Différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines en cellules hépatiques

Résumé

Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.

Résumé

Le foie détoxifie les substances nocives, sécrète des protéines vitales et exécute des activités métaboliques clés, soutenant ainsi la vie. Par conséquent, l'insuffisance hépatique, qui peut être causée par une consommation chronique d'alcool, une hépatite, un empoisonnement aigu ou d'autres insultes, est une affection grave qui peut entraîner des saignements, une jaunisse, un coma et, éventuellement, la mort. Cependant, les approches pour traiter l'échec de foie, aussi bien que des études de la fonction et de la maladie de foie, ont été bloquées en partie par l'absence d'un approvisionnement abondant des cellules humaines de foie. À cette fin, ce protocole détaille la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en cellules hépatocytes, guidée par une feuille de route développementale qui décrit comment le destin du foie est spécifié à travers six étapes consécutives de différenciation. En manipulant les voies de signalisation développementale pour favoriser la différenciation du foie et pour supprimer explicitement la formation de destins cellulaires indésirables, cette méthode génère efficacement des populations d'ancêtres de bourgeons hépatiques humains et de cellules hépatocytes par les jours 6 et 18 de la différenciation de la CFP, respectivement. Ceci est réalisé par le contrôle temporel-précis des voies de signalisation développementale, exercé par de petites molécules et des facteurs de croissance dans un milieu de culture sans sérum. La différenciation dans ce système se produit dans les monocouches et donne des cellules hépatocyte-comme qui expriment les enzymes caractéristiques d'hépatocyte et ont la capacité d'engraft un modèle de souris de l'échec chronique de foie. La capacité de générer efficacement un grand nombre de cellules hépatiques humaines in vitro a des ramifications pour le traitement de l'insuffisance hépatique, pour le dépistage des médicaments, et pour les études mécanistes de la maladie du foie.

Introduction

Le but de ce protocole est de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en populations enrichies d'ancêtres de bourgeons hépatiques et de cellules hépatocytes². L'accès à un approvisionnement prêt des progéniteurs humains de foie et des cellules hépatocyte-comme accélérera des efforts pour étudier la fonction et la maladie hépatiques et pourrait permettre de nouvelles thérapies cellulaires de transplantation pour l'échec^{de foie 3,4, 5}. Cela s'est avéré difficile dans le passé depuis hPSCs (qui comprennent les cellule....

Protocole

1. Préparation des médias de différenciation

REMARQUE: Consultez le Tableau des matériaux pour obtenir de l'information sur les matériaux et les réactifs utilisés.

1. Préparation des supports de base définis chimiquement (MDP)
   REMARQUE : Les CDM2, CDM3, CDM4 et CDM5 sont des médias définis chimiquement qui sont utilisés comme supports de base pour différencier les hPSC des cellules hépatiques à divers stades. La composition de ces médias se trouve dans le tableau 1.
   1. Pour faire CDM2 ou CDM3, préparez une solution de stock contenant de l'alcool polyvinyle (....

Résultats

Après 24 h de différenciation APS, les colonies adopteront généralement une morphologie différente de celle des colonies indifférenciées concomitantes avec une perte de la frontière lumineuse qui circonscrit généralement les colonies de hPSC. Morphologiquement, les cellules primitives de strie ont généralement des frontières déchiquetées et sont plus écartées et moins compactes que hPSCs-ceci est évocateur d'une transition épithéliale-à-mesenchymal pendant que les cellules pluripotentes d.......

Discussion

Cette méthode permet la génération de populations enrichies d'ancêtres de bourgeons hépatiques, puis de cellules semblables à des hépatocytes, à partir de hPSC. La capacité de générer des populations enrichies de cellules hépatiques humaines est importante pour l'utilisation pratique de ces cellules. Les méthodes précédentes pour produire des hépatocytes à partir des hPSCont ont donné des populations impures de cellules contenant des cellules de foie et non-foie qui, sur la transplantation dans des rongeurs, ont produit .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; Geltrex	Thermofisher Scientific	A1569601
1:1 DMEM/F12	Gibco	11320033
0,2 &mu ; Filtre à membrane poreuse	Millipore	GTTP02500
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850
Thiazovivin	Tocris Bioscience	3845
; Accutase	gibco ou Millipore  ;	Gibco A11105, Millipore  ; SCR005
IMDM, GlutaMAX&trade ; Supplément	Thermofisher Scientific	31980030
de nutriments F-12 de Ham, GlutaMAX&trade ; Supplément	Thermofisher Scientific	31765035
KOSR, Remplacement de sérum Knockout	Thermofisher Scientific	10828028
Poly(alcool vinylique)	Sigma-Aldrich  ;   ;	P8136
Transferrin  ;	Sigma-Aldrich  ;   ;
concentré de lipides chimiquement défini	Thermofisher Scientific	11905031
Human Activin	R& D	338-AC
CHIR99201	Tocris	4423
PI103	Tocris	2930/1
Human FGF2	R& D	233-FB
DM3189	Tocris	6053/10
A83-01	Tocris	2939/10
Humain BMP4	R& D	314-BP
C59	Tocris	5148
TTNPB	Tocris	0761/10
Forskolin	Tocris	1099/10
Oncostatin M	R& D	295-OM
Dexaméthasone	Tocris	1126
Ro4929097	Selleck Chem	S1575
AA2P	Produits chimiques des îles Caïmans	16457
Insuline recombinante humaine	Sigma-Aldrich  ;   ;	Référence 11061-68-0

mélange 10652202001