médias de lymphocytes (RPMI 1640 + 10 % FBS, 10 gentamicine µg/mL et 50 µM β-mercaptoéthanol) / puits.
  6. Basé sur le calcul ci-dessus, placez le volume requis de la suspension cellulaire dans un nouveau tube et pellet-cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  7. Resuspendre le culot dans le volume requis de médias de lymphocytes T. Pour un modèle d’infection par b. pertussis , tester la réponse cytokine antigène-spécifiques d’antigènes vaccinaux : pertactine (Prn) et adhérence de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA). Par conséquent, 3 traitements sont nécessaires : 1) aucune stimulation (NS, comme contrôle négatif), 2) Prn et FHA 3). Pour le dosage, 7,5 x 106 cellules dans 1,5 mL de médias de lymphocytes est requis (2. 5 x 106 cellules / 0,5 mL).
  8. Aliquote 0,5 mL de la suspension cellulaire dans une plaque de 48 puits.
  9. Pour stimuler les cellules, mélanger les antigènes à 2 fois la concentration désirée dans les médias de lymphocytes T. La concentration finale de Prn et FHA = 1 µg/mL et 0,5 µg/mL, respectivement. Par conséquent, mélanger 2 µg/mL Prn ou 1 µg/mL FHA dans 0,5 mL. Puis, aliquote 0,5 mL de milieu stimulation dans chacun désigné bien, diluer le traitement de l’antigène à 1 x dans un volume final de 1 mL dans chaque puits.
  10. Incuber les plaques à 37 ° C à 5 % de CO2. Recueillir les surnageants sur jour 7 et aliquote 0,5 mL de surnageants dans des tubes de microcentrifuge préalablement étiquetées. Stocker les échantillons dans un-20 ° C jusqu’au moment de tester des cytokines spécifiques de l’antigène par ELISA (Figure 6).

6. traitement des poumons

  1. Transférer les poumons (dans 2 mL de 1 % de caséine dans du PBS) dans un homogénéisateur de dounce stérile, 15 mL. Utiliser un pilon à homogénéiser les tissus. Dissocier suivant jusqu'à ce qu’aucune grosses particules de tissus. Replacez la suspension homogénéisée dans le tube de 15 mL original.
  2. Supprimer un 0,3 mL aliquote pour placage UFC et centrifuger l’homogénat à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. À frais virés et l’aliquote le surnageant en aliquots de 0,5 mL dans microcentrifugeuse préalablement étiquetée de tubes. Stocker les échantillons dans un-20 ° C jusqu'à l’analyse des cytokines par ELISA.
  3. Préparer des dilutions choisies par dilution en série de 0,1 mL de la suspension de poumon homogénéisé dans les tubes de dilution (0,9 mL de PBS stérile). Plaque de 0,1 mL de dilutions choisies empiriquement sur préalablement étiquetées BG 10 % + plaques Sm et propagation utilisant épandeur triangle stérile.
  4. Incuber les plaques à 37 ° C dans l’air ambiant pendant 4 jours.
  5. Compter et calculer CFU/poumon (Figure 6). Brièvement, multipliez récupéré nombre d’UFC par le facteur de dilution de la plaque, puis aussi par le volume total dans lequel l’organe a été traité. Les calculs de l’UFC sont ensuite transformées en Log10 valeurs pour chaque animal et représentées graphiquement.
    1. Plaques avec 30-300 colonies comptent facilement et avec précision. Plaques avec moins de 6 colonies ne doivent pas être utilisés pour les calculs car si nombre de colonie faible introduire erreur15. Pour obtenir une limite inférieure de détection, le volume total dans lequel un organe a été homogénéisé est divisé par le volume utilisé à repérer sur une plaque à partir de l’homogénat dilué (e.g., volume total de 2 mL divisé par 0,1 mL d’homogénat dilué est égale à la limite inférieure de 20 UFC détectable).

7. le traitement de la cloison nasale et la trachée

  1. Homogénéiser les tissus dans le 0,3 mL de 1 % PBS/caséine avec une boulette de pilon homogénéisateurs moteurs sans fil. Homogénéiser les tissus pour 0,5 à 1 min jusqu'à ce que le tissu est en grande partie dissocié. Bactéries doivent être faites dans la suspension.
  2. Préparer 10 choisie x dilutions par dilution en série de 0,1 mL de la suspension homogénéisée dans des tubes de dilutions contenant 0,9 mL de PBS stérile. Dot 0,1 mL de chaque dilution sur étiquetés avant 10 % BG + Sm plaques et répandre la suspension à l’aide d’un épandeur de triangle qui a été stérilisé par un lavage de l’éthanol à 70 % et les flammes.
  3. Incuber les plaques à 37 ° C dans l’air ambiant pendant 4 jours.
  4. Compter et calculer CFU/orgue comme à l’étape 6.5 (Figure 6). Pour obtenir une limite inférieure de détection, le volume total dans lequel un organe a été homogénéisé est divisé par le volume utilisé au point sur une plaque de l’homogénat dilué (e.g., volume total 0,3 mL divisé par 0,1 mL de pur est égal à la limite inférieure de 3 UFC detecta ble).

8. traitement du sang

  1. Centrifuger les tubes contenant le sang isolé à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C pour granuler des globules rouges.
  2. Décoller délicatement le surnageant de sérum et de la pipette dans un tube de microcentrifuge de sérum préalablement marqué. Stocker les tubes à-20 ° C jusqu’au moment pour une analyse ultérieure en aval (i.e., ELISA Ig totales et spécifiques).

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Résultats

Le modèle décrit présente une méthode pour évaluer l’efficacité du vaccin et les réponses immunitaires au cours des interactions hôte-pathogène. La figure 1 illustre le calendrier de vaccination représentatif utilisé pour vacciner et infecter des souris et récolter des tissus pour analyse. Figure 2 illustre la configuration du système anesthésie employée pour induire la souris, permettant aux enquêteurs de livrer les immunisation...

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Discussion

Le protocole complet décrit ici afin d’étudier l’immunité induite par le vaccin à l’infection par b. pertussis permettra également l’évaluation des réponses de l’hôte à une variété d’autres pathogènes. Le protocole traite de méthodes pour livrer des immunisations, déterminer qui suit l’efficacité vaccin pathogène défi et dissection parallèle de la fonction immunitaire. Dans l’adaptation du protocole afin d’étudier d’autres agents pathogènes, plusieurs paramètres devront être modifiés. Ceux-ci incluent, mais ne s...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des fonds 1R01AI125560-01 et le démarrage de la Ohio State University.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chambre d’induction 2LVet Equip941444
FlurisoVet OneV1 501017n’importe quelle marque est appropriée
Bordet Gengou Agar BaseBD bioscience248200
CaséineSigmaC-7078
Casamino acidesVWRJ851-500GPassoire Scholte (SS) composants du milieu
Acide L-glutamiqueProduits de recherche IntG36020-500
L-ProlineProduits de recherche IntP50200-500
Chlorure de sodiumFisherBP358-10
Phosphate de potassium monobasiqueFisherBP362-1
Chlorure de potassiumFisherP217-500
Chlorure de magnésium hexahydratéFisherM2670-500G
Chlorure de calciumFisherC75-500
Base TrisFisherBP153-1
L-cystéine HClFisherBP376-100Suplements de média SS
Sulfate ferreux heptahydratéSigmaF-7002
NiacineResearch Products IntN20080-100
GlutathionProduits de recherche IntG22010-25
Acide ascorbiqueProduits de recherche IntA50040-500
RPMI 1640ThermoFisher Scientific11875093
FBSSigmaF2442-500mL  ; n’importe quelle source américaine, gentamicine non inactivée par la chaleur
ThermoFisher Scientific15710064
B-mercaptoéthanolFisher  ;BP176-100
15mL dounce broyeur de mouchoirsWheaton357544toute marque similaire est appropriée
Homogénéisateur à main sans filKontes/Sigma  ;Z359971-1EAtoute marque similaire est appropriée
Instruments - ciseaux, ciseaux courbes, pinces, pinces fines, écarteurs triangulairesn’importe quelle marque est appropriée
Seringues de 3 mlBD bioscience309657
tubes coniques de 15 mlFisher
tubes microfuge de 1,5 mlDenvilleC2170
70um passoires  ;
plaques de 60 mmThermoFisher Scientific130181
plaques de culture tissulaire à 48 puitsThermoFisher Scientific08-772-1C
Seringue à insuline 1 mL 28G1/2Fisher Scientific/Excel Int.14-841-31
Souris IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go ! KitInvitrogen / eBioscience50-173-21
Souris IL-17 ELISA Ready-SET-Go ! KitInvitrogen / eBioscience50-173-77
Souris IL-5 ELISA Ready-SET-Go ! KitInvitrogen / eBioscience50-172-09
339651 Fisher22363548

Références

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