Article de méthode

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

DOI :

10.3791/58933

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15 février 2019

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1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Dans cet article

Résumé

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Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Résumé

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La transplantation de cellules (CSPH) souches et progénitrices hématopoïétique a été une thérapie de pierre angulaire pour la leucémie et autres cancers pendant près d’un demi-siècle, est le seul remède connu d’infection par le virus d’immunodéficience humaine (VIH-1) à la base et prometteuse immense dans le traitement des maladies génétiques comme la bêta-thalassémie. Notre groupe a élaboré un protocole de thérapie génique HSPC modèle de primates non-humains (PNH), permettant aux scientifiques d’optimiser les mêmes réactifs et techniques qui sont appliqués à la clinique. Nous décrivons ici les méthodes pour purifier le CD34+ HSPCs et des sous-ensembles de cellules souches hématopoïétiques (CSH) persistant à long terme d’apprêté la moelle osseuse (BM). Techniques identiques peuvent être utilisés pour la purification des autres sources HSPC (p. ex., mobilisé de sang périphérique des cellules souches [CSSP]). Décrit est un protocole de 2 jours dans lequel cellules sont purifiés, cultivées, modifiés avec lentivirus (LV) et préparés pour perfusion vers l’hôte autologue. Des lectures clés de succès comprennent la pureté de la CD34+ HSPC population, la capacité de HSPCs purifiés pour former des colonies morphologiquement distinctes dans les milieux semi-solides et, surtout, efficacité de modification génétique. Le principal avantage de la thérapie génique HSPC est la capacité à fournir une source de cellules longue durée de vie qui donnent lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques. Comme tel, ces méthodes ont été utilisées aux thérapies de modèle pour le cancer, les maladies génétiques et maladies infectieuses. Dans chaque cas, l’efficacité thérapeutique est établie en améliorant la fonction de la progéniture HSPC distincte, y compris les globules rouges, lymphocytes T, lymphocytes B ou sous-ensembles myéloïdes. Les méthodes pour isoler, modifier et préparer HSPC produits sont directement applicables et traduisible à plusieurs maladies chez des patients humains.

Introduction

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Thérapie génique cellules souches est un moyen puissant pour traiter un large éventail de pathologies humaines. Thérapie génique HSPC est une approche particulièrement attractive, en raison de i) la facilité relative de recueillir ces cellules provenant de patients, ii) la richesse de la connaissance qui n’est disponible concernant les surface phénotypes cellulaires et ex vivo paramètres de culture et, comme le domaine s’agrandit, car iii) il présente des scientifiques avec une boîte à outils croissant de stratégies de modification génique adaptés à diverses maladies d’intérêt. Nous étudions activement HSPC gene therapy approches sous plusieurs angles, y compris les connaissances scientifiques fondamentales de biologie HSPC, la greffe de HSPCs modifiées dans les modèles précliniques in vivo et l’application à des populations de patients concernées. Nous et autres avons caractérisé le phénotype de surface cellulaire de fonctionnellement distinctes HSPC sous-ensembles1,2,3, la mobilisation et les régimes de conditionnement qui maximisent le rendement HSPC et greffe tout en minimisant la toxicité4,5et le gène modification et édition de gène des stratégies qui ont été adaptés à un large éventail de tumeurs malignes, génétique et maladies infectieuses6,7,8, 9,10. La fonction et la prise de greffe de HSPCs modifiées peuvent être évalués dans un certain nombre de modèles de petits et grands-animaux, dont des souris, des chiens et PSN. En particulier, les modèles de PSN sont avantageux car nombreux réactifs, par exemple, les anticorps spécifiques aux protéines de surface de cellules HSPC comme CD34 et CD90, peuvent être utilisés indifféremment dans les cellules humaines et PSN. En outre, contrairement aux souris, grands animaux tels les PSN permettent une approximation plus étroite de l’ampleur de la modification des gènes nécessaires à l’efficacité clinique. Enfin, PSN est l’étalon-or pour la modélisation de pathologies humaines telles que HIV-1 infection11 et un nouveau système modèle pour candidat anticancéreux et anti-VIH immunothérapies12,13.

Le but du présent protocole est de définir des méthodes pour purifier, modifier génétiquement et préparation de produits de perfusion NHP HSPC. Bien que hors de la portée du présent protocole, nous avons déjà montré que ces produits greffer chez les hôtes de PSN autologues, donnent lieu à toutes les lignées hématopoïétiques et offrent une efficacité thérapeutique dans un large éventail de modèles de la maladie1. Nous avons également caractérisé la clonalité d’après HSPCs et construit une plate-forme pour suivre la cinétique, le trafic et le phénotype des HSPCs individuelles et de leur progéniture, suivant la transplantation autologue1,14. Les méthodes présentées ici ont été mis au point avec les objectifs suivants : i) d’isoler HSPCs extrêmement purs et à long terme après sous-ensembles HSC, ii) de maintenir autorenouveler primitif au cours ex vivo la culture et iii) d’efficacement gène-modifier soit en vrac HSPCs ou à long terme faire une exception des sous-ensembles HSC. Nous employons magnétique assistée par cellule tri (MACS), ainsi que de la cellule activée par fluorescence triant (FACS), afin d’isoler phénotypiquement/fonctionnellement HSPC populations distinctes, compatibles avec les méthodes de nombreux groupes2,15, 16. L’entretien des CSH primitive culture (c'est-à-dire, minimisant la différenciation de ces cellules en progéniteurs engagés qui donnent lieu à pleinement différenciées des sous-ensembles lymphoïdes et myéloïdes) est un aspect essentiel du protocole décrit ici. Bien que précédemment, nous avons caractérisé les approches pour développer HSPCs tout en conservant un phénotype primitif17,18, ici, les auteurs décrivent un protocole qui met l’accent sur le maintien des CSH via un minime (48 h) et défini ex vivo culture.

La modification efficace des HSPCs et HSC sous-ensembles est des principaux objectifs du présent protocole. Parmi plusieurs approches, nous l’avons signalé, deux sont de loin les plus étudiés dans les essais cliniques : modification de gènes LV et gènes nucléase édition1,6,19. Stratégies de modification génétique parmi un certain nombre de plates-formes de nucléase utilisent spécifiquement modifier un gène ciblé d’intérêt, par exemple, le récepteur de chimiokine C-C type 5 (CCR5) pour le traitement de HIV infection7,19 ou Bcl11A pour le traitement des hémoglobinopathies6. Ici, nous nous concentrons sur la modification des gènes LV, dont des cargaisons transgéniques intègrent semirandomly dans le génome de8,1,20. Un avantage majeur des approches LV est la capacité à livrer de grandes quantités de matériel génétique (jusqu'à 8 ou 9 kilobases). Bien que les stratégies de modification de gènes sont élaborés pour cibler un transgène d’intérêt d’intégrer seulement à un locus spécifié par recombinaison homologue donneur (HDR), ces méthodes doivent être développement in vitro et sur des modèles animaux petits. En revanche, vecteurs de LV ont été utilisés intensivement dans les PSN et les patients21,22. Ce qui est important, le protocole décrit ici, qui utilise amorcée BM comme source HSPC départ, peut être facilement et largement adapté, par exemple, pour isoler le CSSP. Comme décrit ci-dessus, nous profitons du degré élevé de similarité génétique entre les PSN et les humains d’utiliser des réactifs qui sont applicables à ces deux espèces. Enfin, cette approche a été adaptée pour modifier d’autres sous-ensembles hématopoïétiques, à savoir T cellules12,23,24; l’avènement d’efficaces approches d’immunothérapie de lymphocytes T s’est appuyé fortement sur la même plateforme de LV utilisée dans le présent protocole. Ces méthodes conviennent à tout chercheur intéressé en biologie HSPC ou modification de gènes LV. Par exemple, le protocole de purification HSPC présenté ici pourrait servir à caractériser les nouveaux sous-ensembles HSC enrichi, comme décrit plus haut1,15,25. De même, la transduction LV méthodes présentées ici pourraient de même être appliquée et développée pour de nombreux autres types de cellules et les questions expérimentales, aussi bien dans des modèles in vitro et in vivo.

En résumé, nous présentons des méthodes pour isoler et modifier génétiquement le PSN HSPCs. Ces méthodes peuvent être facilement adaptées pour les autres espèces et d’autres sources de HSPCs. Ce protocole soigneusement contrôlé est très prometteur dans la modélisation des thérapies efficaces pour nombreuses maladies humaines.

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Protocole

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Autologue transplantations de PSN, d’amorçage (mobilisation), la collection de cellules et la modification des gènes sont menées conformes aux protocoles publiés précédemment26. Toutes les procédures expérimentales sont examinées et approuvées par le Comité de l’utilisation de la Fred Hutchinson Cancer Research Center et l’Université de Washington et d’institutionnels animalier (protocole #3235 - 01). Toutes les études sont réalisées en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health (« le Guide ») ; animaux ont été assignés au hasard à ces études.

1. enrichissement de CD34+ HSPCs et la Culture au jour le jour (Day -1)

  1. Récolter les BM et condition il.
    1. Mobiliser le PSN avec le facteur stimulant les colonies de granulocytes (GC & SF) pendant 4 jours comme décrit plus haut26.
    2. Endormir les animaux avec 100 mg/kg de la kétamine et 0,03 mL/kg de dexmédétomidine (0,5 mg/mL de bouillon). Administrer les analgésiques (p. ex., SR de buprénorphine) au moment du tirage au sort.
    3. À l’aide de tondeuses, raser les poils de l’animal de l’extrémité proximale de l’humérus et/ou le fémur bone(s) et frotter la peau avec gommage à base d’iode ou une solution antiseptique similaire, alternent avec de l’alcool et répéter 3 x. Comme anesthésique supplémentaire, insuffler le périoste bupivacaïne (2 mg par site, stock de 5 mg/mL).
    4. Positionnez l’aiguille d’aspiration de moelle osseuse (16 G) sur le site d’entrée périoste (cavité médullaire) et percer la peau, pénètre la cavité médullaire à l’aide d’un mouvement de rotation. Retirer le stylet de l’aiguille d’aspiration et réservez-le dans un champ stérile pour une utilisation ultérieure.
      Remarque : Choisir le site d’entrée périoste à la cavité médullaire dans une zone de l’os qui n’est pas couvert par les muscles et où la forme/paysage de l’OS est soit visible ou peut être facilement ressentie à travers la peau (généralement vers l’extrémité proximale ou distale de l’OS).
    5. L’aiguille de la BM, fixez une seringue contenant un mélange de solution de dextrose de citrate anticoagulante (ACD-A) et l’héparine (20 USP/mL, 1 mL par 9 mL de moelle à percevoir).
    6. Reculer le piston tout en bascule la branche doucement et en tournant, pour agiter la seringue pour mélanger les aspirer et anticoagulant. Tourner l’aiguille et le repositionner tout au long de l’aspiration et le retrait d’accéder à un plus grand pourcentage de cellules au sein de l’espace de la moelle osseuse.
    7. Une fois que l’échantillon est prélevé, retirer l’aiguille et appliquez une pression sur le site d’aspiration jusqu'à l’arrêt du saignement.
      Remarque : Selon le volume nécessaire, la moelle osseuse d’un à quatre membres (deux humérus, deux fémurs) peuvent être tirée au cours d’une même collection. Pas plus de 20 mL doivent être prélevé de chaque branche, et le volume total collecté devrait constituer pas plus de 10 % du poids de l’animal (10 mL/kg).
    8. Si reçoit les produits d’aspiration de plusieurs branches, combiner et noter le volume.
    9. Laissez le transfert de récupérer du PSN.
      1. Inverser les effets de la dexmédétomidine avec atipamézole 0,03 mL/kg (stock 5 mg/mL) après l’intervention. Fournir des analgésiques (p. ex., SR de buprénorphine) tel que prescrit par le personnel clinique vétérinaire pendant au moins 48 h après l’intervention, ou plus, à la discrétion de la clinique vétérinaire, basé sur des signes cliniques.
      2. Regagner sa cage chez l’animal après l’intervention et surveiller toutes les 15-20 minutes, jusqu'à ce que l’animal puisse s’asseoir ses propres. Surveiller l’animal quotidiennement par le personnel vétérinaire jusqu'à ce qu’il est établi que l’ou les lieux aspiration est guéris. En outre, surveiller pour déceler tout signe d’inflammation, infection ou la douleur.
    10. Parallèlement au traitement des cellules, conditionner le PSN même avec irradiation corporelle totale de myéloablatif (TBI) : 1 020 cGy à raison de 7 cGy/min. administrer irradiation en doses fractionnées pendant les 2 jours avant la perfusion de la cellule.
  2. Hemolyze la BM.
    1. Diviser la BM en tubes conique de 50 mL (10-12 mL par tube) et ajouter hémolytique tampon pour porter le volume à 50 mL (tableau 1). Incuber les cellules à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu’ils sont lysées, mais pas plus de 7 min. centrifuger à 800 g pendant 5 min et aspirer le surnageant de la pellet(s), en laissant 2 à 5 mL de volume/tube. Resuspendre le culot dans le volume résiduel.
      Remarque : Les échantillons avec succès lysés changent de couleur, d’un rouge foncé à un rouge clair transparent.
    2. Ajouter 10 à 15 mL de tampon/pellet hémolytique. Supprimer des caillots de sang à l’aide de passoires de cellule 70 µm. Ajouter hémolytique à 50 mL de tampon, incuber pendant 5 min à RT et essorer à 800 x g pendant 5 min.
    3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de tampon de MACS (tableau 1). Filtrer à nouveau à travers un tamis de cellule de 70 µm. Rincer le tube et le filtre avec 40 mL de MACS à 50 mL de tampon.
  3. Enrichir le CD34+ cellules de hémolysés globules blancs (WBC) à l’aide de protocoles standard.
    1. Faire tourner les cellules à 800 x g pendant 15 min. vérifier les tubes s’assurer aucune cellule tourbillons ne sont évidentes dans le haut/milieu. Si les cellules sont présentes au-dessus du culot, tourner de nouveau à une vitesse plus élevée (jusqu'à 1 000 x g maximum) et jusqu'à 10 min.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension il dans 10 mL de tampon de MACS, notant le volume exact. Compter les cellules à une dilution au 1/100 ou 1 : 1 000 à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
      Remarque : Cette numération totale est le nombre de pré-enrichissement.
    3. Ajouter MACS tampon pour abaisser la concentration de cellules à 1 x 108 cellules/mL. Si nécessaire, tout d’abord répéter les étapes 1.3.1 - 1.3.2 (p. ex., en raison d’un faible nombre de pré-enrichissement). Réserve de 5 x 106 cellules dans le tampon de MACS pour le sous-ensemble HSC coloration (échantillon pré-enrichissement).
    4. Ajouter anti-CD34 non conjugués anticorps (clone 12,8, Table des matières)27 pour les cellules restantes de pré-enrichissement à une concentration finale de 40 µg/mL (1 x 108 cellules/mL). Incuber la suspension de cellules à 4 ° C sur un agitateur de tube (voir la Table des matières) pendant 25 à 30 min.
    5. Utilisation Mac tampon pour porter le volume à 50 mL et essorer les cellules à 800 x g pendant 5 min. aspirer le surnageant, remettre en suspension les cellules dans 50 mL de tampon de MACS et un essorage à 800 x g pendant 5 min.
    6. Degas 100 mL de tampon de MACS avec deux tubes de filtre, enveloppant l’entrée d’air avec du papier ciré, pendant 25 à 30 min ou jusqu'à ce que prêt à l’emploi.
    7. Calculer le volume nécessaire de billes magnétiques : 1 mL de perles/109 cellules. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à 108 cellules/mL, après avoir ajoutent les perles. Par exemple : 3 x 109 cellules + 3 mL de perles + 27 mL de MACS de la mémoire tampon à 30 mL de volume total.
    8. Incuber la suspension de cellules à 4 ° C sur un agitateur de tube pendant 25-30 min.
    9. Au cours l’acquisition aimants pour les colonnes ; envisagez d’utiliser 0,6 x 109 cellules par colonne. Placer les colonnes sur l’aimant et insérer un tube conique de 50 mL sous chaque colonne pour recueillir l’écoulement à travers. Préparer un tube conique de 15 mL et le piston pour chaque colonne d’élution (étape
    10. Lors de l’incubation à l’étape 1.3.8 est terminée, ajouter le tampon de MACS à 50 mL et essorage à 800 x g pendant 5 min. aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le tampon de MACS dégazé (2 mL par colonne). Pipette doucement pour éviter d’introduire des bulles.
    11. Sans permettre la colonne fonctionner à sec, ajouter 1 mL de tampon de MACS dégazé à chaque colonne, puis 2 mL de suspension cellulaire. Rincer le filtre et le tube original avec un tampon MACS dégazé et diviser la solution également entre les colonnes (6 mL /) ; puis, ajouter 7 mL de tampon de MACS dégazé pour le lavage final.
    12. Doucement, tirez la colonne de l’aimant (poussez le haut de la page) et récupérer la dernière goutte à goutte dans le tube intermédiaire. Ajouter 5 mL de tampon de MACS dégazé à chaque colonne et appliquer le piston pour éluer les cellules dans le tube conique stérile de l’étape 1.3.9. Ne pas prélever tout liquide après que bulles apparaissent.
  4. Compter les cellules à la fois l’enrichi et les cheminement (FT) tubes de prélèvement à un taux de dilution de 01:10. Garder les cellules sur la glace. Aliquote 1 x 106 cellules de la fraction enrichie en CD34 et 5 x 106 cellules de fractions FT pour l’analyse par cytométrie en flux. Stocker la fraction FT à 4 ° C jusqu'à ce que le contrôle de la qualité (étape 2) est conclu.
    Remarque : Le nombre de CD34+ cellules nécessaires à succès greffe multilignée dans le PSN est dépend de la fréquence de la CD34 enrichie en HSC+CD90+CD45RA sous-ensemble– . Basé sur une fréquence moyenne de 3 à 5 % et l’exigence minimale de 122 000 CD34++CD45RA de CD90– cellules par kilogramme de corps poids1, il est recommandé de procéder à un total d’au moins 2,5 x 106 et jusqu'à 10 x 10 CD34 6 + cellules par kilogramme de poids corporel.
  5. Ajouter MACS tampon pour le CD34 enrichi de+ fraction de 50 mL au total, essorage à 800 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à 106 cellules/mL dans les médias HSPC (tableau 1).
    1. Les cellules à une densité de 106 cellules/mL dans l’évent, culture de tissus (TC) sur plaque-traités des flacons de T-75, 10-20 mL par flacon et les incuber pendant la nuit dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur. Reposer les flacons dans la longueur (ne pas debout).
      Remarque : Si vous le souhaitez, CD34 supplémentaires+ cellules ou CD34– FT peut être cryoconservé dans 90 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) + 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) à une concentration de 1 x 106 à 5 x 106 cellules/mL, puis refroidissement lent au - 80 ° C (par exemple, à l’aide de conteneurs de congélation). Le rendement moyen de récupération des cellules cryoconservés dépend de la CD34+ pureté et communément varie entre 50 % et 80 % avec une viabilité de > 80 %.

2. contrôle de la qualité des cellules CD34 enrichi (jour -1)

  1. Préparer les échantillons pour la cytométrie en flux.
    1. Remettre en suspension les échantillons réservés de chaque étape d’isolement mentionné ci-dessus (pré-enrichissement, FT et fractions enrichies CD34) dans un tampon FACS à une concentration de 10 x 106 cellules/mL et transférer 100 µL de chaque suspension de cellules (tableau 1) dans un tube de FACS.
      Remarque : Échantillons de contrôle devraient inclure des cellules non colorées de chaque étape de l’isolation (par exemple, les cellules de 5 x 10,5 ) pour le réglage du forward scatter (FSC), diffusion latérale (SSC) et autofluorescence dans chaque canal de fluorescence. En outre, les perles colorés à l’unique compensation pour chaque anticorps conjugué fluorochrome devront régler la compensation entre canaux adjacents (tableau 2 et tableau 3).
    2. Ajouter l’anticorps désirés (par exemple, anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA et anti-CD90), selon les instructions du fabricant, pour une épreuve (1 x 106 cellules dans 100 µL) (tableau 3). Incuber pendant 20 min à 4 ° C. Ajouter 3 mL de tampon de FACS et un essorage à 800 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant, remettre en suspension dans 100 µL de tampon de FACS et d’analyser sur un cytomètre de flux approprié (étape 2.2).
  2. Préparer la cytomètre/trieuse de flux pour l’analyse.
    Remarque :     il est recommandé d’effectuer l’analyse sur le même ordinateur qui sera utilisé pour la cellule de tri à l’étape 2.3.
    1. Générer un protocole incluant FSC/SSC, CD45/CD34 et CD45RA/CD90 (trois parcelles de flux). Faites un clic droit sur un terrain de flux et ajouter la disposition de la hiérarchie de la Population .
    2. Faites un clic gauche sur l’intrigue FSC/SSC, sélectionnez l’entité surfacique porte et tirer une porte afin d’exclure les débris et les cellules mortes. Mettez en surbrillance la nouvelle porte et renommez-le à se disperser dans la fenêtre inspecteur.
      Remarque : Ceci est automatiquement appelé P1.
    3. Faites un clic droit dans le centre de l’intrigue de flux CD45/CD34, accédez à montrer les populationset porte l’intrigue sur nuages de points. Tirage au sort une porte rectangulaire autour du CD45intCD34+ de cellules à cellules CD34-non exclure et nonhematopoietic, comme bien que résiduel des plaquettes et des érythrocytes (CD45–). Renommez la porte à CD34+.
    4. La porte de l’intrigue de flux CD45RA/CD90 sur le CD34+ population. Dessinez trois subgates indépendants autour de CD90+CD45RA cellules– (enrichis pour csh), CD90–CD45RA cellules– (enrichis de progéniteurs multipotentes et érythro-myéloïdes [sipm/EMPs]) et CD90–CD45RA + (enrichis de progéniteurs myéloïdes lympho [LMPs]) des cellules. Renommez les portes en HSC, MPP-EMPet LMP, respectivement.
    5. Lorsque vous avez terminé, vérifiez que la hiérarchie de la Population contient six entrées hiérarchiquement organisées dans l’ordre suivant : 1) tous les événements ; 2) nuages de points XY ; 3) CD34+; 4) HSC ; 5) DÉPUTÉ-EMP ; 6) LMP. Veiller à ce que les parcelles de flux et de la forme de la porte regardent tel qu’illustré à la Figure 4.
    6. Exécuter sans coloration préenrichissement leucocytes pour ajuster la tension pour FSC, SSC et tous les canaux de fluorescence (tableau 2, exemple 5). Exécuter les perles colorés à l’unique compensation pour ajuster la compensation entre canaux adjacents (tableau 2, échantillons 1-4). Exécuter toutes les autres non souillées enregistré et colorées des échantillons avec le corrigé et compensé protocole, afin de documenter l’efficacité d’enrichissement CD34 (tableau 2, échantillons de 6-9).
      Remarque : Conserver l’échantillon final (tableau 2, échantillon 10) pour l’analyse des flux simultanés et cellule de tri à l’étape 2.4.
  3. Configurer le trieur de cellules pour la tri-purification des sous-ensembles CD34 dans essais sur des cellules (CFC) formant des colonies.
    Remarque :     si une autre machine a été utilisée pour l’analyse (étape 2.2), mis en place le protocole sur le trieur de cellules, comme décrit dans les étapes 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Ajustez l’angle/tension pour les volets côtés gauche et droit dans le logiciel de trieuse cellules à déposer des cellules dans des tubes de 15 mL contenant le support de CFC. Configurer l’angle du flux de côté pour éviter les défauts d’alignement. Lavage, ajustez l’angle du flux côté dévié jusqu'à ce que les cellules triées frappé le milieu de CFC et non pas du côté du tube car très peu de cellules est triés.
    2. Dans le navigateur, ouvrez le dossier feuilles du mondial et créer un nouveau tri-mise en page en utilisant le bouton dans le menu en haut de la fenêtre du navigateur. Modifier l’entrée dans le menu déroulant périphérique de Collection dans 2 tubes, à l’entrée dans le menu déroulant de précision à 4 voies pureté ou unicellulaires et définir les événements cibles à 800-1 200 cellules. Cliquez sur le champ de tri-emplacement (à gauche ou à droite), sélectionnez rubrique ajouter dans le menu et choisir la population de trier dans le menu.
  4. Trier les cellules pour des dosages de CFC.
    Remarque :     tri pour les dosages de CFC est effectuée uniquement avec des cellules du produit enrichi CD34 (tableau 2, échantillon 10).
    1. Charger l’échantillon 10, enregistrer des événements de 2 000-3 000 et amende-ajuster les portes de la sorte pour s’adapter à des populations de force et de la cible du signal.
    2. Lorsque l’installation est terminée, acquérir des cellules (tableau 2, échantillon 10). Acquisition de données comme indiqué au point 2.2.3, régler le débit à 500-1 000 cellules/s et trier 800-1 200 cellules de i) la porte de Scatter, ii) le CD34+ porte, iii) la porte HSC, iv) la porte de MPP-EMP et v) la porte LMP dans des tubes distincts contenant 3,6 mL de CFC médias.
      Remarque : Tri pour des dosages de CFC est réalisée uniquement avec des cellules du produit enrichi CD34 (tableau 3, échantillon 10). Les cellules de l’éparpillement et CD34+ gates doivent être triés individuellement, tandis que les csh, MPP-PGE et LMPs peuvent être triées en même temps dans le poste de titulaire du tube gauche et droite.
    3. Vortex et verser 1 mL de suspension cellulaire à chacun du nontissue stérile, 3 x 3,5 cm, traitée pour la culture boîtes de pétri. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10 à 14 jours dans un conteneur secondaire (par exemple, une boîte de pétri de 15 cm).
    4. Le 10-11 jours postplating, compter les colonies individuelles des trois boîtes par État, basé sur la morphologie des colonies.

3. Gene Modification du CD34+ HSPCs et récupération au jour le jour (jour 0)

  1. Diluer 2,5 mL de 1 µg/µL de solution de CH-296 à 50 µg/mL dans 50 mL de solution saline équilibrée de Hank (HBSS, voir la Table des matières).
  2. Préparer les flacons pour la transduction de LV.
    1. Déterminer le nombre approximatif de nontissue-culture (sans CT)-traité de flacons nécessaires (généralement à partir du nombre de cellules déterminé à l’étape 1.4). Plan de plaque 1 x 107 cellules dans 10 mL de médias par flacon de T-75 (1 x 108 cellules total nécessiterait 10 flacons) et inclure une plaque de 12 puits TC non traitées (condition de transduction simulé). Ajouter HBSS stérile et 50 µg/mL stock CH-296 de l’étape 3.1 à chaque fiole/plaque, à une concentration de 2 µg/cm2. Pour ballons de T-75, utiliser 3 mL de 50 µg/mL mL CH-296 + 7 de HBSS ; pour la plaque de 12 puits, utilisez 160 µL de 50 µg/mL CH-296 + 340 µL du HBSS / puits.
    2. Laisser la vaisselle s’asseoir non perturbée au RT sur un banc propre ou dans la hotte pendant 2 h. aspirer le CH-296 et remplacez-le avec un volume similaire de HBSS stérile + 2 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber 30 min à RT, aspirer la HBSS/BSA et laver la vaisselle dont le volume similaire HBSS stérile contenant 2,5 % 1 M HEPES, pH 7,0. Aspirez immédiatement avant l’ensemencement des cellules (étape 3.4).
      Remarque : Après l’étape 3.2.2, n’autorisent pas les plaques/fioles à se dessécher. Plaques contenant stérile HBSS + 2,5 % 1 M HEPES sont conservés à 4 ° C durant la nuit (p. ex., préparer le jour -1).
  3. Récolter et transmettre le CD34+ cellules de jour -1.
    1. À l’aide d’une pipette 10 mL, rincer les cellules faiblement adhérentes en la rinçant répétées, douce de chaque flacon de culture avec HBSS stérile. Assurez-vous que toutes les cellules seront détache (le cas échéant, robinet/claque le ballon pour décoller les cellules).
    2. Centrifuger les cellules à 800 x g pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans les médias de transduction à une concentration de 1 x 106 cellules/mL. Une fois que toutes les cellules ont été collectés, déterminer le nombre d’éléments, à l’aide d’un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.
    3. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire (1 x 106 cellules) dans un puits de la plaque de 12 puits CH-296-enduit (pour l’échantillon de contrôle mock-transduites). Diviser le reste des cellules parmi les fioles de T-75 (étape 3.2.2), ajouter environ 10 mL (1 x 107 cellules) par flacon. Permettre à des cellules d’adhérer à l’enduit de CH-296 par incubation à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 30 min, avec les bouchons ventilés.
    4. Décongeler les médias conditionné par virus (VCM, Table des matières) et déterminer le titre en unités infectieuses par millilitre (UI/mL)28,29,30,31,32 . Ajouter le volume approprié de VCM dans chaque fiole de T-75 de l’étape 3.3.3 et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2.
      Remarque : Si vous effectuez une transduction seule, incuber pendant la nuit ; Si vous effectuez une double transduction, répétez cette stepapproximately 6 - 8 heures après la première transduction sans une lavage/récupération de phase et, ensuite, incuber pendant la nuit. Par exemple, pour un ballon (1 x 107 cellules) avec une multiplicité de désiré d’infection (MOI) de 10, ajouter 1 mL de virus titré à 1 x 108 ui/mL.

4. cellule récolte et préparation pour perfusion (jour 1)

  1. Récolter les cellules.
    1. Prélever des cellules transduits et simulacres comme décrit aux points 3.3.1 - 3.3.2. Effectuer des lavages séquentielles avec 10 mL de HBSS, transférant les lavages au tube conique avec les cellules. Veiller à ce que toutes les cellules ont été retirés les fioles, taraudage/gifler les flacons si nécessaire.
    2. Centrifuger les suspensions cellulaires à 800 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant resuspendre le culot dans 1 mL de HBSS. Combiner les tubes contenant des cellules de la même condition. Rincer avec 10 mL de HBSS et l’ajouter à la suspension cellulaire. Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Porter le volume total de cellules à 50 mL dans HBSS et centrifuger à 800 x g pendant 5 min.
  2. Impulsion de prostaglandine E2 (PGE2) et préparer des réactifs pour le produit de la perfusion.
    1. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules transduits (non simulé) à 5 x 10,6/ml dans les médias HSPC sans cytokines. Ajouter 10 mM PGE2 à une concentration finale de 10 µM. incuber les cellules sur la glace pendant 2 h, eux agitant doucement chaque 30 min.
    2. Au cours de l’étape 4.2.1, chaleur-inactiver sérum autologue (Table des matières), le conteneur d’emballage en papier ciré et l’incubation à 56 ° C pendant 30 min. préparent 2 % sérum autologue en mélange (500 µL de sérum inactivés par la chaleur + 24,5 mL de HBSS), de HBSS eux Eh bien, et conserver le mélange sur la glace jusqu'à l’utilisation. Aussi, au cours de l’étape 4.2.1, récolter les cellules transduites mock dans une assiette de 12 puits en pipettant également les cellules verticalement vigoureusement. Ajouter la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL, laver 3 x avec 1 mL de HBSS et ajouter les liquides de lavage dans le même tube conique de 15 mL.
    3. Après 2 h d’incubation de la PGE2, laver les cellules 2 x par centrifugation eux à 800 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Après le deuxième lavage, remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de HBSS pour le comptage, utilisant un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
      Remarque : Les cellules s’agglutiner fréquemment après une impulsion de PGE2, qui peut faire pour le comptage des cellules moins fiables. Dans l’affirmative, utilisez le nombre de cellules de l’étape 4.1.2 plutôt que celui de l’étape 4.2.3.
  3. Réserve des simulacres et transduits cellules pour le contrôle de la qualité (étape 5) du produit infusion : 5 x 105 à 1 x 106 cellules pour écoulement cytometry/cellule tri (étapes 5.1 et 5.3) et environ 1 x 106 cellules de culture liquide (étape 5.2) et colonie chaîne par polymérase (PCR) (étape 5.4).
  4. Préparer le produit de la perfusion.
    1. Avec le reste des cellules transduits, effectuer un lavage troisième dans 50 mL de HBSS, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de HBSS + 2 % de sérum autologue (préparé à l’étape 4.2.2). Dessiner le 10 mL de la solution dans une seringue de 20 mL, munie d’une aiguille de 16,5 G. Laver le tube 10 ml de HBSS + sérum 2 % auto et attirer le lavage dans la même seringue pour porter le volume total à 20 mL. Capuchon de la seringue avec le capuchon de l’aiguille, étiqueter la seringue et placez-le sur la glace pour transport/infusion.
    2. Infuser le produit transduite cell dans l’hôte autologue, situé à l’intérieur d’une installation de recherche animale agréés, via un cathéter veineux central33,34. Surveiller complète de leucocytes l’animal greffé (CBCs) et la chimie du sang et effectuer des essais de gène-marquage étude spécifique adaptés au projet1,6,19.

5. contrôle de la qualité

Remarque : Cytométrie en flux et tri cellulaire sont effectués après que les cellules sont infusés dans les animaux dans le cadre du suivi décrit à l’étape 4.4.2. Données de cytométrie en flux est utilisé immédiatement après la transplantation pour déterminer la composition des phénotypes définis sous-ensembles de cellules souches et progénitrices du produit de la perfusion (étapes 5.1 et 5.3), alors que des analyses de l’analyse des CFC est effectuée 12-14 jours gestative pour déterminer l’efficacité du gène-modification par colonie PCR (étape 5.4).

  1. Effectuer la cytométrie en flux et tri de CFC du produit infusion.
    1. Analyser les cellules par cytométrie en flux et tri-purifier CD34 sous-ensembles pour des dosages de CFC, tel que décrit à l’article 2. CFC de semences dosages de simulacres et transduits cellules CD34 (le produit infusion après le pouls de la PGE2).
    2. Trier un maximum de 800 cellules / condition et vortex, plaque, culture et compter les dosages des CFC comme indiqué au point 2.4. Après avoir compté, choisissez les colonies des CFC des épreuves pour effectuer la colonie PCR comme indiqué au point 5.4.
  2. Milieu de culture liquide
    1. Cellules de plaque pour la culture liquide dans les médias de la CSPH à 1 x 106/ml en plaques TC non traitées. Sur posttransduction de 2, 5 et 12 jours, récolter et compter les cellules pour la cytométrie en flux. Cellule de tri pour des dosages de CFC n’est pas nécessaire.
    2. Les jours 2 et 5, replate 33 % des cellules dans les supports HSPC neufs à 1 x 106/ml. Geler les 33 % des cellules dans le tampon d’extraction de l’ADN pour quantitative PCR en temps réel. Utilisez 33 % des cellules pour la cytométrie en flux, comme décrit aux points 2.1 et 2.2.
    3. Ces données de l’étape 5.2.2 permet d’analyser la composition phénotypique de la progéniture hématopoïétique. Déterminer la fréquence des cellules CD34 + et sous-ensembles phénotypiquement définis comme indiqué au point 2.2.2 au sein de chaque échantillon. Comparer la composition du CD34+ cellules entre les conditions à déterminer l’effet de la modification génétique.
      Remarque : CD34+ cellules devraient maintenir leur expression à travers la culture entière et contiennent tous les sous-ensembles phénotypiques. Une perte de CD90+CD45RA– cellules ou une surreprésentation des sous-ensembles phénotypiques peut indiquer directes ou indirectes des effets de la modification génétique.
  3. Quantifier l’expression transgénique (par exemple., vert fluorescent protéine [GFP]) par cytométrie en flux (facultatif et en fonction du montage expérimental), adaptation du protocole de l’étape 2.2.
    1. Ajouter trois parcelles de flux montrant SSC/transgène (p. ex., SSC/GFP). Porte la première parcelle csh, le second sur MPPs-PGE, et le troisième sur terrain LMPs. chaque transgène versus (p. ex., GFP) et créer des portes nommées HSC-GFP+, député-EMP-GFP+et LMP-GFP+, respectivement.
    2. Lorsque vous avez terminé, la hiérarchie de la Population doit contenir les entrées hiérarchiquement organisées neuf dans l’ordre suivant : 1) tous les événements ; 2) nuages de points XY ; 3) CD34+; 4) HSC ; 5) HSC-GFP+; 6) DÉPUTÉ-EMP ; 7) député-EMP-GFP+; 8) LMP ; 9) LMP-GFP+.
      Remarque : Toute expression du transgène plus tard dans un milieu liquide (p. ex. jours 5 et 12) reflète mieux l’efficacité de modification génétique déterminée par PCR sur colonie à l’étape 5.4. Points dans le temps plus tôt dans des cultures liquides peuvent surestimer l’expression du transgène, en raison de l’EFV non intégrées. De même, tri des flux des cellules GFP+ pour des dosages de CFC au jour 1 seront traduira par plusieurs colonies de positifs fausses.
  4. Effectuer la PCR sur colonie.
    1. Après le dépouillement dans les étapes 2.4.4 et 5.1.1, prélever des colonies unique dans 50 µL de tampon d’extraction de l’ADN, en utilisant un µL à 10 ou 20 µL pipette et pipette de haut en bas pour transférer les colonies à un tube d’un 8-tube PCR bande cap. Choisir les huit colonies de l’état de maquette et 88 de la condition transduite pour générer une plaque à 96 puits complet. Ajouter 50 µL de tampon d’extraction de l’ADN à chaque puits.
    2. Extraire l’ADN des colonies, à l’aide d’un thermocycleur et le programme suivant : 65 ° C/20 min et 99 ° C/10 min à 4 ° C tenir. Vous souhaitez déplacer l’ADN à-20 ° C dès que possible pour une qualité optimale.
    3. Effectuer la colonie PCR pour quantifier les cellules transduites-LV, en comparant le nombre de colonies LV+ , en utilisant des amorces de Lenti F/R, les colonies total, en utilisant des amorces actine F/R et le contrôle (Table des matières).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ci-dessus est conçu pour isoler et gène-modifier CD34 PSN+ HSPCs, qui peut ensuite être perfusé dans l’hôte autologue (Figure 1 et Figure 2). En suivant ce protocole, nous avons généralement obtenir jusqu'à 8 x 109 totales globules blancs de BM apprêtée de macaques de queue de cochon et, parfois, double de ce montant de macaques rhésus. Chez les deux espèces, le nombre de CD34+...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vecteur de LV ingénierie est la méthode la mieux caractérisée de gène-modifier les types de cellules comme CD34+ HSPCs, destinés à la transplantation ultérieure in vivo. Le protocole décrit ici est conçu pour maximiser le nombre de HSPCs modifiées qui persistent à long terme in vivo et fournir des avantages cliniques aux patients atteints de diverses maladies malignes, infectieuses et génétiques. Bien que les stratégies de modification génique ont vu le jour ces dix dernières années, les cellules modifiées LV ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Helen Crawford pour la préparation de ce manuscrit et Jim Woolace pour la conception graphique et Veronica Nelson Devikha Chandrasekaran pour avoir participé à l’élaboration du protocole. L’élaboration du présent protocole a été pris en charge par des subventions de la NIH National Institute of Allergy et maladies infectieuses (R01 AI135953 et AI138329 à H.P.K.) et le National Heart, Lung, and Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 et U19 HL129902 à H.P.K.), ainsi que les NIH P51 OD010425 et, en partie par le NIH/NCI Cancer Center, Support Grant P30 CA015704. H.P.K. est un chercheur de médecine moléculaire Markey et reçu le soutien comme premier récipiendaire de la chaire José Carreras/E. Donnall Thomas doué pour la recherche sur le Cancer et la chaire de Fred huche pour cellulaire et Gene Therapy.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stemspam SFEM II (« HSPC ») MÉDIAStemCell09655
saline équilibrée de Hank’sGibco14175095
solution saline tamponnée au phosphateGibco14190-144
Pénicilline/streptomycineGibco15140-122
Dimethyl SulfoxideSigma AldrichD2650-100
Laboratoires de décontamination100 % éthanolM18027161M
CyclosporineSigma30024-25MG
500 mM EDTAInvitrogen15575-038
Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleurSigma AldrichPS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2,5 mL, 1 µ ; g/µ ; L)TaKaRAT100B
Sérum Bovin AlbumineSigmaA7906-100g
HEPESSigmaH9897
Rat anti-souris IgM billes magnétiquesMiltenyi Biotec130-047-301
Facteur de cellules souches humaines recombinantes (SCF)Peprotech300-07
Thrombopoïétine humaine recombinante (TPO)Peprotech300-18
Tyrosine kinase 3 humaine recombinante de type FMS (FLT-3)Peprotech300-19
Sulfate de protamineSigmaP-4505
14 mL Polypropylène Tube à fond rondCorning352059
Colony Gel 1402ReachBio1402
Séparateurs QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS L25 ColonnesMiltenyi biotec130-042-401
10 mM PGE2Cayman Chemical14753-5mg
Fioles T-75 traitées TCBioexpressT-3001-2
Fioles T-75 non traitéesThermo-Fisher13680-57
Seringues 20 mLBD Biosciences302830
Aiguilles 16,5 GBD Capuchon
BD Biosciences305819
QuickExtract Solution d’ADNEpicentreQE09050
Capuchon de bandelette à 8 tubes Tubes PCRUSA scientific1402-2708
Thermocycleur à 96 puitsFiltres de4375786
Miltenyi Biotec130-041-407
Passoire, Cellule ; BD Faucon ; Stérile; Maille en nylon ; Taille des mailles : 70um ; Couleur : blanc ; 50/CSfisher scientific352350
Ultracomp ebeadseBioscience01-2222-42
MACSmix Tube RotatorMiltenyi130-090-753
3 mL Seringues Luer-LockThermo-Fisher14823435
35 mm x 10 mm Boîte de culture cellulaireCorning430165
60 mm x 15 mm Boîte de culture cellulaireCorning
Boîte de culture cellulaire de 150 mm x 25 mmCorning430599
Fioles non traitées TCFalcon353133
Qiagen Extraction d’ADNQiagen51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone :5E10Biolegend328110
PE-CF594 Souris Anti-Human CD34 Clone :563BD horizon562449
Souris APC-H7 Anti-Human CD45RA Clone : 5H9BD Pharmingen561212
V450 Souris Anti-NHP CD45 Clone : d058-1283BD Biosciences561291
Sérum autologuePrélevé sur l’hôte autologue et cryoconservé avant la mobilisation et la collecte des HSPC CD34+N/ABeard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches de repeuplement à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Milieu conditionné par le virus (VCM)Laboratoire Kiem, FHCRC Centre coopératif d’excellence en hématologie (CCEH)N/ABeard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches de repeuplement à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Anticorps anti-CD34, clone 12.8Kiem LabN/ABeard, B. C. et al. Sélection efficace et stable médiée par MGMT de cellules souches repeuplées à long terme chez les primates non humains. Journal d’investigation clinique. 120 (7), 2345 à 2354 (2010).
Introduction à Lenti F : AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par le SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Introduction Lenti R : TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAAIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Amorce d’actine F : TCCTGTGGCACTCACGAAACTIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Amorce d’actine R : GAAGCATTTGCGGTGGACGATIntegrated DNA TechnologiesN/APeterson, C. W. et al. Greffe polyclonale multilignée de cellules modifiées par le gène Cal-1 et sélection in vivo après infection par le SHIV dans un modèle de primate non humain du sida. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Solution TC d’embout de seringue 305198 de précision pré-séparation Thermo-Fisher 430196

Références

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