Article de méthode

Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

DOI :

10.3791/58951

⸱

15 février 2019

 , 
1Department of Integrated Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2International Research Organization for Advanced Science and Technology, Kumamoto University

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stomates mouvement intervient dans les échanges gazeux plante, qui est essentiel pour la photosynthèse et la transpiration. Stomates d’ouverture et de fermeture sont réalisées par une augmentation significative et diminuent du volume de cellules de garde, respectivement. Navette de transport des ions et l’eau se produit entre les cellules de garde et de plus grandes cellules épidermiques voisines durant le mouvement stomatique, la distribution espacée des stomates de la plante est considérée comme une distribution optimale de mouvement stomatique. Des systèmes expérimentaux pour perturber le modèle espacé des stomates sont utiles pour examiner l’importance de l’enchaînement d’espacement. Plusieurs gènes clés associées à la distribution de stomates espacée ont été identifiés, et les stomates en cluster peuvent être induites expérimentalement en altérant ces gènes. Alternativement, des stomates en cluster peuvent être également induites par les traitements exogènes sans modification génétique. Dans cet article, nous décrivons un système simple induction pour cluster stomates chez Arabidopsis thaliana plantules par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Notre méthode est simple et directement applicables aux lignes transgéniques ou mutants. Plus gros chloroplastes sont présentés comme une caractéristique biologique cellulaire des cellules de garde en cluster induite par le saccharose. En outre, une image microscopique confocale représentative des microtubules corticaux est montrée comme un exemple d’observation intracellulaire des cellules de garde en cluster. L’orientation radiale des microtubules corticaux est maintenue dans les cellules de garde en cluster comme des cellules stomatiques espacés dans des conditions de contrôle.

Introduction

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La stomie de plante est un organe essentiel pour l’échange de gaz pour la photosynthèse et la transpiration, et déplacement stomatique est réalisé par des changements significatifs dans les cellules de garde par adoption pilotée par l’ion et une sortie d’eau. Au microscope, on peut observer un modèle de distribution espacés de stomates sur les surfaces des feuilles et des tiges. Cette répartition espacée des stomates est considérée pour aider le mouvement stomatique, qui est régi par échange d’ions et l’eau entre les cellules de garde et les voisins des cellules épidermiques1,2. Systèmes d’induction expérimentale de stomates en cluster sont utiles pour étudier l’importance de la distribution espacée de stomates.

Il a été signalé que le regroupement spatial des stomates peut être induit par une modification génétique des gènes principaux pour la différentiation de cellules de garde3,4 ou un traitement avec un composé chimique5. Nous avons également rapporté que traitement d’immersion avec une solution moyenne additionné de sucres y compris le saccharose, glucose, et fructose causé stomatique clustering dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana 6. Réduit de callose dans nouvelles parois séparant les méristémoïdes et les cellules épidermiques a été observée dans l’épiderme de cotylédon imprégnées de saccharose, ce qui suggère que le saccharose solution immersion traitement affecte négativement la paroi cellulaire, ce qui empêche les fuites et action ectopique des produits des gènes clés pour la différenciation des cellules de garde (par exemple les facteurs de transcription) vers adjacentes épidermique cellules6. Un mécanisme similaire a été proposé d’études sur les gsl8/chor des mutants7,8. Notre système expérimental pour l’induction reproductible des stomates en cluster à l’aide de la solution moyenne contenant du saccharose est assez facile et bon marché. Il peut également être utilisé pour étudier les structures intracellulaires comme les organites et le cytosquelette dans les cellules stomatiques cluster lorsqu’il est appliqué à des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents cette étiquette structures intracellulaires9, 10.

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Protocole

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1. préparation de la Solution moyen 3 % contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog

  1. Ajouter 1,1 g de sels milieu Murashige-Skoog et 15 g de saccharose dans un bécher.
  2. Ajouter 490 mL d’eau distillée et mélanger bien à l’aide d’une barre de remuer.
  3. Ajuster le pH de 5,8 à l’aide de KOH.
  4. Diluer dans 500 mL d’eau distillée et transvaser la solution dans une bouteille moyenne.
  5. Stérilisez la solution par autoclavage (121 ° C, 20 min). Si ne pas utilisée immédiatement, cette solution peut-être être conservée à 4 ° C après la stérilisation.

2. induction des stomates en cluster par contenant du saccharose Solution moyenne Immersion traitement

  1. Stériliser les graines.
    1. Préparer la solution de stérilisation en ajoutant 1 µL de 10 % et de 500 µL de 5 % de chlore actif NaClO solution Triton X-100 à 500 µL d’eau stérile.
    2. Placez env. 50 transgéniques a. thaliana seeds transportant un marqueur fluorescent comme CT-GFP11 ou12 de la GFP-TUB6 dans un tube de 1,5 mL.
    3. Ajouter 1 mL de solution d’éthanol à 70 % et mélanger bien en inversant les cinq fois. Laissez pendant 1 min.
    4. Les graines vont couler au fond du tube. Sur un banc propre, Retirez doucement l’éthanol à 70 % à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL de solution de stérilisation. Bien mélanger en retournant cinq fois et laisser pendant 5 min.
    5. Laver les graines. Toujours travailler dans des conditions aseptiques sur un banc propre, Retirez doucement la solution à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL d’eau stérile. Répétez cette opération cinq fois.
  2. Ajouter 1,5 mL de stérilisé contenant du saccharose 1/2 Murashige-Skoog moyenne solution à 3 % dans chaque puits d’une plaque de 24 puits sur un banc propre.
  3. Ajouter deux graines stérilisées dans chaque puits. Scotchez le couvercle sur la plaque 24 puits à l’aide de deux couches de parafilm.
  4. Transférer la plaque 24 puits à un ensemble de chambre de croissance à 23,5 ° C avec un cycle lumière-obscurité de h-12 h/12 100 µmol m−2 s−1 blanc lumière et incuber pendant 14 jours.

3. microscopique Observation des stomates en cluster

  1. Place 30 µL de 1/2 3 % de sucrose-contenante Murashige-Skoog solution moyenne provenant d’un puits de la plaque 24 puits au centre d’une lame de verre (taille : 76 x 26 mm, épaisseur : 1,0 à 1,2 mm).
  2. Retirer un cotylédon un semis âgés de 14 jours à l’aide de ciseaux de dissection. Flotter le cotylédon avec le côté d’observation vers le haut sur la goutte de la solution.
  3. Préparer le spécimen de cotylédon selon notre méthode précédente13. Essentiellement, placez 30 µL de la solution sur le centre d’un couvercle en verre (taille : 18 × 18 mm, épaisseur : 0,12-0,17 mm). Retournez le couvercle en verre et placez-le délicatement sur les cotylédons. Essuyer l’excès de tampon à l’aide d’un chiffon non pelucheux.
  4. Définir un spécimen sur la scène d’un microscope confocal laser et sélectionnez les cellules de garde en cluster pour l’observation à l’aide d’éclairement lumineux zone.
  5. Acquérir des images confocales de structures intracellulaires fluorescent étiquetés conformément aux instructions du fabricant du microscope.

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Résultats

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Ici, le protocole pour une simple méthode d’induction de stomates clustering avec contenant du saccharose de la solution moyenne chez les plantules d’a. thaliana a été présenté. Les cellules stomatiques cluster cultivés en solution moyenne contenant du saccharose (Figure 1B) ont des chloroplastes plus grandes que les cellules stomatiques cultivés dans des conditions de contrôle sans sucrose (Figure 1

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Discussion

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Nous avons présenté des protocoles pour l’induction des stomates en cluster dans les semis d’a. thaliana par traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du saccharose. Comme indiqué ici, cette méthode est très simple et ne nécessite aucun compétences spécialisées, mais peut induire efficacement les stomates en cluster. Plus de 45 % des cellules stomatiques sont groupés avec 3 % contenant du saccharose solution moyenne (valeurs moyennes de plus de 20 observations indépendantes)6

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Nous sommes reconnaissants à m. Seiichiro Hasezawa pour son soutien de notre travail. Ce travail a été prise en charge par des subventions de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) KAKENHgrant numéros 17K 19380 18 H 05492, de la Fondation Sumitomo une subvention pour des projets de recherche scientifique fondamentale accorder nombre 160146 et la fondation de Canon à T.H. Ce système expérimental a été développé sous un soutien financier à partir du nombre de pages jsp KAKENHgrant 26891006 à K. A. Nous remercions Robbie Lewis, M.Sc., du groupe Edanz (www.edanzediting.com/ac) pour l’édition d’un projet du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque 24 puitsSumitomo BakéliteMS-0824R
Laser 488 nmFurukawa DenkoHPU-50101-PFS2
Laser 488 nmOlympusSapphire488-20/O
Filtre passe-long 510 nm Filtre passe-bandeOlympusBA510IF
524 - 546 nm Filtre passe-bandeSemrockFF01-535/22-25
530 nm passe-court filtreOlympusBA530RIF
561 nm laserCVI Melles Griot85-YCA-025-040
604 - 644 nm filtre passe-bandeSemrockFF01-624/40-25
Tête de balayage laser confocaleYokogawaCSU10
Tête de balayage laser confocaleOlympusFV300
Caméra CCD refroidiePhotométrieCoolSNAP HQ2
Logiciel d’acquisition d’imagesMolecular DevicesMetaMorph version 7.8.2.0
Logiciel d’acquisition d’imagesOlympusFLUOVIEW v5.0
Huile d’immersionOlympusHuile d’immersion Type-Fne = 1.518 (23 degrés)
Microscope inverséOlympusIX-70
Microscope inverséOlympusIX-71
Mélange de sels végétaux Murashige et SkoogFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation392-00591Murashige T et Skoog F (1962) Un milieu révisé pour la croissance rapide et les essais biologiques avec des cultures de tissus de tabac. Physiologia Plantarum 15(3), 473-497.
Lentille d’objectif  ;OlympusUPlanApo 100x / 1.35 NA Huile Iris 1.35NA = 1.35
ObjectifOlympusUPlanAPO 40x / 0,85 NANA = 0,85
SaccharoseFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation196-00015

Références

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  1. Raschke, K., Fellows, M. P. Stomatal movement in Zea mays: shuttle of potassium and chloride between guard cells and subsidiary cells. Planta. 101 (4), 296-316 (1971).
  2. Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant and Cell Physiology. 55 (4), 773-780 (2013).
  3. Bergmann, D. C., Sack, F. D. Stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 58, 163-181 (2007).
  4. Pillitteri, L. J., Torii, K. U. Mechanisms of stomatal development. Annual Review of Plant Biology. 63, 591-614 (2012).
  5. Sakai, Y., et al. The chemical compound bubblin induces stomatal mispatterning in Arabidopsis by disrupting the intrinsic polarity of stomatal lineage cells. Development. 144 (3), 499-506 (2017).
  6. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Breaking of plant stomatal one-cell-spacing rule by sugar solution immersion. PLOS One. 8 (9), 72456(2013).
  7. Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiology. 150 (1), 105-113 (2009).
  8. Guseman, J. M., et al. Dysregulation of cell-to-cell connectivity and stomatal patterning by loss-of-function mutation in Arabidopsis chorus (glucan synthase-like 8). Development. 137 (10), 1731-1741 (2010).
  9. Akita, K., Hasezawa, S., Higaki, T. Cortical microtubules and fusicoccin response in clustered stomatal guard cells induced by sucrose solution immersion. Plant Signaling and Behavior. 13 (4), 1454815(2018).
  10. Akita, K., Hasezawa, S. Sugar solution induces clustered lips. Cytologia. 79 (2), 125-126 (2014).
  11. Holzinger, A., Buchner, O., Lütz, C., Hanson, M. R. Temperature-sensitive formation of chloroplast protrusions and stromules in mesophyll cells of Arabidopsis thaliana. Protoplasma. 230 (1-2), 23-30 (2007).
  12. Abe, T., Hashimoto, T. Altered microtubule dynamics by expression of modified α-tubulin protein causes right-handed helical growth in transgenic Arabidopsis plants. The Plant Journal. 43 (2), 191-204 (2005).
  13. Higaki, T. Real-time imaging of plant cell surface dynamics with variable-angle epifluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (106), 53437(2015).

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Mots-clés

Traitement au saccharosevolume des cellules stomatiqueslargissement des chloroplastesmicrotubules corticauxmicroscopie confocalemilieu de Murashige Skoogregroupement stomatiqueincubation de plantules

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