Un protocole en acier inoxydable pour l’ARN haute qualité laser capturer des cellules de Microdissected Purkinje du cervelet humain Post-Mortem

Résumé

Ce protocole utilise une approche sans tache de visualiser et d’isoler les cellules de Purkinje dans les tissus frais congelés de cervelet humain post-mortem par microdissection de saisie de laser. Ce protocole vise à produire des quantités suffisantes d’ARN de haute qualité pour RNA-sequencing.

Résumé

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un outil avantageux qui permet la collecte de cellules cytologiquement et/ou phénotypiquement pertinentes ou régions de tissus hétérogènes. Produit capturé peut être utilisé dans une variété de méthodes moléculaires pour les protéines, isolement d’ADN ou d’ARN. Cependant, la préservation de l’ARN de tissus post-mortem de cerveau humain est particulièrement difficile. Techniques de visualisation standard pour LCM nécessitent histologique ou méthodes de coloration immunohistochimique qui peuvent encore dégradent RNA. Par conséquent, nous avons conçu un protocole en acier inoxydable pour la visualisation dans LCM avec le but de préserver l’intégrité du RNA dans le tissu de cerveau humain post-mortem. Les cellules de Purkinje du cervelet est un bon candidat pour une visualisation en acier inoxydable, en raison de sa taille et sa localisation caractéristique. Le cortex cérébelleux a couches distinctes qui diffèrent dans la densité des cellules, ce qui les rend un bon archétype d’identifier sous microscope grossissement élevé. Les cellules de Purkinje sont grands neurones situées entre la couche de cellules de granules, qui est un réseau cellulaire dense de petits neurones, et la couche moléculaire, ce qui est rare dans les corps cellulaires. Grâce à cette architecture, l’utilisation de la visualisation en acier inoxydable est faisable. Autres systèmes d’organe ou cellule qui imitent ce phénotype conviendraient également. Le protocole en acier inoxydable est conçu pour corriger les tissus frais congelés avec de l’éthanol et supprimer les lipides avec xylène pour meilleure visualisation morphologique sous microscopie optique grossissement élevé. Ce protocole ne tient pas compte d’autres méthodes de fixation et est spécialement conçu pour les échantillons de tissus frais congelés capturées à l’aide d’un rayonnement ultraviolet (UV)-système de LCM. Nous présentons ici un protocole complet pour sectionnement et fixation tissu cérébelleux humain congelé frais post mortem et purification de l’ARN des cellules de Purkinje isolées par UV-LCM, tout en préservant la qualité de RNA pour RNA-sequencing ultérieur. Dans nos mains, ce protocole produit des niveaux exceptionnels de visualisation cellulaire sans besoin de réactifs de coloration et rendements RNA avec des nombres élevés de l’intégrité des RNA (≥8) selon les besoins pour des expériences de profilage transcriptionnels.

Introduction

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un précieux outil de recherche qui permet de séparer les cellules pathologiquement pertinentes pour les évaluations subséquentes moléculairement entraînée. L’utilisation des analyses moléculaires dans ces échantillons de tissus hétérogènes et la corrélation avec les données cliniques et pathologiques est une étape nécessaire pour évaluer l’importance translationnelle de la recherche biologique¹. Lors de l’analyse des données d’expression de gène de l’ARN, l’utilisation de coupes de tissus congelés est hautement recommandée car il permet l’excellente qualité de l’ARN ainsi que maximiser la quantité

Protocole

Tous les échantillons humains utilisés dans le présent protocole ont été obtenus avec le consentement éclairé et ont été approuvés par l’interne Review Board (IRB) de Columbia University et l’Université de Yale.

Remarque : L’intégralité du présent protocole doit suivre RNA stricte gestion des lignes directrices, auquel cas une main gantée est toujours utilisée, toutes les surfaces sont nettoyées avec un décontaminant RNase et tous les documents de travail sont DNA/RNA/nucléase gratuite.

1. essai ARN l’intégrité des tissus avant LCM à partir

Remarque : Te....

Résultats

Ce protocole détaille les étapes pour la préparation des tissus cérébraux humains congelés frais post mortem pour UV-LCM. Annotations et spécifications approfondies sont données pour la découpe du cryostat, comme il peut être difficile de couper le tissu cérébral congelées fraîches avec un degré élevé de précision. Le point le plus important à considérer est que les tissus frais congelés est extrêmement froid et nécessite une quantité importante de temps pour s’acclimater à la température.......

Discussion

Le protocole présenté ici est spécialement modifié pour être une approche inox en visualisant les tissus morphologiquement distinctes pour UV-LCM. Cette méthode est conçue pour maximiser l’intégrité RNA pour ultérieur séquençage direct de RNA, tout en conservant un niveau de visualisation des tissus. La capacité de distinguer les différents types de cellules pour la capture, pour créer la plus pure population de cellules possible, est indispensable pour comprendre les différents profils moléculaires dans les tissus humai.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Lames à membrane pour tissus. Nous vous déconseillons d’utiliser des lames de verre.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Les capuchons opaques sont utilisés pour améliorer la visualisation sur les endoscopes inversés, seuls
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	D’autres produits de décontamination RNase conviennent également. Utiliser pour nettoyer toutes les surfaces avant le travail.  ;
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	Si vous utilisez de l’éthanol alternatif, assurez-vous d’une qualité élevée. Essentiel pour la fixation des tissus.
Xylènes (certifiés ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	Si vous utilisez du xylène alternatif, assurez-vous d’une qualité élevée. Essentiel pour la visualisation des tissus.
Eau distillée UltraPure	Invitrogen	10977-015	D’autres eaux sans ARN/ADN/Nucléase conviennent également. Utilisé uniquement en dilution de l’éthanol.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Tout porte-diapositive/pot convient également. Doit être nettoyé avant utilisation. Utilisé pour la fixation après sectionnement.  ;
Plaque anti-roulis, Assy. 70 mm 100 &mu ; m	Leica Biosystems	14041933980	Le type de plaque anti-roulis est déterminé par le type de cryostat et l’emplacement de fixation sur la scène. Tous les cryostats ont des exigences différentes.
Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC de n’importe quel fournisseur fera l’affaire. Suivez les instructions pour le traitement de l’eau.  ;
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Les lingettes Kimwipes peuvent être commandées auprès de n’importe quel fournisseur et utilisées dans n’importe quelle taille. Les lingettes Kimwipe doivent être utilisées pour nettoyer le microscope et le cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Toute marque d’OCT est acceptable. Aucun tissu ne sera incrusté dans l’OCT, il est difficile d’attacher du tissu au « mandrin ».
Lames de microtome à profil bas Edge-Rite	Thermo Scientific	4280L	Le type de lame est déterminé par le type de cryostat. Tous les cryostats ont des exigences différentes.
Leica Microsystems 3P  ; MANDRINS DE CRYOSTAT DE 25 + 30 MM	Fisher Scientific	NC0558768	type de mandrin est déterminé par type de cryostat. Tous les cryostats ont des exigences différentes. L’une ou l’autre taille convient.  ;
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Requis pour l’extraction d’ARN après LCM. Tampon de lyse RLT essentiel pour recueillir les cellules capturées à partir d’un chapeau opaque.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Requis pour l’extraction de l’ARN des préparations de section, qui sont effectuées avant le LCM pour tester l’intégrité de l’ARN des tissus de départ.
L’ensemble de DNase sans RNase	Qiagen	79254	supprimera tout ADN pour permettre une population d’ARN pur. Assurez-vous que Dnase est frais.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Volume d’achat à la discrétion de l’utilisateur. Nécessaire pour l’ajout au tampon RLT pour la lyse cellulaire. Empêche l’activité de la RNase.
Globe Scientific  ; Tube de microcentrifugation gradué certifié Lot (2 ml)	Fisher Scientific	22-010-092	Tout tube de 2 ml exempt de RNase, de DNase, d’ADN humain et de pyrogène fera l’affaire.