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Article de méthode

Modèle préclinique d’ischémie des membres postérieurs chez les lapins diabétiques

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DOI :

10.3791/58964

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2 juin 2019

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1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons une intervention chirurgicale utilisée pour induire une ischémie périphérique chez les lapins atteints d’hyperlipidémie et de diabète. Cette chirurgie agit comme un modèle préclinique pour les conditions rencontrées dans la maladie des artères périphériques chez les patients. L’angiographie est également décrite comme un moyen de mesurer l’étendue de l’ischémie introduite et la récupération de la perfusion.

Résumé

La maladie vasculaire périphérique est un problème clinique répandu qui touche des millions de patients dans le monde. Une conséquence majeure de la maladie vasculaire périphérique est le développement de l’ischémie. Dans les cas graves, les patients peuvent développer une ischémie des membres critiques dans laquelle ils éprouvent une douleur constante et un risque accru d’amputation des membres. Les thérapies actuelles pour l’ischémie périphérique comprennent la chirurgie de contournement ou des interventions percutanées telles que l’angioplastie avec l’endoprothèse ou l’athérectomie pour rétablir le flux sanguin. Cependant, ces traitements échouent souvent à la progression continue de la maladie vasculaire ou de la resténose ou sont contre-indiqués en raison de la mauvaise santé globale du patient. Une approche potentielle prometteuse pour traiter l’ischémie périphérique implique l’induction de la néovascularisation thérapeutique pour permettre au patient de développer des vasculatures collatérales. Ce réseau nouvellement formé atténue l’ischémie périphérique en rétablissant la perfusion dans la zone touchée. Le modèle préclinique le plus fréquemment utilisé pour l’ischémie périphérique utilise la création d’une ischémie des membres postérieurs chez les lapins sains par ligature de l’artère fémorale. Dans le passé, cependant, il y a eu une forte déconnexion entre le succès des études précliniques et l’échec des essais cliniques concernant les traitements pour l’ischémie périphérique. Les animaux sains ont généralement une régénération vasculaire robuste en réponse à une ischémie induite chirurgicalement, contrairement à la vascularité et à la régénération réduites chez les patients atteints d’ischémie périphérique chronique. Ici, nous décrivons un modèle animal optimisé pour l’ischémie périphérique chez les lapins qui comprend l’hyperlipidémie et le diabète. Ce modèle a réduit la formation collatérale et la récupération de la pression artérielle par rapport à un modèle avec un régime plus élevé de cholestérol. Ainsi, le modèle peut fournir une meilleure corrélation avec les patients humains atteints d’angiogenèse compromise des co-morbidités communes qui accompagnent les maladies vasculaires périphériques.

Introduction

La maladie artérielle périphérique (PAD) est un trouble circulatoire fréquent dans lequel la progression de la formation de plaque athérosclérotique conduit à un rétrécissement des vaisseaux sanguins dans les membres du corps. L’augmentation récente des facteurs de risque d’athérosclérose, y compris le diabète, l’obésité et l’inactivité, a entraîné une prévalence croissante de la maladie vasculaire1. Actuellement, on estime que 12% – 20% de la population générale âgée de plus de 60 ans a une maladie artérielle périphérique2. Une conséquence majeure de la maladie artérielle périphérique est le développement de l’ischémie périphérique, le plus souvent trouvé dans les membres inférieurs. Dans les cas graves, les patients peuvent développer une ischémie des membres critiques, un État dans lequel il y a une douleur constante due à un manque de flux sanguin. Les patients ayant une ischémie des membres critiques ont une probabilité de 50% d’avoir un membre amputé dans l’année qui a été diagnostiquée. En outre, les patients diabétiques ont une incidence plus élevée de la maladie artérielle périphérique et des résultats plus pauvres suite à des interventions de revascularisation3,4. Les thérapies actuelles pour l’ischémie périphérique comprennent des interventions percutanées telles que l’athérotomie et le stentation ou le contournement chirurgical. Cependant, pour de nombreux patients, ces traitements ne fournissent que des avantages à court terme et beaucoup ne sont pas assez sains pour les interventions chirurgicales majeures. Dans ce travail, nous décrivons un modèle animal préclinique pour tester de nouveaux traitements ciblant les maladies vasculaires périphériques qui incorpore la génération d’ischémie périphérique chez les lapins par ligature chirurgicale dans le contexte de l’état de la maladie diabétique.

Le modèle d’ischémie des membres postérieurs chez les lapins a été utilisé comme modèle physiologique pour les maladies vasculaires obstructives et précurseur préclinique des études humaines pendant plus d’un demi-siècle5,6. Les lapins sont souvent une espèce préférée pour des études sur l’ischémie périphérique due à la musculature développée de la cheville et du muscle de veau, contrairement aux grands modèles animaux communs qui sont des ongulés (animaux avec des sabots). Plusieurs revues récentes ont abordé l’utilisation de ce modèle et d’autres dans la modélisation des maladies vasculaires périphériques chez l’homme7,8. Des modèles similaires utilisant l’ischémie des membres postérieurs chez les lapins ont été utilisés dans des études précliniques de facteurs de croissance9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, thérapie génique21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44et cellules souches45,46,47,48,49,50 ,51pour la néovascularisation thérapeutique dans les membres. Malheureusement, les essais cliniques qui ont suivi ces études animales réussies n’ont pas montré d’avantages significatifs pour les patients52.

On a suggéré une explication de la raison de cet échec translationnel est que la condition de l’ischémie périphérique chez les patients humains est une qui comprend la résistance aux signaux angiogéniques53,54,55, 56 , 57 , 58 , 59. plusieurs études ont montré des défauts dans les voies de signalisation angiogéniques dans le diabète et l’hyperglycémie. Le diabète et l’hyperlipidémie conduisent à une perte de protéoglycanes héparan sulfate et une augmentation des enzymes qui coupent le sulfate d’héparane, présentant un mécanisme potentiel pour la résistance à l’angiogenèse thérapeutique/artério-Genèse avec des facteurs de croissance60 , 61. ainsi, une caractéristique clé d’un modèle pour l’ischémie périphérique devrait inclure un aspect de la résistance thérapeutique afin que les thérapies puissent être évaluées dans le contexte de l’état de la maladie présent chez les patients humains.

Dans ce travail, nous décrivons un modèle de lapin de l’ischémie périphérique par la ligature chirurgicale des artères fémorales. Une période de plomb avec l’induction du diabète et de l’hyperlipidémie est incorporée dans le modèle. Nous avons comparé ce modèle à un autre modèle qui incorpore un régime adipeux plus élevé sans diabète et a constaté que le modèle avec le diabète et le niveau inférieur d’hyperlipidémie était plus efficace pour réduire la croissance des vaisseaux sanguins. Notre modèle combine les progrès qui ont été utilisés par des groupes distincts, dans le but de fournir une méthode pratique et normalisée pour obtenir des résultats cohérents dans la recherche des maladies vasculaires périphériques.

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Protocole

Les études impliquant des animaux ont été réalisées avec l’approbation de l’Université du Texas à Austin et du Centre scientifique UTHealth à Houston Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC), le Bureau d’examen des soins et de l’utilisation des animaux (ACURO) de l’armée des États-Unis Bureau de la recherche médicale et du commandement du matériel des protections de la recherche, et conformément aux lignes directrices de la NIH pour les soins aux animaux.

1. induction du diabète et de l’hyperlipidémie

  1. Transition des lapins néo-zélandais (âgés de 4 à 6 mois) d’une tasse de Chow de luzerne standard à 0,1% de Chow-cholestérol au cours de quatre jours. Pour les jours 1 à 5, utilisez des ratios de Chow à cholestérol standard de 1:0, 3:1, 1:1, 1:3 et 0:1, respectivement. Après deux semaines sur 0,1% de Chow-cholestérol, inciter les lapins à avoir le diabète en utilisant l’injection alloxane comme décrit dans les étapes suivantes
  2. Séchez les lapins utilisant 35 – 75 mg/ml de kétamine et 1 – 2 mg/ml d’acépromazine par injection sous-cutanée et préparation pour une injection intraveineuse en introduisant un cathéter dans la veine auriculaire gauche marginale à l’aide d’un cathéter de 22 g.
  3. Prélever une goutte de sang des lapins par l’intermédiaire du cathéter de veine auriculaire pour la mesure de niveau de glucose sanguin de base (BGL). Tout glucomètre standard peut être utilisé. Les taux normaux de glucose pour un lapin sont généralement de l’ordre de 80 à 150 mg/dL.
  4. Injecter de l’alloxane à 100 mg/kg reconstitué dans une solution saline à un volume de 8 mL à travers le cathéter auditif lentement sur une période de 8 minutes à l’aide d’une pompe à seringue.
  5. Vérifiez le BGL toutes les heures pour les 12 h suivants en utilisant un glucomètre standard pour surveiller l’hypoglycémie.
    1. Placez le lapin dans un restrainer.
    2. Anesthésier l’oreille avec 2,5% de Lidocaine/2,5% de crème de prilocaïne.
    3. Prendre le sang de la veine auriculaire latérale à l’aide d’une aiguille de 27 G et mesurer BGL à l’aide d’un compteur standard.
  6. Mesurez le BGL deux fois par jour pendant les 7 premiers jours. Donner aux lapins une injection d’insuline si le BGL atteint ou dépasse 350 mg/dL.
  7. Préparez une bille en acier inoxydable de 3 mm pour l’implantation comme marqueur de taille pendant les angiogrammes avant le jour de la chirurgie.
    1. Coupez un morceau circulaire de 10 mm de feuille de silasque sur une plus grande tôle à l’aide d’un poinçon de biopsie.
    2. Montez la bille au centre de la tôle à l’aide d’un mastic de silicone transparent.
    3. Couvrez complètement la bille avec le mastic. Laisser le mastic guérir pendant au moins 24 h.
    4. Placez la bille dans un sac ouvert de polyéthylène de faible densité de 2 pouces x 3 pouces et placez-la dans un sac de stérilisation à stériliser avec du gaz d’oxyde d’éthylène.

2. préparation du lapin pour la chirurgie

  1. Anesthésier le lapin à l’aide de 20 – 40 mg/kg de kétamine et de 2 mg/kg de midazolam par injection sous-cutanée. Placer le lapin sur 1,5% – 3% d’isoflurane (typiquement 2%) tout au long de la sédation initiale à l’aide d’un masque. Donner une injection d’alfaxalone pour maintenir l’anesthésie par une injection intramusculaire de 3 mg/kg.
  2. Une fois anesthésiés, enlever le masque et insérer un tube endotrachéal à revers, dans les voies respiratoires et se connecter à un ventilateur. Continuer à administrer l’isoflurane à 1,5% – 3%.
  3. Recueillir le sang de l’artère centrale de l’une ou l’autre oreille pour un panneau de chimie de base.
  4. Placez un cathéter auriculaires de 22 G dans la veine auriculaire latérale pour la solution de Ringer lactée dans la perfusion pendant toute la procédure chirurgicale. On peut également utiliser une solution saline normale (0,9% de chlorure de sodium).
  5. En utilisant la veine latérale dans l’oreille opposée, placer un cathéter dans la veine et livrer alfaxalone à 6 mg/kg/h. Augmentez graduellement l’alfaxalone à 8 mg/kg/h tout en diminuant l’isoflurane à 0,6% pendant la période de préparation.
  6. Pour limiter la douleur et le risque d’infection, administrer la buprénorphine (0,01 mg/kg) et l’enrofloxacine (5 mg/kg) à l’aide d’une injection sous-cutanée avec une aiguille de 25 G.
  7. Coupez les cheveux sur le cou, les cuisses intérieures droite et gauche, et le dos en utilisant des tondeuses (#40 lame). Les cheveux sont retirés de l’arrière pour maintenir le contact avec le pad de mise à la terre.
  8. Placez un brassard de pression artérielle sur chacun des membres postérieurs et mesurez la pression artérielle initiale. Placez le brassard juste au-dessous du genou avec la sonde juste au-dessus du jarret sur la surface latérale.
  9. Positionnez le lapin sur la table de chirurgie sur son dos et frottez et drapez les sites de chirurgie. Cela inclut le cou pour l’accès à l’artère carotide et la cuisse droite intérieure pour l’accès de l’artère fémorale. Effectuer le gommage de stérilisation avec des gommages alternés de 2% de chlorhexidine et 70% d’alcool éthylique. Répétez cette trois fois, puis appliquez un spray final avec une solution de chlorhexidine à 2%.
  10. Placez une bille en acier inoxydable de 3 mm qui a été stérilisée à l’intérieur d’un sac en polyéthylène à faible densité sur le dessus de la jambe droite (nettoyée) près de la partie supérieure de la cuisse pour servir de référence de taille lors des mesures d’angiogramme. Placez un drapé stérile sur la jambe jusqu’au moment de la chirurgie. Laisser le ballon à l’intérieur du sachet en plastique stérile pendant la première angiographie.

3. angiographie

  1. Exposer la bonne artère carotidienne commune
    1. Faire une incision de 4 à 5 cm de long juste latéralement à la trachée à l’aide d’un scalpel avec une lame #15.
    2. Utiliser une dissection émoussée pour exposer l’artère carotidienne et ouvrir l’incision à l’aide de petits rétracteurs Weitlaner. Isoler soigneusement l’artère carotidienne de la veine jugulaire et du nerf nerf vague. Typiquement, un ciseaux incurvé de Metzenbaum et un hémostat incurvé de moustique sont utilisés pour la dissection émoussée. Assurez-vous d’obtenir une séparation complète de l’artère carotidienne du nerf et de la veine jugulaire pour que les ligatures ne ligaturent que l’artère.
  2. Placer une ligature à l’aide d’une suture de soie 4-0 à l’extrémité proximale et distale de l’artère exposée. Attacher l’extrémité distale de la carotide avec un noeud de chirurgien suivi de quatre noeuds carrés. À l’extrémité proximale, utiliser un ligaloop pour lui permettre d’être serré ou desserré au besoin. L’utilisation d’un ligaloop placé à l’extrémité proximale de l’artère exposée peut aider à sécuriser l’introducteur et le cathéter.
  3. Administrer 500 UI d’héparine par l’intermédiaire de l’IV. Utiliser environ 0,5 mL de lidocaïne à 1% appliqué le long de la carotide exposée pour dilater le récipient. Un traitement est généralement suffisant, mais il peut être répété selon les besoins. Coupez approximativement à mi-chemin à travers l’artère carotidienne à l’aide d’un scalpel ou d’IRIS ciseaux, puis placez l’outil d’insertion de fil de 4 pouces dans l’artère.
  4. Alimenter un fil-guide de 0,014 pouce x 185 cm à travers l’outil d’insertion à la bifurcation aortique à la crête iliaque dans l’aorte descendante. Retirez l’outil d’insertion et insérez un cathéter angiographique 3F à queue de cochon sur le fil.
  5. Faire avancer le cathéter de queue de cochon à 2 cm proximale de la bifurcation aortique à la crête iliaque de l’aorte descendante.
  6. Positionner la pointe du cathéter entre la septième vertèbre lombaire et la première vertébrale sacrale. Testez l’emplacement du cathéter en injectant manuellement un agent de contraste de 2 à 4 mL.
  7. Administrer une injection intra-artérielle de 100 μg de nitroglycérine par le cathéter pour augmenter la vasodilatation.
  8. Administrer 0,8 mL de lidocaïne à 1% au lapin à travers le cathéter pour aider à la vasodilatation pendant l’angiogramme. Fixez le tube de l’injecteur au cathéter et enlevez les bulles d’air dans la conduite. Injecter 8-9 mL de milieux de contraste à l’aide d’un injecteur angiographique automatisé à travers le cathéter.
  9. Enregistrer des images sérielles des membres postérieurs à l’aide d’angiographie.
    1. Réglez l’injecteur de puissance pour injecter le contraste à 3 mL/sec pour un total de 8-9 mL. Effectuer une angiographie de soustraction numérique à 6 images par seconde.
    2. Sélectionnez les images série créées et modifiez une photo de chaque angiogramme en utilisant approximativement-40% de réglage pour minimiser l’apparence de l’os et de capturer une image complète de la perfusion du navire avec le contraste. Un exemple d’angiogramme du flux vasculaire Après la ligature/excision de l’artère fémorale est illustré à la figure 1.

4. isolement de l’artère fémorale

  1. Faire une incision longitudinale dans la peau au-dessus de l’artère fémorale droite à l’aide d’un scalpel (#15 lame). S’assurer que l’incision s’étend inférieurement du ligament inguinale se terminant à la zone juste proximale de la rotule (environ 6 cm).
  2. Utilisez une dissection émoussée avec des ciseaux incurvés Metzenbaum ou un hémostat incurvé pour exposer l’artère fémorale.
  3. Utilisez les rétracteurs Weitlaner pour maintenir l’incision ouverte.
  4. Ajouter 0,5 mL de lidocaïne à 1% localement pour réduire l’irritation nerveuse et favoriser la vasodilatation.
  5. Continuer la dissection émoussée des tissus pour libérer toute la longueur de l’artère fémorale ainsi que toutes les branches de l’artère fémorale, y compris les artères épigastriques inférieures, fémorales profondes, CIRCUMFLEX latérales et superficielles épigastriques (figure 2a) .
  6. Disséquer plus loin le long des artères poplitées et saphènes, ainsi que de l’artère iliaque externe (figure 2a). Humidifiez périodiquement la zone avec une solution saline pour protéger contre les lésions tissulaires. Si la dissection émoussée est effectuée le long de la rainure fémorale (entre les muscles), il n’est pas nécessaire de couper le muscle.
  7. Séparer soigneusement l’artère de la veine et du nerf comme illustré à la figure 2b, C. Ligate les artères indiquées par le diagramme avec 4,0 sutures de soie en plaçant deux cravates avec assez d’espace entre eux pour couper l’artère. Ces liens sont réalisés avec un nœud de chirurgien suivi de quatre noeuds carrés.
  8. Couper entre les deux attaches sur les artères ligées en utilisant les petits ciseaux Metzenbaum. Accise l’artère fémorale de son origine proximale comme une branche de l’artère iliaque externe au point distalement où elle bifurque pour former les artères saphènes et poplitées.

5. répéter l’angiographie

  1. Utiliser la suture en soie 4-0 pour attacher la feuille Silastic, avec une bille en acier inoxydable de 3 mm dans la partie supérieure du muscle quadriceps. Tirez la peau sur le ballon après qu’elle est en place.
  2. Administrer une injection intra-artérielle de 100 μg de nitroglycérine par le cathéter pour augmenter la vasodilatation.
  3. Si nécessaire, administrer un autre 0,8 mL de lidocaïne à 1% au lapin à travers le cathéter pour aider à la vasodilatation pendant l’angiogramme.
  4. Injecter 8-9 mL de milieux de contraste à l’aide d’un injecteur angiographique automatisé.
  5. Effectuer une angiographie comme décrit à l’étape 3,9.

6. fermeture et récupération des plaies

  1. Retirez le cathéter de l’artère droite. Attachez l’artère à l’aide de la suture en soie 4-0 qui est déjà en place autour de l’artère.
  2. Suture les deux plaies fermées. Fermez les couches musculaires et subcuticulaires en utilisant 4-0 le Polydioxanone ou 3-0 polyglactine 910 sur une aiguille conique (voir tableau des matériaux) dans un modèle de suture continue. Fermez la peau en utilisant 4-0 le Polydioxanone ou 4-0 polyglactine 910 sur une aiguille de coupe inversée (voir tableau des matériaux) dans un modèle de suture subcuticulaire continue enterré.
    Remarque: si disponible, la le Polydioxanone est préférée pour les deux.
  3. Administrer des injections intradermiques de 0,25% de bupivacaïne à proximité des incisions à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 25 G. Insérez l’aiguille et injectez 0,5 mL pendant que l’aiguille est tirée vers l’arrière. Donner une injection par côté de la plaie pour l’incision sur le cou (deux injections sur le cou) et deux injections par côté de la plaie pour l’incision sur la jambe (quatre injections sur la jambe; six injections au total). Le volume total injecté est de 3 mL (0,5 mL x 6 injections).
  4. Administrer des injections sous-cutanées de 0,5 mg/kg de méloxicam et de buprénorphine à libération prolongée à 0,12 mg/kg.
  5. Surveillez le lapin comme il récupère de l’anesthésie. Le lapin commencera automatiquement à avaler pendant qu’il se réveille de l’anesthésie. Une fois la réaction de déglutition effectuée, retirer le tube endotrachéal. Fournir une surveillance étroite et un soutien thermique jusqu’à ce que le lapin est capable de maintenir la fonction cardiovasculaire et la température corporelle. Retournez le lapin à son enclos une fois qu’il est en mesure de déambuler.
  6. Employez les légumes frais et/ou l’alimentation de seringue d’un régime de soins intensifs avec des injections de sérum physiologique sous-cutanée si le lapin ne tolère pas le Chow après l’opération. Chou, brocoli, chou-fleur, carottes ou autres légumes de saison peuvent être utilisés. Déchiqueter les légumes et les mélanger ensemble pour aider le lapin à retourner manger.

7. la surveillance

  1. Anesthésier les lapins toutes les deux semaines pour acquérir la pression artérielle sur les deux jambes comme décrit à l’étape 2,8. Récolter le sang de l’artère centrale de l’oreille pour une utilisation dans les dosages de chimie sanguine. Alternativement, prenez le sang de la veine saphène ou de la veine céphalique. Prendre approximativement 2 mL à chaque point de temps. Utilisez un panneau de chimie sanguine standard pour l’analyse. Si nécessaire, ajouter des tests pour les lipoprotéines de basse densité (LDL), les lipoprotéines de haute densité (HDL) ou l’hémoglobine (HbA1c).
  2. Prenez une très petite quantité de sang pour les mesures BGL.

8. le traitement

  1. Préparez dix seringues avec traitement, porteuse et CROSSLINKER. Remplissez chaque seringue juste avant de l’utiliser avec 100 μL de lisier de sulfate de calcium, puis 100 μL d’alginate de sodium à 2% avec des facteurs de croissance ou d’autres traitements tels que l’alginate est le plus proche de la pointe de la seringue.
  2. Administrer une injection préparée dans le muscle avant de préparer le prochain. Cela réduit le temps que l’alginate interagit avec le sulfate de calcium dans la seringue. Espacent les injections uniformément le long des deux côtés de l’artère fémorale sur la cuisse. Pour obtenir des injections uniformes, créer une feuille de silicone avec des trous pour guider l’injection, comme décrit dans d’autres études19. Cela peut être facilement préparé à l’aide d’un poinçon de biopsie pour créer des trous dans les feuilles de silicone disponibles dans le commerce.

9. angiographie des terminaux, euthanasie, fixation de perfusion et récolte tissulaire

  1. À la date de l’extrémité, effectuer l’angiographie comme décrit à l’étape 3, mais utiliser l’artère carotide gauche pour l’accès.
  2. Après l’angiographie, déplacez l’animal vers la table autopsie et effectuez la fixation de perfusion pour préserver les tissus des membres postérieurs:
    1. Augmentez l’isoflurane à 3% – 4% et effectuez une pincée pour confirmer que l’anesthésie est suffisamment profonde.
    2. Administrer 1000-2000 UI d’héparine par voie intraveineuse.
    3. Créer une incision le long de la ligne médiane de la cage thoracique et couvrant la longueur du diaphragme à l’aide d’un scalpel avec une lame #20.
    4. Avec la cage thoracique exposée, coupez les côtes juste à gauche de la ligne médiane à l’aide de coupe-côtes. Utilisez les rétracteurs Weitlaner pour exposer le cœur.
    5. Mettre en place la pompe avec un tube de sortie avec un diamètre intérieur de 1/8 pouce et une aiguille de 18G à l’extrémité. Précharger la ligne avec de la solution saline et avoir au moins 600 mL de sérum physiologique et de formol préparés dans des récipients distincts pour la perfusion.
    6. Insérez l’aiguille de 18 G connectée à la pompe dans le ventricule gauche par l’apex du cœur. Insérez une autre aiguille de 18 G (non attachée à quoi que ce soit) dans l’oreillette droite et laissez couler le sang dans la sous-ébauche de la table nécropsie.
    7. Utiliser une pompe de perfusion pour contrôler le débit d’environ 500 mL de sérum physiologique dans le cœur. Utiliser un réglage de pompe pour couler 110 mL/min.
    8. Une fois que le fluide provenant du cœur est dégagé, déplacez la tubulure du réservoir saline vers une solution contenant 10% de formol. Des contractions se produiront dans les quatre membres si la perfusion fonctionne correctement. Pomper environ 500 mL de solution de formaline dans le ventricule gauche.
    9. Éteignez la pompe et enlevez les aiguilles du cœur.
  3. Enlevez les deux membres postérieurs à la hanche en coupant autour de l’articulation de la hanche avec un scalpel avec #20 lame. Utilisez un petit coupeur de côtes pour enlever les membres. Utilisez le membre non ischémique comme un contrôle.
  4. Conserver les membres dans le formol pendant 24 h à 4 ° c, puis les stocker dans de l’éthanol à 70% à 4 ° c.
  5. Pour l’analyse histologique, prenez plusieurs biopsies des membres. Nous avons utilisé huit biopsies de 6 mm prises dans les régions à travers la cuisse et le veau dans les deux membres.
    NOTE: alors que la mesure de la pression artérielle de la cheville et l’angiographie sont les méthodes les plus couramment utilisées pour mesurer la récupération du flux sanguin, d’autres méthodes peuvent être utilisées pour suivre la récupération des animaux, y compris l’échographie Doppler, imagerie Doppler laser, infrarouge thermographie62, microsphère déterminée perfusion63,64, tomodensitométrie (CT) imagerie, et imagerie par résonance magnétique (IRM)65.

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Résultats

Après l’induction du diabète et l’initiation du régime de cholestérol à 0,1%, le taux de cholestérol total pour les lapins atteints de diabète et de régime de cholestérol était de 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 lapins mâles) en moyenne des points de temps et des lapins. Le taux de BGL pour ces lapins était de 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 lapins mâles). Un cours de temps pour les chimies sanguines et les ratios de pression artérielle des jambes chez un lapin typique est illustré à la figur...

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Discussion

Nous avons présenté un modèle préclinique pour induire l’ischémie des membres postérieurs chez les lapins atteints de diabète et d’hyperlipidémie. Dans de nombreuses études, il y a ambiguïté à la technique utilisée pour créer l’ischémie des membres postérieurs chez les lapins. Chez la souris, la sévérité et la récupération de l’ischémie des membres postérieurs dépendent fortement de l’emplacement de la ligature et de la technique utilisées pour induire l’ischémie. La signification de la technique présentée dans ce travai...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent avec gratitude le financement par l’entremise du programme de recherche dirigé par le ministère de la défense (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) à ABB et RS. Les auteurs reconnaissent également le financement par l’entremise de l’American Heart Association (17IRG33410888), du DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) et des instituts nationaux de santé (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) à ABB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % Chlorure de sodiumHenry Schein Medical1537468 / 1531434Sac de 250 mL / 1000 mL d’irrigation btl Seringue
mLVWRBD309628
Seringue de 10 mLVWRBD309695
10 % FormalinFisher-Scientific23-245684
Aiguille 18GVWR89219-294
Aiguille 20GVWR89219-340
Aiguille 25GVWR89219-290
Aiguille 27GVWR89219-288
Seringue 5 mLVWRBD309646
5 % DextrosePatterson Veterinary07-800-9689
AcépromazinePatterson VeterinaryVEDC207
AlfaxalonePatterson Veterinary07-891-6051
AlginateSigma-AldrichPHR1471-1G
Alloxan MonohydrateSigma-AldrichA7413
Équipement d’angiographieToshibaInfinix-i
Injecteur d’angiographieMedrad
Anti-souris Ab Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-11032Anticorps secondaire pour IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11008Anticorps secondaire pour IHC
a-SMA AnticorpsAbcamab5694Anticorps primaire pour IHC
Baytril BayerSanté animale 724089904201Enrofloxacine
Blood Chemistry PanelIDEXX2616Rabbit
Panel Brassard de tensiomètreWelchAllynFlexiport Jetable BP Cuff-nourrisson taille 7
TensiomètreVmed TechnologyVmed Vet-Dop2
BupivacaïneHenry Schein Medical6023287
BuprénorphinePatterson Vétérinaire42023017905
Buprénorphine SRZooPharm
Sulfate de calciumCB MinérauxAlimentaire et pharmaceutique USP et FCC
Gommage à la chlorhexidinePatterson Veterinary07-888-4598
ChloroformeFisher-ScientificC298-4
CholestérolSigma-AldrichC8503
DAPIThermo Fisher Scientific62248
Cathéter de veine auriculairePatterson VeterinarySR-OX165Surflo Cathéters IV
Tube endotrachéalPatterson VeterinarySheridan Brand, dépend de la taille du lapin
GlucomètreAmazonB001A67WH2Accu-Chek Aviva
Glucometer Strips PatchsMcKesson Medical-Surgical788222Accu-Chek Aviva Plus
GuidewireBoston Scientific39122-01
Tondeuses à cheveuxAmazonB000CQZI3QOster #40 lame
Coussin chauffantCincinnati Subzero273
Coussin chauffant PompeGaymarGaymar T/Pump
HemostatFine Science Tools13009-12Moustique incurvé Hemostat
HéparinePatterson Outil d’insertion vétérinaire
Merit Medical SystemsMAP550fil métallique outil d’insertion
InsulineHPB PharmacieNovalin R & Novalin N
Seringues à insulineMcKesson Médico-Chirurgical942674
IntroducteurCuisinier MédicalG289543F Check Flo Performer Introducteur
IsofluraneHenry Schein Medical1100734
KétaminePatterson Vétérinaire856440301
Lactate RingersMcKesson Médico-Chirurgical186662
LidocaïneMcKesson Médico-Chirurgical239936
Crème Lidocaïne/PrilocaïneMcKesson Médico-Chirurgical761240
LigaloopV. MuellerCH117 / CH116Blanc Mini / Jaune
Mini Mazola Huile de MaïsAmazonB0049IIVCI
Medrad SeringueMcKesson Médico-Chirurgical346920150 mL
MeloxicamPatterson Vétérinaire
Sutures à bille en métalEthicon-Johnson & JohnsonK891H4-0 soie C-1 30"
Metzenbaum CiseauxFine Science Tools14019-13
MidazolamHenry Schein Medical1215470
NitroglycérineMcKesson Médico-Chirurgical927528
PECAM AnticorpsNovus BiologicalsNB600-562Anticorps primaire pour
pompeà perfusion IHCMasterflex
Cathéter en queue de cochonMerit Medical Systems1310-21-00533F queue de cochon
Suture en polydioxanone (PDS II)McKesson Medical-Surgical129271cône 4-0 RB-1 (l’aiguille se pose sur la suture)
Polydioxanone (PDS II) sutureMcKesson Medical-Surgical1290314-0 coupe inversée FS-2
Polyglactin 910 (Vicryl) sutureButler7233-413-0 cône RB-1
Polyglactin 910 (Vicryl) sutureMcKesson1043734-0 coupe inversée FS-2
Rabbit Chow (Alfalfa)LabDiet5321
Rabbit RestrainerVWR10718-000
Coupe-côtesV. Mueller
ScalpelFine Science Tools10003-12
Lame de scalpelFine Science Tools10015-00#15 lame
Sutures en soieEthicon-Johnson & JohnsonA183H4-0 cravates en soie 18"
Stainless Steel BallMcMaster-Carr1598K23
Champs chirurgicauxGepco8204S
Pousse-seringueDRE VétérinaireVersaflow VF-300
Visipaque produit de contrasteMcKesson Médico-chirurgical509055
WeitlanerRetractor Fine Science Outils17012-13
1 de 3 mm de diamètre

Références

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